Aus der Klinik für Geburtshilfe und Gynäkologie des Rindes (im Richard-Götze-Haus)
und
der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Wanderungsverhalten neutrophiler Granulozyten in einem Transmigrationsverfahren
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Jörg Heinrich Marstrand Frank aus Neuendettelsau
Hannover 2000
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. W. Leibold
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. W. Leibold 2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. med. vet. R. Mischke
Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2000
Diese Arbeit wurde mit finanzieller Unterstützung der H. Wilhelm Schaumann-Stiftung angefertigt.
Meinen Eltern in Liebe und Dankbarkeit
INHALTSVERZEICHNIS
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Abkürzungen und Termini technici
1 Einleitung und Zielsetzung der Arbeit 12
2 Literaturübersicht 13
2.1 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten 13
2.1.1 Aufgaben der neutrophilen Granulozyten im Rahmen der Infektions- Abwehr
13 2.1.2 Neutrophile Granulozyten und andere uterine Abwehrmechanismen 14
2.1.3 Endometritismodelle 14
2.2 Morphologische und phänotypische Eigenschaften von neutrophilen Granulozyten
15 2.3 Funktionelle Eigenschaften neutrophiler Granulozyten 17
2.3.1 Extravasation und Chemotaxis 17
2.3.2 Phagozytose 18
2.3.3 Bildung reaktiver Sauerstoffspezies 19
2.3.4 Zytotoxizität 20
2.4 Untersuchungsmethoden zur Migration von neutrophilen Granulo- Zyten
21
2.4.1 In vivo-Verfahren 21
2.4.2 In vitro-Verfahren 22
2.4.2.1 Slide-Cover-Slip-Methode 22
2.4.2.2 Kollagen-Gel-Methode 23
2.4.2.3 Under-Agarose-Assay 23
2.4.2.4 Boyden-Kammer 24
2.4.2.5 Modifikationen der Boyden-Kammer 24
2.5 Chemotaktische Substanzen 25
2.5.1 Einteilung der Chemoattraktoren 25
2.5.2 Interleukin-8 30
2.5.3 Komplementkomponenten 31
2.5.4 Leukotrien B4 32
2.5.5 N-Formyl-L-Methionyl-L-Leucyl-L-Phenylalanin 32
3 Material und Methoden 34
3.1.4 Materialien für die Separation, Differenzierung und Vitalitätsbe- stimmung von Zellen
39 3.1.5 Materialien für die indirekte Membranimmunfluoreszenz 40 3.1.6 Materialien für die Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies 40 3.1.7 Materialien für die Bestimmung der Phagozytosekapazität 41
3.1.8 Materialien für den Transmigrationstest 42
3.1.8.1 Präparation von chemotaktischen Substanzen 42
3.1.8.2 Bestandteile der Transmigrationskammer 43
3.1.8.3 Polycarbonatmembran 44
3.1.8.4 Feuchte Kammer 44
3.1.8.5 Reinigung der Transmigrationskammer 45
3.1.9 Materialien für die Durchflußzytometrie 45
3.1.10 Probanden 46
3.2 Methoden 46
3.2.1 Gewinnung und Isolierung von Leukozyten aus dem Blut 46
3.2.1.1 Blutentnahme 46
3.2.1.2 Isolierung der Leukozyten aus dem Blut 46
3.2.2 Durchflußzytometrie 48
3.2.3 Zellzahlbestimmung 49
3.2.4 Leukozytendifferenzierung 50
3.2.5 Vitalitätsbestimmung 52
3.2.6 Indirekte Membranimmunfluoreszenz 52
3.2.7 Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies 54
3.2.8 Bestimmung der Phagozytosekapazität 55
3.2.9 Transmigrationstest 56
3.2.10 Vitalfärbung von Leukozyten 58
3.2.11 Statistische Auswertung 59
4 Ergebnisse 61
4.1 Methodische Entwicklungsarbeiten zur Beurteilung der Migrations- fähigkeit boviner neutrophiler Granulozyten
61 4.1.1 Beeinflussung der Transmigration von bovinen neutrophilen
Granulozyten durch verschiedene chemotaktische Substanzen
61
4.1.1.1 Rekombinantes humanes Interleukin-8 62
4.1.1.2 Hefe-aktiviertes Serum 65
4.1.1.3 Leukotrien B4 67
4.1.1.4 N-Formyl-L-Methionyl-L-Leucyl-L-Phenylalanin 69 4.1.2 Minimierung der Adhärenz migrierter neutrophiler Granulozyten
mittels Percoll®
70
4.1.3 Migrationsdauer 72
4.1.4 Einfluß der Migrationszeit auf funktionelle und phänotypische Charakteristika boviner neutrophiler Granulozyten
74
4.1.5 Zellzahl 77
4.1.6 Mediumzusammensetzung 79
4.1.7 Varianzen des Meßverfahrens 83
4.1.7.2 Interassayvarianz 83 4.2 Modulation der Transmigration boviner neutrophiler Granulozyten 84 4.2.1 Beeinflussung der Transmigration boviner neutrophiler Granuloyzten
durch die Zusammensetzung der Ausgangszellsuspension
85 4.2.2 Modulation der Transmigration boviner neutrophiler Granulozyten
durch rekombinantes humanes Interleukin-8
88 4.2.3 Modulation der Transmigration boviner neutrophiler Granulozyten
durch fetales Kälberserum
90 4.2.4 Modulation der Transmigration boviner neutrophiler Granulozyten
durch Staphylococcus-aureus-Enterotoxin A
92 4.3 Separation boviner eosinophiler Granulozyten mit Hilfe der Trans-
Migrationskammer
94 4.4 Untersuchungen zur Migrationsdynamik neutrophiler Granulozyten
in der Transmigrationskammer
95 4.5 Einfluß der Transmigration auf phänotypische und funktionelle
Eigenschaften boviner neutrophiler Granulozyten
100 4.5.1 Einfluß der Transmigration auf phänotypische Charakteristika
boviner neutrophiler Granulozyten
100 4.5.2 Auswirkungen der Transmigration auf die Funktionalität boviner
neutrophiler Granulozyten
102 4.6 In vitro-Einfluß von rhIL-8 auf phänotypische und funktionelle
Charakteristika boviner Granulozyten
104 4.6.1 In vitro-Einfluß von rhIL-8 auf phänotypische Charakteristika
boviner neutrophiler Granulozyten
104 4.6.2 In vitro-Einfluß von rhIL-8 auf funktionelle Charakteristika boviner
neutrophiler Granulozyten
106 4.7 Untersuchungen zur Transmigration humaner, porciner und caniner
neutrophiler Granulozyten
109
4.7.1 Mensch 109
4.7.2 Schwein 111
4.7.3 Hund 112
5 Diskussion 114
5.1 Konzeptionelle Überlegungen zu Untersuchungen über den Einfluß der Migration auf die funktionelle Kapazität boviner neutrophiler Granulozyten
114 5.2 Erarbeitung einer Methode zur Beurteilung der Transmigration
neutrophiler Granulozyten
115 5.2.1 Auswahl eines methodischen Grundprinzips für die Etablierung eines 115
5.5 Auswirkungen der Transmigration auf phänotypische und funktionelle Charakteristika boviner neutrophiler Granulozyten
123
6 Zusammenfassung 127
7 Summary 129
8 Literaturverzeichnis 131
Abkürzungen und Termini technici
Abb. Abbildung
ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (Antikörper- abhängige zellvermittelte Zytotoxizität)
AF Ascitesflüssigkeit
AICC Antibody-independent cell-mediated cytotoxicity (Antikörper- unabhängige zellvermittelte Zytotoxizität)
BLAD bovine leucocyte adhesion deficiency (Leukozytenadhäsions- defizienz des Rindes)
Bo1, Bo116 Bezeichnung für Hybridomzellklone und die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper
BSA bovines Serumalbumin
C5a u. C3a aktivierte Fragmente der Komplementkompenten C5 und C3 CD cluster of differentiation (System zur Bezeichnung zellulärer
Differenzierungsantigene)
CFDA/SE Carboxyfluorescein-Diacetat/Succinimidyl-Ester
CR complement receptor (Komplementrezeptor)
51Cr radioaktives Isotop 51 von Chrom
cv coefficient of variation (Variationskoeffizient) dest. destillata (einfach destilliert)
DHR 123 Dihydrorhodamin 123
DMSO Dimethylsulfoxid
DTAF Dichlortriazinyl-Amino-Fluorescein DTAF-Zg? M-IgG+M
(H + L)
DTAF-Ziegen-Antikörper-anti-Maus-IgG und IgM (heavy and light chain – schwere und leichte Ketten)
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay (Enzym-gekoppelter Immunadsorptionstest)
ENA-78 epithelial-derived neutrophil attractant-78 (Chemokin)
Fa. Firma
FACScan fluorescence-activated cell scanner (Fluoreszenz-aktiviertes Zellanalysegerät, Durchflußzytometer)
Fc fragment cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil,
carboxyterminales Fragment von Immunglobulinen nach Papain- Spaltung)
FCS fetal calf serum (fetales Kälberserum)
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FL 1, 2, 3 Fluoreszenz (1 = grün, 2 = orange, 3 = rot)
FMLP N-Formyl-L-Methionyl-L-Leucyl-L-Phenylalanin
GM-CSF granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (Granulozyten- Makrophagen-Wachstumsfaktor)
Gro (? , ?, ?) growth-related oncogenes (?, ?, ?) (Chemokin)
HAcS Hefe-aktiviertes canines Serum
HAFCS Hefe-aktiviertes fetales Kälberserum
HAhS Hefe-aktiviertes humanes Serum
HAS Hefe-aktiviertes Serum
HETE Hydroxyeicosatetraensäure
HODE Hydroxyoctadecadienoic acid (Linolsäurederivate) ICAM Intercellular adhesion molecule (interzelluläres
Adhäsionsmolekül) IFN ?, ?, ? Interferon ? , ?, ?
I10F+ Iscove-Zellkulturmedium mit Zusatz von 10% fetalem Kälberserum und Antibiotika
IU international unit (Internationale Einheit)
Ig Immunglobulin(e)
IL-1, 2, usw. Interleukin-1, 2, usw.
IL-Á15, 16, usw. Bezeichnung für Hybridomzellklone und die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper
LAI leucocyte adhesion inhibitor (Synonym für IL-8) LFA1 Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen 1
LPS Lipopolysaccharide
LTA, B usw. Leukotrien A, B usw.
Ltn Lymphotactin (Chemokin)
Mac1 macrophage receptor 1 (Makrophagenantigen 1)
MAk Monoklonaler Antikörper
MCP-1, 2, usw. monocyte chemoattractant protein-1, 2, usw.
M-CSF macrophage-colony stimulating factor (Makrophagen- Wachstumsfaktor)
MDNCF monocyte derived neutrophil chemotactic factor (Synonym für IL-8)
MHC major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitäts- komplex)
MNC mononuclear cells (mononukleäre Zellen, umfassen Monozyten/Makrophagen und Lymphozyten)
MIF Membranimmunfluoreszenz
Min Minute
MIP monocyte inflammatory protein (Chemokin)
MLP Methionyl-Leucyl-Phenylalanin
MONAP monocyte derived neutrophil activating peptide (Synonym für IL-8)
MRNA messenger ribonucleic acid (Boten-Ribonukleinsäure)
MW Mittelwert
NADPH nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat
NAF-1 neutrophil activating factor-1 (Synonym für IL-8)
NAP-1 neutrophil attractant/activating protein-1 (Synonym für IL-8) PAF platelet activating factor (thrombozytenaktivierender Faktor)
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung)
PC Polycarbonat
PECAM platelet endothelial cell adhesion molecule
Pj Propidiumjodid
PMA Phorbol-Myristat-Acetat
PMN Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
PPD purified protein derivative of tuberculin (gereinigtes Proteinderivat des Tuberkulins)
PVP Polyvinylpyrrolidon
RANTES regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted (Chemokin)
rhIL-8 Rekombinantes humanes Interleukin-8
R0+/- Zellkulturmedium RPMI mit L-Glutamin, HEPES-Puffer und NaHCO3 mit (+) oder ohne (-) Zusatz von Antibiotika R10F+ Zellkulturmedium RPMI mit L-Glutamin, HEPES-Puffer,
NaHCO3 und 10% FCS-Zusatz mit Zusatz von Antibiotika ROS reactive oxygen species (reaktive Sauerstoffspezies)
35S radioaktives Isotop 35 von Schwefel
SD standard deviation (Standardabweichung)
SDF-1 stroma cell-derived factor-1 (Chemokin)
SEA Staphylococcus aureus-Enterotoxin A
75Se radioaktives Isotop 75 von Selen SSC side scatter (Seitwärtsstreulicht)
Tab. Tabelle
TCF T-cell chemotactic factor (Synonym für IL-8)
TNF-? tumor necrosis factor-?
Tridest. tridestillata (dreifach destilliert)
u.a. unter anderem
v/v percent „volume in volume“ (Volumenprozent) Well Vertiefung in der Mikrotiterplatte
ZÜ Zellkulturüberstand
1 Einleitung und Zielsetzung der Arbeit
Die Endometritis puerperalis des Rindes stellt eine aus tierärztlicher und wirtschaftlicher Sicht wichtige Erkrankung dar. Trotz jahrzehntelanger intensiver Forschung auf diesem Gebiet gibt es zu ihrer Pathogenese in der Literatur unterschiedliche Auffassungen (GRUNERT 1986). Sie gilt weiter als schwer therapierbar. Deshalb wird nach neuen Behandlungsansätzen für Prophylaxe und Therapie dieser Erkrankung gesucht, die auf die Steigerung der lokalen uterinen Abwehrmechanismen gerichtet sind. Neuerliche gesetzliche Einschränkungen der Medikation bei lebensmittelliefernden Tieren geben diesen Bestre- bungen zusätzlichen Auftrieb.
Eine Reihe von Forschungsergebnissen spricht für eine wichtige Rolle der polymorphkerni- gen neutrophilen Granulozyten (PMN) bei der sogenannten endometrialen Selbstreinigung.
Es gibt außerdem Hinweise, daß Störungen der PMN-Funktionalität für Erkrankungen im peripartalen Zeitraum des Rindes, u.a. für die Entstehung der Endometritis puerperalis, mitverantwortlich sind (HEUWIESER 1985). Die tatsächliche Bedeutung der PMN für die Pathogenese der Gebärmutterentzündung, PMN-modulierende Faktoren und Wechsel- wirkungen mit anderen Zellen der lokalen Immunabwehr sind nur ungenügend erforscht.
Bisherige Forschungsergebnisse haben zu keiner therapeutischen Konsequenz geführt.
Diese Dissertation ist Bestandteil eines Gesamtprojekts zur Endometritisforschung beim Rind. In vorausgegangenen Arbeiten waren ein in vivo-Endometritismodellsystem sowie Methoden zur Analyse der phänotypischen (Membranimmunfluoreszenz) und funktionellen (Phagozytose, Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, Zytotoxizität) Eigenschaften der Gra- nulozyten etabliert worden (ZERBE et al. 1996, SCHNEIDER 1997). Zur repräsentativen Beurteilung der Funktionalität neutrophiler Granulozyten soll in der vorliegenden Arbeit eine in vitro-Migrationsmethode für PMN erarbeitet werden.
Hauptaufgabe bisheriger Migrationsexperimente mit PMN war die Bestimmung der unge- richteten und gerichteten Wanderungskapazität der Zellen (BOYDEN 1962, NELSON et al.
1975). Im ersten Teil dieser Arbeit soll eine Technik entwickelt werden, die neben der Quan- tifizierung migrierter Zellen auch die vergleichende immunphänotypische sowie funktionelle Charakterisierung migrierter und nicht migrierter Zellen ermöglicht. Neben Auswahl oder Modifikation eines geeigneten Testprinzips ist eine – möglichst physiologische - Substanz ausfindig zu machen, die neutrophile Granulozyten effizient und selektiv zur Migration anregt. Im Zusammenspiel mit der chemoattraktiven Substanz sollen die zu erarbeitenden technischen Details und Kulturbedingungen die Gewinnung von migrierten PMN
ermöglichen, die eine hohe Vitalität aufweisen.
Für den zweiten Teil der Arbeit sind Experimente geplant, in denen unter Ausnutzung der erarbeiteten in vitro-Migrationstechnik Effekte der PMN-Wanderung auf die funktionelle Kapazität neutrophiler Granulozyten beobachtet werden sollen. Außerdem soll die Übertragbarkeit der Technik auf andere Spezies geprüft werden. Ziel des
Forschungsvorhabens ist also die Etablierung eines methodischen Instruments, das aussagekräftige in vitro-Studien zu migrationsbedingten Phänomenen neutrophiler Granulozyten ermöglicht und damit Teile der Tierexperimente im oben erwähnten
2 Literaturübersicht
2.1 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
2.1.1 Physiologie der Granulopoese und Aufgaben der neutrophilen Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr
Das Immunsystem stellt einen hochdifferenzierten und anpassungsfähigen Abwehrapparat dar, der den Organismus vor eindringenden Fremdpartikeln und anderen Noxen schützt. In der Regel toleriert dieses System dabei körpereigene oder „ungefährliche“ fremde Stoffe.
Man unterscheidet das entwicklungsgeschichtlich ältere angeborene unspezifische und das erworbene spezifische Immunsystem. Letzteres besteht zum einen aus der humoralen Abwehr durch von Plasmazellen gebildeten Antikörpern (Immunglobuline), die aufgrund ihrer hohen Spezifität Antigene erkennen und mit ihrer hypervariablen Region an die detektierten Strukturen (Epitope) binden. Neben diesen Eiweißmolekülen stellen T- und B- Lymphozyten den zellulären Anteil der spezifischen Abwehr dar. Diese Zellsysteme können hochspezifisch auf ihr jeweiliges Antigen reagieren und klonal expandieren, so daß eine sehr effektive Antwort sowie eine Gedächtnisreaktion möglich ist (BURMESTER u. PEZZUTTO 1998).
Neben den physikalischen Barrieren, wie z.B. dem Säuremantel der Haut und der intakten Epidermis sind bei der unspezifischen Immunabwehr das Komplementsystem, biozide Enzymsysteme, unspezifische Mediatoren und zelluläre Komponenten zu nennen, wobei neben dem Monozyten-Makrophagen-System hierbei die Granulozyten eine wichtige Rolle spielen. Letztere weisen beim Menschen (ZINK et al. 1990) und bei Ratten (ROITT et al.
1991) eine geringe Lebensdauer (2-3 Tage) auf. Ihnen kommt bei der akuten Entzündung in Kombination mit dem Komplementsystem und den spezifischen Antikörpern eine
dominierende Aufgabe bei der Abwehr von Mikroorganismen und Parasiten zu.
Die hämatopoetischen Wachstumsfaktoren, wie z.B. Granulozyten-Makrophagen-
Wachstumsfaktor (GM-CSF), Interleukin-3 (IL-3) und Granulozyten-Wachstumsfaktor (G- CSF) bewirken, daß aus Stammzellen über GM-CFU (granulocyte-macrophage colony forming unit) neutrophile Granulozyten entstehen (ROITT et al. 1991). Im bovinen Differentialblutbild, bei Leukozytenzahlen von 5,0–10,0 G/l, stellen die segmentkernigen neutrophilen Granulozyten neben den Lymphozyten (45-65%) die zweitstärkste
Leukozytensubpopulation mit 25-45% dar. In geringeren Anteilen treten bei gesunden Rindern eosinophile (1-10%), basophile (0-2%) und stabkernige neutrophile Granulozyten (0-3%) auf (HOFMANN 1992). Bakterielle Toxine, endogene Pyrogene, Zytokine und die aktivierten Komplementkomponenten C3 und C5 werden bei Entzündungsprozessen wirksam. Neben modulierenden Effekten auf PMN-Funktionen (STROM u. THOMSEN
leukozytären Immunantworten gegen eindringende Fremdorganismen dar und besitzen die Fähigkeit, diese abzutöten (s. 2.3).
Neben den direkten Interaktionen der PMN mit Fremdorganismen ist auch deren Freisetzung von Zytokinen ein wichtiger Beitrag zur Immunantwort. Nach LLOYD und OPPENHEIM (1992) werden PMN durch verschiedene Mediatoren (Lipopolysaccharide (LPS), IL-1, IL- 2), Tumornekrosefaktor (TNF) oder GM-CSF) zur Freisetzung von Zytokinen stimuliert.
Immunregulatorisch wird durch die aktivierten PMN über lösliche molekulare Botenstoffe auf andere PMN (u.a. IL-1, IL-6, IL-8, G-CSF u. GM-CSF, B-Zellen (IL-6), T-Zellen (IL-1, TNF u. IL-6) und auf das Monozyten-Makrophagen-System (IL-1, TNF, Makrophagen- Wachstumsfaktor (M-CSF) u. GM-CSF) Einfluß genommen.
2.1.2 Neutrophile Granulozyten und andere uterine Abwehrmechanismen Schon die physikalischen Barrieren, wie z.B. dicht aneinanderliegende Schamlippen, der
„Verschluß“ des Uterus durch den engen, gefältelten Zervixkanal mit einem zähen Schleimpfropf während der Trächtigkeit und im Interöstrus bilden einen gewissen Schutz gegen exogene Noxen. Hierbei ist auch der nach außen gerichtete Spüleffekt der von den Schleimhäuten abgegebenen Sekrete und die Uterusmotorik (AURICH u. GRUNERT 1996) zu berücksichtigen.
Kommt es primär durch endogene (u.a. Retentio secundinarum, Uterusatonie, mangelnder Schamschluß) oder exogene (z.B. Besamung, Bedeckung, Geburtshilfe) Faktoren zu einer bakteriellen Kontamination des Uterus, treten humorale (Immunglobuline und
Komplementfaktoren) und zelluläre Elemente des Immunsystems in Aktion. Allein die absolute Menge an PMN von 10000 Zellen/ml im Uterussekret von Kühen mit
katarrhalischer oder purulenter Endometritis und etwa 14000 Zellen/ml nach einer Nachgeburtsabnahme (BOITOR et al. 1976) macht deutlich, in welchem Ausmaß diese Leukozytensubpopulation an der lokalen Abwehrreaktion des Uterus beteiligt ist.
Untersuchungen von VANDEPLASSCHE et al. (1983) haben gezeigt, daß die Phagozytose durch PMN als primäre zelluläre Antwort auf mikrobielle Infektionen des Uterus zu sehen ist. Die Bedeutung dieser Leukozytensubpopulation wird auch dadurch deutlich, daß ihre Phagozytoseaktivität bei 100% lag, hingegen die der beteiligten Makrophagen nur bei 10%
(VANDERPLASSCHE u. BOUTERS 1983). Dabei waren die PMN den Makrophagen auch zahlenmäßig im Uterus deutlich überlegen. Beim funktionellen Vergleich zwischen bovinen PMN aus dem Uterus und dem Blut zeigte sich jedoch, daß die Phagozytosekapazität der neutrophilen Granulozyten aus dem Uterus verringert ist (HUSSAIN 1989, ZERBE et al.
1996).
2.1.3 Endometritismodelle
GRUNERT (1986) kam bei der Betrachtung der in Frage kommenden Krankheitsursachen der Endometritis puerperalis zum Ergebnis, daß dieser lokale entzündliche Prozeß zu den polyfaktoriellen Krankheiten gerechnet werden muß. Wie unter 2.1.2 erwähnt, stellen die PMN einen wichtigen Abwehrmechanismus bei den sogenannten uterinen
Selbstreinigungskräften (SCHULZ u. GRUNERT 1961) dar. Funktionsstörungen bei
neutrophilen Granulozyten könnten bei der Entstehung der Endometritis des Rindes eine Rolle spielen. Entsprechende Untersuchungen bei klinisch erkrankten Tieren im Puerperium sind schwer interpretierbar. In dieser Situation kommen für mögliche Effekte an den PMN eine Vielzahl von Einflußfaktoren in Frage: hormonelle Schwankungen, bakterielle
Kontaminationen der Lochia, Stoffwechselumstellungen, Geburtsstreß etc. Deshalb wurden in den letzten 15 Jahren wiederholt Endometritismodellsysteme eingesetzt, um PMN unter standardisierten Bedingungen aus gesunden Gebärmüttern zyklischer Rinder zu gewinnen.
In der Arzneimittelforschung fand diese Methodik Eingang. So wurden gesunden
Mutterschafen Bakteriensuspensionen mit Arcanobacterium pyogenes und Fusobacterium necrophorum in den Uterus gegeben und die chemotherapeutische Wirkung von Spiramycin analysiert (CESTER et al. 1996). Auch SQUIRES et al. (1992) nutzte diese Methode, um die Wirkung von Progesterongaben auf die Entwicklung einer experimentell mit Streptococcus zooepidemicus ausgelösten Endometritis bei der Stute zu untersuchen.
Viele Autoren verwendeten diese Modelle auch, um PMN in den Uterus zu locken. Hierbei wird eine konkrete chemotaktische Substanz in den Uterus gegeben, und nach einer
gewissen Zeit werden die in das Uteruslumen migrierten PMN durch Spülung gewonnen.
FRANK et al. (1983), ANDERSON et al. (1984), GILBERT et al. (1992) und SUBANDRIO und NOAKES (1992) untersuchten hierbei die intrauterine Wirkung von Austernglykogen auf die gerichtete Migration boviner PMN. Im direkten Vergleich zeigte sich, daß
bakterienfreier Kulturüberstand von Arcanbacterium pyogenes PMN effizienter in den Uterus lockt als Austernglykogen (SUBANDRIO u. NOAKES 1997). Als chemotaktischer Stimulus wurden auch Suspensionen abgetöteter Bakterien genutzt (z.B. Haemophilus somnus, BUTT 1991). KLUCINSKI et al. (1990) konnten zeigen, daß LPS PMN in den Uterus locken können. In der gleichen Untersuchung wurden auch Campylobacter fetus spp.
veneralis und Tuberkulin-PPD (gereinigtes Proteinderivat des Tuberkulins, Artus-Reaktion) intrauterin appliziert, was jeweils zu einem Influx boviner PMN in das Uteruslumen führte.
Hierbei ist die Charakterisierung der migrierten Zellen unter Umständen problematisch, da zum einen unphysiologische Substanzen (Austernglykogen) verwendet wurden. Außerdem machen die Autoren keine Aussagen über mögliche direkte Effekte der Stimuli auf die PMN, die die Ergebnisinterpretation relativieren würden. ZERBE et al. (1996) stellten deshalb diese Methoden in Frage und verwendeten einen hochpotenten körpereigenen
chemotaktischen Lockstoff – Leukotrien B4 (LTB4). Die dadurch in den Uterus gelockten PMN wurden morphologisch und funktionell charakterisiert und mit autologen Neutrophilen aus dem Blut verglichen. Ähnliche Untersuchungen führte ENGELKE et al. (1999) im Rahmen eines Endometritismodells bei der Stute durch, wobei er das Chemokin IL-8 (s.
2.5.2) als chemotaktischen Stimulus im Uterus nutzte. Beide Modellsysteme sind dadurch gekennzeichnet, daß durch begleitende in vitro-Experimente der direkte Einfluß der chemotaktischen Substanz auf andere Zellparameter evaluiert wurde.
Der neutrophile Metamyelozyt („jugendlicher“ Granulozyt) weist einen bohnen- oder nierenförmigen Zellkern mit grobscholligem Chromatin auf. Der daraus entstehende
stabkernige neutrophile Granulozyt ist unter physiologischen Bedingungen das erste Stadium im Blut. Die Kerngestalt ist hierbei verschmälert, C- oder S-förmig ohne erkennbare
Schnürfurchen und die Chromatinschollen sind noch gröber (Leopardenmuster). Nach weiterer Reifung ist das Chromatin dem des stabkernigen ähnlich, der Kern weist aber drei bis fünf mit fädigen Verbindungen aneinandergereihte Segmente auf (segmentkerniger neutrophiler Granulozyt). Beim Menschen wurden geschlechtsspezifische
Kernanhangsgebilde beobachtet („drumstick“, HECKNER u. FREUND 1994).
Neben diesen mikroskopischen Befunden lassen sich auch Oberflächenstrukturen auf Granulozyten nachweisen, die durch Erkennung von zellulären Strukturen, Boten- und Fremdstoffen eine wichtige Grundlage für die Funktion des Immunsystems darstellen. Das Beispiel BLAD (bovine leucocyte adhesion deficiency) zeigt, daß es aufgrund einer
Punktmutation zu einem Defekt des CD18-Oberflächenmoleküls kommt, und die u.a. durch dieses Oberflächenmolekül vermittelte Adhäsion an das Gefäßendothel und die
Extravasation der PMN (s. 2.3.1) stark eingeschränkt ist (OLCHOWY et al. 1994).
Eine internationale standardisierte Nomenklatur der Oberflächenstrukturen stellt das „Cluster of differentiation-System“ (CD) dar. Hierbei erfolgt die Klassifizierung der Antigene auf Zelloberflächen über monoklonale Antikörper (mAk), die eine Differenzierung von
Zellpopulationen und eine Bestimmung der Expression von Oberflächenstrukturen zulassen (ROITT et al. 1991, JANEWAY und TRAVERS 1997). Neben dieser Nomenklatur
existieren jedoch die ursprünglichen Bezeichnungen der Erstentdecker in der Literatur weiter. RÖNSCH (1992) teilt die Oberflächenstrukturen von Leukozyten in drei funktionelle Gruppen ein:
1) Antigenspezifische Rezeptoren
Hierbei handelt es sich um Strukturen des spezifischen Immunsystems mit
membranständigen Immunglobulinen bei B-Lymphozyten und den T-Zellrezeptor.
2) Transplantationsantigene („major histocompatibility complex“, MHC)
MHC-Klasse-I wird von allen kernhaltigen Zellen (außer Spermien) des Körpers exprimiert und präsentiert den T-Zellrezeptoren intrazelluläres Protein. Die T-Zellen erkennen dabei, ob es sich um körpereigenes oder –fremdes Eiweiß (Virus, Transplantat) handelt. MHC-Klasse-II von Lymphozyten und antigenpräsentierenden Zellen
(Makrophagen, Langerhans-Zellen etc.) präsentiert den T-Zellen extrazelluläre Proteinsequenzen.
3) Differenzierungsantigene (CD-Moleküle, s. oben)
Die Expression von Oberflächenmolekülen und deren Dichte auf der Zelloberfläche wird durch zelluläre Kontakte und humorale Faktoren reguliert. Die Aktivierung von
Granulozyten durch Mediatoren (Zytokine, Arachidonsäuremetaboliten,
Komplementfaktoren etc.) und die dadurch bedingte Hoch- oder Abregulierung der
Oberflächenmoleküle werden als aktivierungsassoziierte immunphänotypische Veränderung auf der Zelloberfläche bezeichnet (SMITH u. ANDERSON 1991, FELZMANN et al. 1994).
Mit Hilfe von fluorochromkonjugierten monoklonalen Antikörpern können diese Strukturen unter Verwendung von immunzytochemischen (ELISA, „enzyme-linked immunosorbent assay“), fluoreszenzmikroskopischen oder durchflußzytometrischen Methoden detektiert und beurteilt werden (GUIDRY et al. 1992, LOHMEYER et al. 1994, MAGYAR et al. 1995).
Migrationsbedingte Effekte auf die Expressionsdichte einiger Oberflächenstrukturen wurden u.a. von WORKU et al. (1994) beschrieben. Ihre in vitro und in vivo Untersuchungen
ergaben eine deutlich erhöhte Bindung von monoklonalen Antikörpern an Fc-Rezeptoren migrierter PMN. Diese migrationsbedingte Hochregulierung der Immunglobulinrezeptoren fanden auch SANDGREN et al. (1992) bei aus dem Euter gewonnenen PMN. Auch ZERBE et al. (1996) stellten im Vergleich zu PMN aus dem Blut höhere Expressionsdichten von Komplementrezeptor 3 und 4 und den von monoklonalen Antikörpern (mAk) IL-A110 und von IL-A130 erkannten Oberflächenstrukturen bei PMN aus dem Uterus fest. Eine
Verringerung der Expression konnte hierbei bei MHC-Klasse-I und bei CD11b aufgezeigt werden.
2.3 Funktionelle Eigenschaften neutrophiler Granulozyten 2.3.1 Extravasation und Chemotaxis
Die Wanderung von Leukozyten aus dem Blutgefäß heraus bezeichnet man als Extravasation (JANEWAY und TRAVERS 1997). Unter Chemotaxis versteht man die gerichtete
Bewegung von Zellen entlang eines Konzentrationsgradienten bestimmter chemoattraktiver Faktoren. Hiervon ist die Chemokinese abzugrenzen. Dabei handelt es sich um eine
verstärkte (ungerichtete) Migrationsaktivität von Zellen (ROITT et al. 1991).
Bei einer Infektion oder Entzündung werden chemoattraktive Mediatoren von lokalen Zellen oder in Form von bakteriellen Produkten (z.B. LPS) ins Gewebe abgeben, die u.a. PMN aus dem Kapillarsystem ins betreffende Gebiet locken. Im Einzugsgebiet dieser Mediatoren wird die Geschwindigkeit der PMN im Blutstrom bei der Annäherung an das Endothel
(Margination) durch reversible Adhäsionen mit Oberflächenstrukturen von stimulierten Endothelzellen abgebremst. Bei dieser Abbremsung „rollen“ die PMN aufgrund reversibler Anheftungen an der Epithelwand entlang („rolling“). Nach JANEWAY und TRAVERS (1997) wird dieser Vorgang dabei durch LTB4, C5a und Histamin aktivierte P-Selektine ausgelöst, die in Granula von Epithelzellen (Weibel-Palade-Körperchen) enthalten sind.
NORMAN et al. (1995) haben bei humanen PMN in vitro gezeigt, daß besonders der P- Selektin Ligand-1 am „rolling“ beteiligt ist. Die Expression von P-Selektinen läuft innerhalb weniger Minuten ab, wohingegen die auch beteiligten E-Selektine erst Stunden nach der Interaktion mit TNF-? oder LPS aktiv werden. Die Selektine erkennen Kohlenhydratepitope bestimmter Glykoproteine auf Leukozyten (JANEWAY und TRAVERS 1997). Nachdem die Leukozyten durch das „rolling“ an Geschwindigkeit verloren haben, kommt es zur
wiederum durch die Leukozytenintegrine und durch das immunglobulinähnliche Molekül PECAM (platelet endotehlial cell adhesion molecule, CD31) vermittelt. Letzteres wird sowohl von Endothelzellen als auch durch Leukozyten exprimiert (JANEWAY und TRAVERS 1997). Elektronenmikroskopische Untersuchungen von BURNS et al. (1997) zeigten, daß die Diapedese humaner PMN in vitro bevorzugt zwischen den Kontaktstellen von drei Endothelzellen („tricellular corners“) stattfindet. Tight junctions (zona occludens) scheinen hierbei eine geringere Rolle zu spielen. Auch HARMON et al. (1982) konnten keine Transmigration boviner PMN durch diese Komplexe beobachten. Die Basalmembran wird durch proteolytische Enzyme der Leukozyten für diese passierbar (JANEWAY u.
TRAVERS 1997).
Im Gewebe reagieren die neutrophilen Granulozyten auf chemotaktische Botenstoffe (s. 2.5).
Hierbei kommt es zu einer Bindung des Mediators mit einem heptahelikalen, G-Protein gekoppelten Leukozytenoberflächenrezeptor für Chemoattraktoren. Über das G-Protein wird abhängig vom Mediator eine spezielle Enzymkaskade aktiviert, die ihrerseits eine
stimulierende Wirkung auf die Migration, Adhärenz oder Loslösung der Zelle sowie die Verformung des Zytoskeletts der Leukozyten besitzt (BOKOCH 1995).
2.3.2 Phagozytose
Nachdem die PMN aufgrund chemotaktischer Reize in das Entzündungsgebiet gelangt sind, stehen ihnen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung, Noxen zu eliminieren. Hierbei ist die Phagozytose von eingedrungenen Mikroorganismen eine sehr relevante Funktion. Die Phagozytose wird durch die Opsonierung der Fremdpartikel mit Komplementfaktoren (z.B.
C3b) oder Immunglobulinen und entsprechende spezifische Rezeptoren potenziert (KLEIN 1991, ROITT et al. 1991).
Bereits beim Kontakt mit dem Fremdpartikel kommt es aufgrund von rezeptorbedingten Membranveränderungen der Phagozyten zur kaskadenartigen Aktivierung biochemischer Reaktionswege (z.B. „respiratory burst“, Arachidonsäurekaskade). Die dadurch freigesetzten Reaktionsprodukte (u.a. reaktive Sauerstoffspezies (s. 2.3.3), Arachidonsäuremetaboliten) führen zur Beeinflussung des Entzündungsprozesses im umliegenden Gewebe (GEMSA et al. 1991, KLEIN 1991). Nach der Anlagerung werden die Fremdpartikel von Pseudopodien zuerst becherartig umschlossen und dann in Form von Phagosomen von der Zelle
aufgenommen. Hierbei können die Phagozyten mehrere Partikel gleichzeitig und auch größere Phagozytoseobjekte (Durchmesser = 1 µm) aufnehmen (DONNELLY et al. 1987, KLEIN 1991). Schließlich verschmelzen Lysosome mit dem Phagosom, wodurch das
sogenannte Phagolysosom oder „phagozytische Lysosom“ entsteht. Die Lysosome werden in primäre Granula und sekundäre Granula unterteilt. Die primären Granula enthalten u.a.
mikrobizide Enzyme wie Lysozym, Myeloperoxidasen, Proteinasen, wohingegen
Lactoferrin, Kollagenasen und andere bakterizide Agenzien in den sekundären Vesikeln zu finden sind (ROITT et al. 1991, GEMSA et al. 1991, KLEIN 1991, LONNERDAL u. IYER 1995). Die genannten mikrobiziden Substanzen und Enzyme der Lysosome sowie eine Ansäuerung des Phagosomeninhaltes durch die Degranulation führen in der Regel zur Abtötung des phagozytierten Mikroorganismus. Unverdauliche Reste werden entweder durch Exozytose abgegeben oder im Phagozyten akkumuliert, was allerdings zum dosisabhängigen Absterben der Zelle führen kann (KLEIN 1991). Die exozytotisch abgegebenen Reste und unvollständig verdauten Mikroorganismen sowie leukozytäre
auch eosinophile Granulozyten, Monozyten und Makrophagen zu diesen „Freßzellen“, wobei den ersteren aufgrund ihrer zahlenmäßigen Dominanz am Entzündungsort eine vorrangige Rolle eingeräumt werden muß. Auch ihre Phagozytoseeffizienz ist im Vergleich zu eosinophilen Granulozyten und Makrophagen höher (SAAD u. HAGELTORN 1985, KLEIN 1991).
Die Phagozytosekapazität als wichtiger funktionaler Parameter der PMN wird meist in vitro auf der Basis verschiedener Prinzipien untersucht. Je nach Detektionsverfahren (u.a. Licht- u. Fluoreszenzmikroskopie, Szintillationszählung, Radiophagozytosetest,
Durchflußzytometrie) werden unterschiedliche zu phagozytierende Partikel eingesetzt.
Neben Mikroorganismen wie z.B. Hefezellen (GUIDRY et al. 1974, REIFENBERG et al.
1990, MARTIN u. BHAKDI 1991, HIGUCHI et al. 1997), Staphylococcus aureus (SAAD u. HAGELTORN 1985, ZERBE et al. 1996, SMITS et al. 1997 u. 1999, DOSOGNE 1999) werden synthetische Partikel, wie z.B. Polystyrene- (OGLE et al. 1988, CANTINIEAUX et al. 1989) oder Latex-Mikrosphären (FOERSTER u. WOLF 1990) in markierter oder
unmarkierter Form eingesetzt. Zur Markierung dienen Radioisotope (PAAPE et al. 1975, SOLIMAN 1982) oder Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B. Propidiumjodid (ZERBE et al. 1996, SMITS et al. 1997), Fluoresceinisothiocyanat (SAAD u. HAGELTORN 1985) oder
Carboxyfluorescein (MARTIN u. BHAKDI 1991).
Bei der Messung der Phagozytosekapazität boviner PMN zeigten sich Unterschiede, wenn Zellen aus dem Blut oder extravaskulär isoliert worden waren. SAAD (1987) zeigte, daß der Anteil phagozytierender Zellen im Euter geringer ist als im Blut, wohingegen die
Phagozytosekapazität pro Zelle bei den PMN aus dem Euter höher ist (SANDGREN et al.
1992). SMITS (1999) zeigte bei in vitro-Versuchen mit Milchdrüsenepithel, daß die Diapedese zu einer Reduzierung der Phagozytoseleistung führt. Für diese in vitro-Befunde sprechen auch die Ergebnisse von ZERBE et al. (1996), die eine Reduzierung der
Phagozytosekapazität bei PMN aus dem Uterus im Vergleich zu den zeitgleich aus dem Blut gewonnenen aufzeigten.
2.3.3 Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
Die PMN besitzen verschiedene Mechanismen zur Abtötung von aufgenommenen Mikroorganismen. Im Rahmen der Phagozytose werden antimikrobielle Proteine (u.a.
Defensine), Enzyme (z.B. Lysozym), Kompetitoren (z.B. Laktoferrin), Stickstoffoxide (NO) und Sauerstoffmetaboliten (H2O2, O2- etc.) im Phagosom zur Abtötung von
Mikroorganismen wirksam. Die Abgabe der letztgenannten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erfolgt nach entsprechender Stimulation in einer explosionsartigen Kaskade, dem sogenannten „respiratory burst“ (auch „metabolic burst“, „oxidative burst“), bei dem u.a.
auch NO freigesetzt wird. Neben PMN können mit geringerer Kapazität auch eosinophile
Hydroxyradikale, Peroxid-Anionen (jeweils hochreaktive Radikale), atomaren oder Singulet- Sauerstoff (potentes Oxidationsmittel) sowie in Wasserstoffperoxid (H2O2) überführt. Dies führt durch das Zusammenspiel mit Peroxidasen und Halogeniden zur Bildung stark bakterizider Substanzen, die wie auch die oben genannten Produkte des O2-
von großer Bedeutung für die unspezifische Infektabwehr sind (ROITT et al. 1991, KLEIN 1991, MÜLLER 1992). Im nicht aktivierten Zustand verbrauchen PMN nur geringe Mengen an Sauerstoff. Wird die Zelle während der Phagozytose aktiviert, kommt es zur Steigerung der Myeloperoxidaseaktivität in den Granula und Aktivierung der membranständigen NADPH- Oxidase. Die Steigerung des Sauerstoffverbrauchs ist also mit einer Erhöhung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies gekoppelt (KLEIN 1991).
Die respiratorische Entladung kann aber auch unabhängig von der Phagozytose durch andere Wechselwirkungen der Zelle mit Stimulanzien ausgelöst werden. Dabei wäre die
Aktivierung durch Bindung von aggregierten Antikörpern mit dem Fc?-Rezeptor der PMN (JANEWAY u. TRAVERS 1997), die Wechselwirkungen zwischen den
Komplementrezeptoren (z.B. CR3 und CR4) der PMN mit Komplementkomponenten sowie mit komplementopsonierten Bakterien zu nennen. Auch die Erkennung von
Adhäsionsmolekülen anderer Zellen durch entsprechende Rezeptoren der PMN (z.B.
CD11b/CD18 durch CR3) kann zu einer Freisetzung von ROS führen (WECKER 1990, GOODMAN et al. 1995, RUIZ et al. 1995). Untersuchungen zeigten, daß Chemokine nicht nur als Lockstoffe dienen, sondern auch die Abwehrkapazität der PMN bei der Migration steigern. Speziell IL-8 in Kombination mit TNF-? führt zur Aktivierung des „respiratory burst“ und somit zur Freisetzung von Sauerstoffradikalen und Stickstoffoxiden (JANEWAY u. TRAVERS 1997).
Wurde für die ROS-Bestimmung in älteren Untersuchungen v.a. die Messung der
Lichtemission über Photonenverstärker (Luminometer, Flüssigkeitsszintillationsmeßgerät) oder Oxidationsreaktionen photometrisch dargestellt, so kommen zur Zeit überwiegend durchflußzytometrische Meßverfahren zur Anwendung (MÜLLER-PEDDINGHAUS 1987).
EMMENDÖRFER et al. (1990) entwickelten eine Methode, bei der der Gehalt an Wasserstoffperoxid in einer Zellsuspension als Maß für die ROS-Bildung mittels einer Myeloperoxidase-abhängigen Oxidation von Dihydrorhodamin 123 zu Rhodamin 123 durchflußzytometrisch erfaßt wird. ZERBE (1994) etablierte diese Methode für bovine PMN, wobei er bei seinen vergleichenden Untersuchungen zwischen PMN aus dem Blut und aus dem Uterus keine signifikanten Unterschiede in der ROS-Bildungskapazität feststellen konnte. SALGAR et al. (1991) berichteten von einer schwächeren ROS-Bildungskapazität bei aus dem Euter gewonnenen PMN. Die in vitro-Untersuchungen mit PMN nach einer Diapedese zeigten ebenfalls eine Reduzierung der ROS-Kapazität (SMITS et al. 1999).
Dagegen zeigten Experimente mit PMN aus dem Euter, daß deren Enzyme für die ROS- Bildung (Myeloperoxidase, NADPH-Oxidase) eine höhere Aktivität besitzen als die von aus dem Blut gewonnenen PMN (SANDGREN et al. 1992).
2.3.4 Zytotoxizität
Unter der „zellvermittelten Zytotoxizität“ versteht man die Zerstörung von sogenannten Zielzellen (u.a. körperfremde Zellen, Tumorzellen, Virus-transformierte Zellen) durch
eosinophile Granulozyten und Makrophagen zytoplasmatische Granula mit einer Vielzahl zytolytischer Enzyme, die bei extrazellulärer Ausschüttung einen zytotoxischen Effekt bewirken (ROITT et al. 1991). Hierbei unterscheidet man die ADCC (Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität) und die AICC (Antikörper-unabhängige zellvermittelte
Zytotoxizität).
In vitro-Messungen der Zytotoxizität erfolgten über einfache Vitalitätstest mit Trypanblau oder über Messung der von Zielzellen freigesetzten radioaktiven Isotope (z.B. 51Cr, 35S oder
75Se, HEYMER u. LEIBOLD 1993). SCHNEIDER (1997) etablierte in dieser Arbeitsgruppe einen nicht radioaktiven, durchflußzytometrisch meßbaren Zytotoxizitätstest. Hierbei
wurden aktivierte PMN mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten Zielzellen konfrontiert. Nach der Inkubation wurde gemessen, wie viele der fluoreszierenden Zielzellen sich bei der durchflußzytometrischen Messung als tot (Propidiumjodid-positiv, s. 3.1.9) darstellten.
Dieses Testverfahren wurde in dieser Arbeit nicht eingesetzt.
2.4 Untersuchungsmethoden zur Migration von neutrophilen Granulozyten Für Experimente zur Zellmigration gibt es zwei motivierende Grundfragestellungen:
1) Ist eine definierte Substanz chemoattraktiv für eine bestimmte Zellart?
2) Ist eine bestimmte Zelle unter bestimmten Bedingungen migrationsfähig?
Nach WILKINSON (1998) wurden die ersten Beschreibungen über eine gerichtete Migration von Leukozyten von Leber und Metschnikoff im Jahre 1888 veröffentlicht.
Letzerer erkannte schon damals, daß die Chemotaxis von Leukozyten eine wichtige Komponente bei der Reaktion des Organismus auf einen Entzündungsreiz ist.
Da im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein neues methodisches Verfahren zur Untersuchung von migrationsbedingten Effekten bei PMN erarbeitet wurde, soll im folgenden ausführlich auf Testverfahren zur Zellmigration eingegangen werden.
2.4.1 In vivo-Verfahren
Wie unter 2.1.3 beschrieben, nutzen viele Autoren in vivo-Modelle, um migrierte
Leukozyten aus dem Uterus zu gewinnen. Neben der Endometritis ist auch die Mastitis aus tierärztlicher und wirtschaftlicher Sicht ein wichtiges Forschungsgebiet. Die Funktionalität der Leukozyten und besonders die der PMN ist daher von wissenschaftlichem Interesse.
NICKERSON und PANKEY (1984) untersuchten deshalb licht- und
elektronenmikroskopisch die Extravasation und Migration der PMN im Euterparenchym nach einer Infektion mit Staphylococcus aureus. PERSSON et al. (1988) etablierten ein Zitzen-Zisternen-Modell, indem sie zu untersuchende potentiell chemoattraktive Substanzen
Infektion des Euters mit Escherichia coli zeigte sich trotz hoher Vermehrungsrate der Bakterien erst nach 12 Stunden (SHUSTER et al. 1997).
FURUTA et al. (1989) beobachteten nach einer intraperitonealen Injektion von humanem IL-8 eine gesteigerte Konzentration zirkulierender PMN im Blut und darauffolgend einen Anstieg an PMN innerhalb der Bauchhöhle von Mäusen. Bei Ratten und Kaninchen wurde nach intradermaler Injektion von IL-8 (s. 2.5.2) eine gesteigerte Extravasation und Migration von PMN in entsprechenden Bioptaten beobachtet (COLDITZ et al. 1989, ZWAHLEN et al.
1993). BOYDEN (1962, s. 2.4.2.4) injizierte Austernglykogen intraperitoneal bei Kaninchen und gewann nach 3 ½ Stunden das Exsudat, das eine fast reine PMN-Suspension (98%) enthielt.
2.4.2 In vitro-Verfahren
Bei den in vitro-Untersuchungen zur Migration von Leukozyten können drei grundsätzliche Verfahrensweisen unterschieden werden:
1) Direkte Beobachtung der Leukozyten während der Migration (z.B. slide-cover-slip- Methode)
2) Fixierung der migrierten Leukozyten und Messung des Wanderstrecke (z.B. Boyden- Kammer und Under-Agarose-Assay)
3) Gewinnung der migrierten Leukozyten und Bestimmung der Migrationsrate u.a. durch Zellzählung (z.B. bei einigen modifizierten Boyden-Kammer-Techniken)
Im folgenden sind die wichtigsten in vitro-Methoden dargestellt.
2.4.2.1 Slide-cover-slip-Methode
Nach BIGNOLD (1988) wurde diese Methode schon in der ersten Hälfte des 20.
Jahrhunderts zum Nachweis der Migration von Leukozyten herangezogen. Beispielsweise wurde schon 1917 (COMANDON) die Migration von Zellen in Blut auf einem Objektträger zu Plasmodien-haltigen Erythrozyten mit Hilfe wiederholter Aufnahmen kinematographisch festgehalten.
ZIGMOND und HIRSCH (1973) gehörten zu den ersten Forschern, die das
Migrationsverhalten von neutrophilen Granulozyten in künstlichen Medien ohne andere Blutkomponenten direkt mit dem Mikroskop untersuchten. Auf einen Objektträger wurden Streifen proteinhaltiger Lösungen (z.B. aggregiertes ?-Globulin) aufgetragen. Nachdem diese Lösung angetrocknet war, gab man einen Tropfen Zellsuspension (etwa 4 µl) darauf. Auf diesen Tropfen wurde vorsichtig ein Deckgläschen gelegt. Der Raum zwischen
Deckgläschen und Objektträger betrug nach Angaben der Autoren etwa 10 µm, was zum einen den Leukozyten Bewegungsfreiheit gibt und zum anderen eine mikroskopische Phasenkontrastuntersuchung zuläßt. Aufgrund von morphologischen Verformungen der Zellen („shape-change“) wurde die Migration und auch deren Richtung beurteilt. In Bewegungsrichtung zeigten die Zellen eine breite, „fließende“ Hülle (broad smooth veil,
„lamelli-podium“), wobei sich der hintere Teil der Zelle zu einem „buckelartigen Schwanz“
zusammenzieht.
Ein Vorteil dieser Methode ist, daß die Leukozyten zu oder von der zu untersuchenden Substanz weg wandern können. Außerdem zeigen sich die morphologischen Veränderungen des Zytoskeletts schon innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums. Diese Methode wurde auch zur funktionellen Charakterisierung boviner PMN (CZUPRYNSKI et al. 1991) eingesetzt.
Ein Nachteil der Methodik ist, daß ihr zweidimensionaler Aufbau der natürlichen dreidimensionalen Situation im Gewebe nicht nahe kommt. Mit der Einführung von Kollagen in diesem Versuchsaufbau wurde dieser Überlegung Rechnung getragen.
2.4.2.2 Kollagen-Gel-Methode
BROWN (1982), GRINNEL (1982) und ISLAM et al. (1985) untersuchten das
Migrationsverhalten von PMN in Kollagen-Gel-Präparationen. BROWN (1982) modifizierte dabei die slide-cover-slip-Methode, indem er unter das Deckglas zusätzlich Kollagen gab.
Damit wurde ein dreidimensionales Migrationsgebiet geschaffen. Mit Hilfe von
wiederholten mikroskopischen Aufnahmen (x 1250) wurde das Migrationsverhalten von PMN in der Kollagenmatrix aufgezeichnet. Demnach besitzen PMN die Möglichkeit, Teile ihres Zytoskeletts so umzuformen, daß sie Pseudopodien in Migrationsrichtung ausstülpen können. Scheinbar wird der restliche Zellkörper nachgezogen, nachdem der Pseudopod im Kollagen Halt gefunden hat. Somit entsteht eine Vorwärtsbewegung.
ISLAM et al. (1985) gaben FMLP-haltige (N-Formyl-L-Methionyl-L-Leucyl-L-
Phenylalanin, s. 2.5.5) Kollagenlösungen in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte und überschichteten diese mit einer Kollagenlösung ohne FMLP. Dadurch konnte sich ein chemotaktischer Gradient in der zweiten Kollagenschicht aufbauen. Nach 20 bis 60 Minuten wurden humane PMN hinzugegeben. Nach unterschiedlichen Inkubationszeiten wurden die migrierten PMN mit Glutaraldehyd im Kollagen fixiert und die Eindringtiefe der PMN in das Kollagen und somit deren Wanderungsstrecke gemessen. Eine weitere Methode zur Messung der Migrationsstrecke ist der Under-Agarose-Assay.
2.4.2.3 Under-Agarose-Assay
Die Methode wurde von CUTLERund MUNOZ (1974) für PMN von Meerschweinchen entwickelt und von NELSON et al. (1975) im Humanbereich etabliert. Wie die „slide-cover- slip“-Methode besitzt sie den Vorteil, daß die Zellen sowohl zu der zu untersuchenden Substanz, als auch von ihr weg migrieren können. Erhitzte Agarose (D-Galaktose und 3,6 Anhydro-l-Galaktose) wird mit Aqua. dest., Salzen und Serum vermischt und in eine
Inkubation werden die Zellen mit einer Glutaraldehyd-Lösung fixiert, der Agar entfernt und die Zellen nach Antrocknung am Boden der Petrischale gefärbt (NELSON et al. 1975). Die Wanderungsstrecke, also der Abstand zwischen den migrierten PMN und dem mittleren Loch, kann mikroskopisch gemessen werden. Hierbei ergibt sich die Möglichkeit, innerhalb des gleichen Experiments die chemokinetische (ungerichtete radiäre Migration) von der chemotaktischen Wirkung (kometenschweifartige Verteilung der Zellen in Richtung Stimulus) abzuziehen.
Ein Problem dieser Methode stellt der Zeitaufwand dar, denn zwischen Herstellung der Agarose-Platten, seiner Einsetzbarkeit im Test und der Auswertung der Migration vergehen mehrere Tage.
2.4.2.4 Boyden-Kammer
Die von BOYDEN (1962) entwickelte Methode basiert auf einer Plexiglaskammer, bei der zwei Kompartimente durch eine Zellulose-Ester-Membran getrennt wurden. Der Autor machte keine genaueren Angaben über die Membran, nach BIGNOLD (1987) ist sie etwa 150 µm dick und hat einen Porendurchmesser von 3 µm. Unter dieser membranösen Barriere befindet sich die zu untersuchende chemoattraktive Substanz, darüber im zweiten
Kammerbereich die Zellsuspension. Nach einer dreistündigen Inkubation werden die Flüssigkeiten entfernt, die Filteroberflächen abgewaschen und der Filter und die darin befindlichen Zellen fixiert und gefärbt. Mit Hilfe des Lösungsmittels Xylol wird die
Zellulose für die mikroskopische Untersuchung „transparent“ gemacht. Die Eindringtiefe der PMN in den Filter (= Wanderungsstrecke) wurde bisher mit einer speziellen
Zusatzeinrichtung für das Mikroskop gemessen. Heute kann die Verteilung der Leukozyten in den einzelnen Schichten des Filters elektronisch bestimmt werden (WÖRNER u.
HÄNSCH 1993). Eine Störung in der chemotaktischen Aktivität liegt dann vor, wenn sowohl die Eindringtiefe, als auch der chemotaktische Index nicht im Normbereich sind.
Hierbei wird der Quotient aus der Anzahl migrierter Zellen bei chemotaktischer Stimulation dividiert durch die Anzahl migrierter Zellen bei der Negativkontrolle (Medium ohne
Chemotaktikum, COLIGAN et al. 1995). Hierbei ist anzumerken, daß der chemotaktische Index von verschiedenen Arbeitsgruppen abhängig von ihrer Methode unterschiedlich definiert und berechnet wurde.
2.4.2.5 Modifikationen der Boyden-Kammer
NAIDU und NEWBOULD (1974) konnten in ihrem Versuchsaufbau nachweisen, daß auf Grund eines chemotaktischen Stimulus (LPS-aktiviertes Serum) bovine Leukozyten zeitabhängig nicht nur in die Zellulose-Filter-Membran eindringen, sondern diese auch durchqueren und in der chemotaktischen Substanz wiedergewonnen werden können.
Bezogen auf die insgesamt eingesetzte Zellmenge wurde der prozentuale Anteil der durch die Membran gewanderten Zellen berechnet (etwa 7,2%). Diesen Prozentsatz definierten sie als ihren chemotaktischen Index. Gleichzeitig zählten sie wie BOYDEN (1962, s. 2.4.2.4) mikroskopisch die Leukozyten in drei bestimmten Schichten der Membran. Dabei konnten sie aufzeigen, daß ihr chemotaktischer Index eine geringere Intraassayvarianz aufweist als die Boyden-Technik.
HORWITZ u. GARETT (1971), BIGNOLD (1987) und andere nutzten anstelle der breiten Zellulose-Ester-Membran eine etwa 10 µm starke Polycarbonatmembran mit Poren
(Durchmesser 3 µm). Die migrierten Zellen konnten fixiert, gefärbt und direkt gezählt werden. Daneben änderten sich auch die Formen der Kammer. FALK et al. (1980) nutzten z.B. anstelle einer Boyden-Kammer eine 24 oder 48-well-Mikro-Chemotaxiskammer.
Eine weitere Modifikation des Prinzips der Boyden-Kammer stellen mit Zell-Monolayer beschichtete Membranen dar. JAFFE et al. (1973) kultivierten humane Endothelzellen aus Nabelstrangvenen und konnten zeigen, daß diese Zellen in der Wachstumsphase Monolayer bilden. Außerdem enthielten diese kultivierten Endothelzellen zytoplasmatische Einschlüsse, die Weibel-Palade-Körperchen. Deren Inhalt, die P-Selektine, spielen eine wichtige Rolle beim „rolling“ (s. 2.3.1). Dies deutet daraufhin, daß zumindest einige zelluläre Funktionen des Endothels in vivo auch durch diese kultivierten Zellen in vitro demonstriert werden können. In einem solchen Modell werden die Leukozyten und die chemotaktische Substanz nicht nur durch eine poröse Membran, sondern zusätzlich durch eine geschlossene
Zellschicht voneinander getrennt. Als Monolayer wurden Endothel- (z.B. BEESLEY et al.
1981, TAYLOR et al. 1981) oder Epithelzellen (CRAMER et al. 1980) verwendet. Mit dieser Methodik ergibt sich die Möglichkeit, zelluläre Interaktionen bei der Migration in vitro genauer zu erforschen. ISSEKUTZ et al. (1995) konnten Ergebnisse präsentieren, die vermuten lassen, daß es unter bestimmten Umständen (Zytokin-aktiviertes Endothel und C5a als Chemotaktikum) einen CD18-unabhängigen transendothelialen Migrationsmechanismus für humane PMN gibt. TAYLOR et al. (1981) verglichen dabei das Migrationsverhalten von PMN, die durch eine Membran und eine mit Endothel beschichtete Membran gewandert waren.
Diese Technik fand auch bei Chemotaxistests mit bovinen PMN Eingang. BOCHSLER et al.
(1994) kultivierten für ihren Transendothelial-Migrationstest in Transwell-Einsätzen mit Polycarbonatmembranen (Porendurchmesser 3 µm) bovine Aorta-Endothelzellen.
Chemotaktische Reize (u.a. rhIL-8, rhC5a) führten dazu, daß PMN den Endothelmonolayer und die Polycarbonatmembran durchwandern. Die Anzahl migrierter PMN konnte gemessen werden. Ein in vitro-Modell für die Blut-Euter-Schranke stellten GUIDRY et al. (1998) vor.
In ihrem Versuchsaufbau durchquerten die bovinen PMN nach chemotaktischer Stimulation mit E. coli-Endotoxin-aktiviertem Serum insgesamt sieben Schichten:
Endothelzellmonolayer, Millipore-Membran, Kollagen-, Fibroblasten-, Kollagen- und Epithelzellschicht.
Für die Bewertung der mit dieser Methodik beobachteten Phänomene ist zu beachten, daß die Migration durch direkte Wirkung des Chemotaktikums auf die Zelle, aber auch indirekt durch stimulierte Zellen in den einzelnen Schichten ausgelöst werden kann.
die Immunantwort involviert sind. Sie besitzen eine primär chemotaktische Wirkung und können verschiedene Leukozytensubpopulationen selektiv aktivieren.
Eine Gruppeneinteilung der Chemokine erfolgt aufgrund der Struktur der aminoterminalen Cysteine (BURMESTER u. PEZZUTTO 1998):
1) CXC – Gruppe:
Hierbei werden zwei Cysteine durch eine andere Aminosäure getrennt. Eine chemotak- tische Wirkung auf humane PMN besitzen in dieser Gruppe IL-8 (s. 2.5.2), Gro ?,?,?
(growth-related oncogenes), NAP-2 (neutrophil activating peptid-2), ENA-78 (epithe- lial-derived neutrophil attractant-78), SDF-1 (stroma cell-derived factor-1) und GCP-2 (granulocyte chemotactic protein-2).
2) CC-Gruppe
Die zwei aminoterminalen Cysteine liegen unmittelbar nebeneinander. Die Zytokine dieser Gruppe sind hauptsächlich für Lymphozyten, Monozyten sowie basophile und eosinophile Granulozyten chemotaktisch wirksam. Zu nennen wären hierbei u.a. MCP (monocyte chemoattractant protein 1-4), RANTES (regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted), MIP (monocyte inflammatory protein 1?, 1?, 3?, 3?) und Eotaxin.
3) C-Gruppe
Ltn (Lymphotactin) besitzt als ein Chemokin für Lymphozyten nur ein Cystein am Aminoterminus.
4) CX3C-Gruppe
Bei den Chemokinen dieser Gruppe werden die zwei Cysteine durch drei andere Aminosäuren getrennt. Vertreten wird diese Gruppe durch Fractalkine als Chemokine für Lymphozyten und Monozyten im Gehirn und Herz.
Nach PRIESCHL et al. (1995) werden die Chemokine auch als Interkrine, PF4- (platelet factor 4) oder IL-8-Superfamilie bezeichnet, wobei die CXC-Gruppe mit ihren 12 Vertretern zusätzlich unter den Synonymen ?-, PF4- oder IL-8/NAP-Familie bekannt ist.
Neben den Chemokinen gibt es noch weitere Substanzen mit chemotaktischer Wirkung.
GILLI (1999) teilte chemoattraktive Stoffe grob in zwei Gruppen ein:– Peptid- und Lipidderivate. Zur ersten Gruppe gehören neben den Chemokinen (s. oben) bakterielle Proteine (z.B. FMLP, s. 2.5.5) und eine gemischte Gruppe (u.a. Serumproteine z.B. C5a, s.
2.5.3). Zu den Lipiden zählen u.a. die Arachidonsäuremetaboliten (z.B. LTB4, s. 2.5.4) und PAF (platelet-activating factor).
In der folgenden Tabelle werden einige experimentell verwendete chemotaktische Substanzen für PMN und die damit untersuchten Spezies aufgeführt.
Tab. 1: Experimentell genutzte chemoattraktive Substanzen (Literaturübersicht) Chemotaktikum Spezies Referenz
Rind - MDURVWA u. BRUNNER (1994)a) 1) Mensch - BIGNOLD (1987)b)
Meerschwein- chen
- HORWITZ und GARRETT (1971)b) Bakterielle
(Kultur-) Filtrate a) Pasteurella
haemolytica b) Escherichia
coli Kaninchen - WARD et al. (1968)b)
Rind - CARROLL et al. (1982)c, e) 1)
- GRAY et al. (1982)c, d)
- OLSON (1990)c)
- TJOELKER et al. (1990)c) - LOHUIS et al. (1990)c)
- BERNING et al. (1991)b)
- ROTH u. ZWAHLEN (1991)a, c) – in vivo (intra dermal)
- HOEDEMAKER et al. (1992)c)
- PERSSON et al. (1993)a) – auch in vivo (intra zisternal)
- BOCHSLER et al. (1994)a, c) - NAGAHATA et al. (1995)c) - GUIDRY et al. (1998)b) Mensch - CHENOWETH et al. (1980)c)
- JUNGER et al. (1993)c) - SUGAWARA et al. (1995)c) - KITAYAMA et al. (1997)a) Schwein - CHENOWETH et al. (1980)c)
- ELLIOTT et al. (1990)c)
Hund - TROWALD-WIGH u. THOREN-TOLLING
(1990)c)
- NAGAHATA et al. (1991)c) - THOMSEN u. JENSEN (1991)c) - ZWAHLEN et al. (1994)c) - SUGAWARA et al. (1995)c) Katze - GRAY et al. (1986)d)
Affe, Kanin- chen, Ratte, Hamster, Maus
- SUGAWARA et al. (1995)c) C5a
(Komplement- faktor 5a, s. 2.5.3) a) Synthetisches
C5a
Serum aktiviert durch:
b) E. coli-Endo- toxin
c) Zymosan d) Agarose e) Bakterien
Chemotaktikum Spezies Referenz
Mensch - HARVATH et al. (1980) - PALMBLAD et al. (1981) - CASALE und ABBAS (1990) - SUGAWARA et al. (1995) - EGGER et al. (1997) - CASALE et al. (1998)
Kaninchen - ASWANIKUMAR et al. (1977) Kaninchen u.
Ratte
- PALMER et al. (1980) Kaninchen u.
Meerschwein- chen
- CHENOWETH et al. (1980) FMLP
(N-Formyl-L- Methionyl-L- Leucyl-L- Phenylallanin) u.a. synthetische Peptide
(s. 2.5.5)
Affe, Kanin- chen, Ratte, Hamster, Maus
- SUGAWARA et al. (1995)
GCP-2
(granulocyte che- motactic protein)
Mensch - PROOST et al. (1993) GM-/G-CSF
(granulocyte-mac- rophage-/ granulo- cyte-colony sti- mulating factor)
Mensch - SMITH et al. (1993)
Mensch - KITAYAMA et al. (1997) Gro-?
(growth-related
oncogenes-?) Ratte - ZWAHLEN et al. (1993) – in vivo (intra dermal)
Rind - HEIDEL et al. (1989)a)– in vivo (intra dermal) - HENRICKS et al. (1991)c)
- HOEDEMAKER et al. (1992)c) Mensch - GOETZL et al. (1977)b)
- HENRICKS et al. (1991)c) HETE
(Hydroxyeicosate- traensäure-
Derivate a) 5-HETE b) 12-HETE c) 15-HETE
Hund - JOHNSON u. MCNEE (1991)c) Rind - PERSSON et al. (1993)
- BOCHSLER et al. (1994) - HASSFURTHER et al. (1994) - SOLTYS et al. (1999)
Mensch - SMITH et al. (1993) - MOGHE et al. (1995) - SUGAWARA et al. (1995) - KITAYAMA et al. (1997) - CASALE et al. (1998) IL-8
(Interleukin-8, s. 2.5.2)
Schwein - ROT (1991)
Chemotaktikum Spezies Referenz
Hund - ROT (1991)
- JORENS et al. (1992) – in vivo (intra tracheal) - ZWAHLEN et al. (1994) – auch in vivo (intra
dermal)
- SUGAWARA et al. (1995) - MOHAMED et al. (1996) Pferd - ENGELKE (1999)1
- ENGELKE et al. (1999) – in vivo (intra uterin) Ratte - COLDITZ et al. (1989) – in vivo (intra dermal)
- ZWAHLEN et al. (1993) – in vivo (intra dermal)
Affe, Kanin- chen, Ratte, Hamster, Maus
- SUGAWARA et al. (1995) IL-8
(Fortsetzung)
Huhn, Ziege, Meerschwein- chen, Affe, Maus, Kanin- chen, Ratte
- ROT (1991)
Rind - CRAVEN (1986)
- HEIDEL et al. (1989) – in vivo (intra dermal) - HENRICKS et al. (1991)
- PERSSON et al. (1993)
- ZERBE et al. (1994) – in vivo (intra uterin) Mensch - PALMBLAD et al. (1981)
- CASALE u. ABBAS (1990) - HENRICKS et al. (1991) - NOHGAWA et al. (1997) - CASALE et al. (1998)
Hund - JOHNSON u. MCNEE (1991)
- THOMSEN u. JENSEN (1991) Pferd - WATSON et al. (1987)
- FOSTER et al. (1992) - ENGELKE (1999)1 LTB4
(Leukotrien B4, s. 2.5.4)
Katze - GRAY et al. (1986) Rind - HENRICKS et al. (1991) 9-/13-HODE
(Linolsäure-
derivate) Mensch - HENRICKS et al. (1991)
Chemotaktikum Spezies Referenz LPS
(Lipopolysaccha- ride)
Rind - ROTH u. ZWAHLEN (1991) – in vivo (intra dermal)
- PERSSON et al. (1993) – in vivo (intra zisternal)
Rind - PERSSON et al. (1993) – in vivo (intra zisternal)
Hund - THOMSEN u. JENSEN (1991) PAF
(platelet activating factor)
Pferd - FOSTER et al. (1992) Rind - CARROLL et al. (1982)
- GRAY et al. (1982) - RAINHARD (1988) - KREMER et al. (1993) Serum od.
Plasma (akt. oder hitzeinakt.)
Hund - LATIMER et al. (1981) - NAGAHATA et al. (1991)
1) Die Buchstaben verweisen auf eine genauere Beschreibung zu Herkunft/Herstellung der chemoattraktiven Substanz in der linken Spalte.
Im folgenden wird auf die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Chemotaktika
eingegangen. IL-8, Komplementfaktor C5a, LTB4 und FMLP binden an heptikale, G-Protein gekoppelte Oberflächenrezeptoren. Die Stimulation dieser Rezeptoren kann die Aktivierung, Bewegung, Adhärenz oder Loslösung, Umformung des Zytoskeletts und Auslösung von Abwehrmechanismen der Leukozyten bewirken (BOKOCH 1995).
2.5.2 Interleukin-8
Nach GILLI (1999) sind folgende Synonyme für IL-8 bekannt: Granulocyte chemotactic protein (GCP), Leucocyte adhesion inhibitor (LAI), Monocyte derived neutrophil activating peptide (MONAP), Monocyte derived neutrophil chemotactic factor (MDNCF), Neutrophil attractant/activating protein (NAP-1), Neutrophil activating factor (NAF), T-cell chemotactic factor (TCF) u. a..
Das Chemokin IL-8 wird von Epithel-, Endothel- und dentritischen Zellen, Lymphozyten, Monozyten und Fibroblasten sezerniert (STRIETER et al. 1989, KUNKEL et al. 1991, BURMESTER u. PEZZUTTO 1998). Nach BAZZONI et al. (1991) setzen auch phagozytierende PMN große Mengen an IL-8 frei. Das aus 72 oder 77 Aminosäuren
bestehende Protein wirkt chemotaktisch v.a. auf neutrophile Granulozyten. MATSUSHIMA und OPPENHEIM (1989) und LARSEN et al. (1989) vermuten dies auch für basophile Granulozyten und T-Lymphozyten. Neben diesen Effekten steigert IL-8 den Calciumspiegel im Zytosol der PMN, die „respiratory burst“-Aktivität (s. 2.3.3) und induziert die
Freisetzung lysosomaler Enzyme (SCHROEDER et al. 1987). Auch die Expressionsdichten von Mac-1 (macrophage receptor-1, CD11b/CD18), CR4 (Komplementrezeptor 4,
CD11c/CD18) und CR1 auf PMN werden durch dieses Chemokin gesteigert (DETMERS et al. 1990). HERBERT et al. (1990) zeigten, daß Endothelzellen die IL-8-Variante mit 77 Aminosäuren und Monozyten die mit 72 Aminosäuren freisetzen. Auch die
Reizen, wie z.B. LPS, eine IL-8-Abgabe bei Monozyten. Jedoch reagieren Epithelzellen und Fibroblasten nicht auf eine LPS-Monostimulation, sondern nur auf die Kombination von LPS mit IL-1 oder TNF-?. Allerdings induziert jedes dieser beiden Zytokine auch ohne LPS eine Freisetzung von IL-8 bei den letztgenannten Zellenarten. Zeit- und dosisabhängig wird die Synthese von IL-8-mRNA bei PMN durch LPS, TNF-? und IL-1? stimuliert. Dies konnte jedoch bei der Aktivierung durch chemotaktische Substanzen (FMLP, LTB4 oder C5a) nicht beobachtet werden (STRIETER et al. 1992). Daneben besteht eine IL-8-Wirkung auf kapillare Endothelzellen in Zusammenhang mit der Angiogenese (BURMESTER u.
BEZZUTTO 1998).
PERSSON et al. (1993) konnten bei in vivo-Untersuchungen am Zitzen-Zisternen-Modell (s.
2.4.1) aufzeigen, daß es nach einer intrazisternalen Applikation von 1 ml rhIL-8 (10 oder 1000 ng/ml) zu keiner vermehrten Akkumulation von PMN im Zitzengewebe oder –lumen kam. Dagegen belegten ihre in vitro-Untersuchungen eine deutliche Migration boviner PMN bei unterschiedlichen rhIL-8-Konzentrationen. BOCHSLER et al. (1994) konnten bei in vitro-Untersuchungen aufzeigen, daß durch rhIL-8 eine transendotheliale Migration boviner PMN bewirkt wird. Die Gruppe beobachtete, daß bei einem chemotaktischen Stimulus von 75 ng rhIL-8/ml mehr PMN von neugeborenen Kälbern als von ausgewachsenen Tieren migrierten. Dieser altersbedingte Effekt konnte bei rhC5a und Zymosan-aktiviertem Serum nicht beobachtet werden.
ENGELKE et al. (1999) konnten nach intrauteriner Applikation von rhIL-8 einen deutlichen Influx von PMN beim Pferd beobachten. Weitere in vivo- und in vitro-Experimente (s. 2.5.1, Tab. 1) demonstrierten die chemoattraktive Wirkung von IL-8 auf PMN verschiedener Spezies. In den meisten Fällen wurde rekombinantes humanes IL-8 eingesetzt.
HASSFURTHER et al. (1994) inkubierten bovine Monozyten mit LPS und konnten im Kulturüberstand ein Peptid nachweisen, das morphologische und funktionelle
Übereinstimmungen mit dem humanen IL-8 aufzeigte.
2.5.3 Komplementkomponenten
Das Komplementsystem als Bestandteil des unspezifischen humoralen Immunsystems hat vielfältige Funktionen. Einerseits führen Komplementkomponenten zur Lyse von Zellen, Bakterien und lipidhaltigen Viren, andererseits übernehmen Produkte der
Komplementkaskade als Mediatorsubstanzen auch wichtige Aufgaben bei der
Informationsübertragung zwischen Zellen während einer Entzündungsreaktion (WECKER 1990). Nach DAMERAU et al. (1978) ist porcines C3a chemotaktisch wirksam für PMN von Kaninchen und Meerschweinchen, wobei die Migrationsreaktion beim Kaninchen stärker war. Im Gegensatz dazu, sprechen BURMESTER und PEZZUTTO (1998) nur C5a aber nicht C3a eine chemotaktische Wirkung zu. Nach SNYDERMAN und GOETZL (1981) ist C5a ein Protein aus 74 Aminosäuren, bei dem sich am Carboxil-terminalen Ende Arginin
Wie unter 3.1.8.1 beschrieben, erreicht man eine Anreicherung von chemotaktischen
Komplementfaktoren, indem man natives Serum z.B. mit Bakterien, Hefen oder Agarose bei 37°C inkubiert. Dadurch wird die Komplementkaskade aktiviert. Um einen enzymatischen Abbau (Caboxipeptidasen s. oben) der chemoattraktiv wirksamen Reaktionsprodukte (C3a, C5a) zu verhindern, wird das Komplement-haltige Serum für 30 Minuten bei 56°C inkubiert.
NAGAHATA et al. (1991) konnten jedoch bei ihren Untersuchungen keine Unterschiede zwischen hitzebehandeltem (30 min, 56°C) und nicht behandeltem Zymosan-aktiviertem autologen Serum bei deren chemotaktischer Wirkung auf canine Granulozyten beobachten.
PERSSON et al. (1993) konnten sowohl in vivo (intra zisternal) als auch in vitro eine chemotaktische Wirkung von C5a auf bovine PMN beobachten.
2.5.4 Leukotrien B4
Bei den Leukotrienen handelt es sich um körpereigene Metaboliten des Arachidonsäure- Stoffwechsels. Diese essentielle Fettsäure (20 C-Atome, vierfach ungesättigt) wird über Zwischenprodukte zuerst durch die Lipoxygenase in LTA umgewandelt. Aus diesem entstehen weitere Leukotrienderivate (B bis F, ZINK et al. 1990).
Die Sezernierung von Leukotrienen ist besonders mit neutrophilen und eosinophilen Granulozyten, Mastzellen und den Monozyten/Makrophagen assoziiert. Die biologische Wirkung von LTC4, LTD4 und LTE4 erstreckt sich auf alle kontraktilen Zellen (z.B. glatte Muskulatur). Durch Vasokonstriktion und –dilatation sind sie nur am Rande am
Entzündungsgeschehen beteiligt (MÜLLER-PEDDINGHAUS 1987). Im Gegensatz dazu ist LTB4 aufgrund seiner chemotaktischen Wirkung ins Entzündungsgeschehen direkt
involviert.
CASALE und ABBAS (1990) konnten zeigen, daß die chemotaktische Wirkung von LTB4
auf humane PMN zwei- bis dreimal größer ist, wenn man anstelle einer bloßen
Filtermembran (s. 2.4.2.5, Modifikationen der Boyden-Kammer) einen Filter mit einem Monolayer als Barriere verwendet. PERSSON et al. (1993) konnten eine chemotaktische Wirkung von LTB4 auf bovine PMN in vitro, aber nicht in vivo (intra zisternal) auslösen.
ZERBE (1994) erreichte durch intrauterine Applikation von LTB4 eine Anreicherung von PMN im Uteruslumen beim Rind.
2.5.5 N-Formyl-L-Methionyl-L-Leucyl-L-Phenylalanin
N-Formyl-Peptide sind hitzestabil und wurden zuerst aus Escherichia coli-Kulturfiltraten gewonnen. Inzwischen werden sie synthetisch hergestellt. Wie in Tabelle 1 dargestellt, haben sie besonders beim Menschen und bei „kleinen Labortieren“ eine chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten. Neben FMLP gehören noch weitere Peptide zu dieser Gruppe: FMP (N-Formyl-Methionyl-Phenylalanin), FNLLP (N-Formyl-Nor-Leucyl- Leucyl-Phenylalanin), MLP (Methionyl-Leucyl-Phenylalanin), Pepstatin (Pentapeptid), u.a..
Nach KITAYAMA et al. (1997) können FMLP und andere N-Formyl-Peptide die klassische und alternative Komplementkaskade auslösen und somit auch das chemotaktische C5a induzieren. ODA und KATORI (1992) zeigten, daß bei in vivo-Experimenten am Hamster
Adhärenz und transendotheliale Migration von PMN zu erreichen. In vitro-Untersuchungen von NOHGAWA et al. (1997) erbrachten entgegengesetzte Ergebnisse beim Menschen, bei dem in allen Konzentrationen die chemotaktische Wirkung von FMLP größer war als die von LTB4. Bei Transendothelmigrationstests war die Migrationsrate jedoch bei LTB4 höher als bei FMLP.
CARROLL et al. (1982) und GRAY et al.(1982) zeigten, daß FMLP keine chemotaktische Wirkung auf bovine PMN besitzt. Auch bei equinen (SNYDERMAN u. PIKE 1980), porcinen (CHENOWETH et al. 1980, THOREN-TOOLING 1990), bei caninen
(TROWALD-WIGH u. THOREN-TOOLING 1990, SUGAWARA et al. 1995) und bei felinen PMN (GRAY et al. 1986) konnte kein migrationsfördernder Effekt beobachtet werden.
