Der Einfluß von Sulfasalazin und seiner Metabolite auf die Leukotrien- und Thromboxansynthese in Monozyten und neutrophilen Granulozyten

Aus dem Institut für Klinische Pharmakologie im Zentrum Pharmakologie und Toxikologie

der Medizinischen Hochschule Hannover

Der Einfluß von Sulfasalazin und seiner Metabolite auf die Leukotrien- und Thromboxansynthese in Monozyten und

neutrophilen Granulozyten

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Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

Dirk Martin Georg Fahrenholz geboren in Osterholz-Scharmbeck

ANGENOMMEN VOM SENAT DER MEDIZINISCHEN HOCHSCHULE HANNOVER

AM: 21. MÄRZ 2006

GEDRUCKT MIT GENEHMIGUNG DER MEDIZINISCHEN HOCHSCHULE HANNOVER

PRÄSIDENT: PROFESSOR DR. MED. D. BITTER-SUERMANN

BETREUER: PROF. DR. JOACHIM FAULER / PRIV.-DOZ. DR. MED. D. STICHTENOTH

REFERENT: PROFESSOR DR. MED. V. KAEVER

KOREFERENT: PROFESSOR DR. MED. H. MIELKE

TAG DER MÜNDLICHEN PRÜFUNG: 21. MÄRZ 2006

PROMOTIONSAUSSCHUßMITGLIEDER:

PROFESSOR DR. MED. H. BIGALKE PROFESSOR DR.MED. M. GEBEL

PROFESSOR DR. RER. NAT. G.SCHUMANN

Meinen Eltern und meiner Familie

für ihre Unterstützung gewidmet

Inhaltsverzeichnis

INHALTSVERZEICHNIS ...I ABBILDUNGSVERZEICHNIS ...III VERWENDETE ABKÜRZUNGEN... V

1 EINLEITUNG...1

1.1 Geschichte von Sulfasalazin ...1

1.2 Bedeutung von SASP für die Therapie entzündlicher Darmerkrankungen ...2

1.3 Bedeutung von SASP für die Therapie der chronischen Polyarthritis ...3

1.4 Pharmakokinetische Eigenschaften von SASP, 5-ASA und SP ...5

1.5 Pharmakologischer Wirkmechanismus von SASP ...7

1.6 Entzündungszellen als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten...8

1.7 Sauerstoffradikale als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten ...8

1.8 NFκB als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten...9

1.9 PAF als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten...12

1.10 Prostaglandin - Synthese als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten ...12

1.11 Thromboxansynthese als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten...13

1.12 Hemmung der Leukotriensynthese als Angriffspunkt für SASP und seinen Metaboliten 14 1.13 Synthese, Metabolismus und biologische Wirkung von Leukotrienen ...15

1.14 Stimulation der Leukotriensynthese ...19

1.14.1 Stimulation mittels dem Calcium-Ionophor (A23187)... 19

1.14.2 Stimulation der Leukotriensynthese mittels fMLP (153-155) ... 19

2 FRAGESTELLUNG ...21

3 MATERIAL UND METHODEN...23

3.1 Verwendete Materialien, Pharmaka und Chemikalien ...23

3.1.1 Zellpräparation ... 23

3.1.2 Pharmaka ... 24

3.1.3 Analytik ... 25

3.2 Methoden ...26

3.2.1 Monozytenpräparation ... 26

3.2.2 Granulozytenpräparation... 30

3.2.3 Analytik der Arachidonsäure - Metaboliten ... 32

4 ERGEBNISSE ...37

4.1 Einfluß von MK 886 auf die Leukotrien- und Thromboxan-Synthese von neutrophilen Granulozyten und Monozyten ...38

4.2 Einfluß von Sulfasalazin und seinen Metaboliten auf die Leukotrien- und Thromboxan-Synthese in neutrophilen Granulozyten und Monozyten ...41

5 STATISTIK ...52

6 DISKUSSION ...53

6.1 Beeinflussung der Leukotriensynthese in neutrophilen Granulozyten durch SASP ... und seine Metabolite...53

6.2 Beeinflussung der Leukotriensynthese in Monozyten durch SASP und seinen Metaboliten ...57

6.3 Beeinflussung der Leukotriensynthese in neutrophilen Granulozyten und ... Monozyten durch Salicylsäure und Gentisinsäure...60

6.4 Beeinflussung der Thromboxansynthese durch SASP, 5-ASA, SP, Gentisinsäure ... und Salicylsäure in Monozyten ...63

6.5 Effekt von MK 886, einem selektiven 5-Lipoxygenase-Inhibitor, auf die Leukotriensynthese in Granulozyten und die LTB4 und TxA2-Synthese in Monozyten64 6.6 Methodische Einschränkungen der vorliegenden Arbeit...65

6.7 Wirkmechanismus von SASP und seinen Metaboliten ...67

6.8 Wirkung von 5-Lipoxygenase-Inhibitoren bei Tiermodellen entzündlicher Darmerkrankungen ...67

6.9 Inhibitoren der Leukotriensynthese in der Behandlung der Colitis ulcerosa beim Menschen ...69

6.10 Pharmakologischer Wirkmechanismus von SASP und seinen Metaboliten bei der chronischen Polyarthritis...72

6.11 Zusammenfassung ...73

7 LITERATUR ...74

DANKSAGUNG...1

Abbildungsverzeichnis

ABBILDUNG 1.: ÜBERSICHT ÜBER DIE PHARMAKOKINETIK VON SASP UND SEINEN

METABOLITEN...6

A^BBILDUNG 2.: AKTIVIERUNGSMECHANISMUS VON NFκB...9

A^BBILDUNG 3.: HEMMUNG DER NFκBAKTIVIERUNG...11

A^BBILDUNG 4.: PROSTACYCLINE,THROMBOXANE UND PROSTAGLANDINE,SYNTHESE UND WIRKUNG...13

A^BBILDUNG 5.: LEUKOTRIENE,SYNTHESE UND WIRKUNG...15

A^BBILDUNG 6.: SYNTHESE UND METABOLISMUS VON LEUKOTRIENEN...17

A^BBILDUNG 7.: STRUKTUR VON CALCIUM-IONOPHOR (A23187) ...19

A^BBILDUNG 8.: WIRKMECHANISMUS VON CALCIUM-IONOPHOR (A23187) UND FMLP ...20

A^BBILDUNG 9.: STRUKTURFORMELN VON SULFASALAZIN,SULFAPYRIDIN,...25

5-AMINOSALICYLSÄURE,SALICYLSÄURE,GENTISINSÄURE UND MK886 ...25

ABBILDUNG 10.: CHROMATOGRAMM MIT BEKANNTEN MENGEN AN LEUKOTRIENEN...33

ABBILDUNG 11.: CHROMATOGRAMM KONTROLLE AUS EINEM GRANULOZYTENÜBERSTAND...34

ABBILDUNG 12.: CHROMATOGRAMM KONTROLLE AUS EINEM MONOZYTENÜBERSTAND...35

GRAPH:4.1.1.: HEMMUNG DER LTB₄-UND LTC₄-SYNTHESE IN GRANULOZYTEN DURCH MK886. ...38

A^BBILDUNG 13.: HEMMUNG MIT MK886 IN UNTERSCHIEDLICHEN KONZENTRATIONEN...39

G^RAPH:4.1.2.: HEMMUNG DER LTB₄- UND TXB₂-SYNTHESE IN MONOZYTEN DURCH MK886. ...40

G^RAPH 4.2.1.: HEMMUNG DER LTB4- UND LTC4-SYNTHESE IN GRANULOZYTEN DURCH SULFASALAZIN. ...41

A^BBILDUNG 14.: HEMMUNG MIT SASP IN UNTERSCHIEDLICHEN KONZENTRATIONEN...42 G^RAPH 4.2.2.: HEMMUNG DER LTB₄-UND TXB₂-SYNTHESE IN MONOZYTEN

G^RAPH 4.2.3.: HEMMUNG DER LTB4- UND LTC4-SYNTHESE IN GRANULOZYTEN DURCH 5-AMINOSALICYLSÄURE. ...44 G^RAPH 4.2.4.: HEMMUNG DER LTB₄-UND TXB₂-SYNTHESE IN MONOZYTEN

DURCH 5-AMINOSALICYLSÄURE...45 GRAPH 4.2.5.: HEMMUNG DER LTB₄- UND LTC₄-SYNTHESE IN GRANULOZYTEN

DURCH SULFAPYRIDIN. ...46 G^RAPH 4.2.6.: HEMMUNG DER LTB₄- UND TXB₂-SYNTHESE IN MONOZYTEN

DURCH SULFAPYRIDIN. ...47 GRAPH 4.2.7.: HEMMUNG DER LTB4- UND LTC4-SYNTHESE IN GRANULOZYTEN

DURCH SALICYLSÄURE. ...48 G^RAPH 4.2.8.: HEMMUNG DER LTB₄- UND TXB₂-SYNTHESE IN MONOZYTEN

DURCH SALICYLSÄURE. ...49 GRAPH 4.2.9.: HEMMUNG DER LTB₄-UND LTC₄-SYNTHESE IN GRANULOZYTEN

DURCH GENTISINSÄURE...50 G^RAPH 4.2.10.: HEMMUNG DER LTB₄- UND TXB₂-SYNTHESE IN MONOZYTEN

DURCH GENTISINSÄURE...51

Verwendete Abkürzungen

5-ASA 5-Aminosalicylsäure

5-HPETE 5-Hydroperoxyarachidonsäure

5-LO 5-Lipoxygenase

A 23187 Calcium-Ionophor

ATP Adenosintriphosphat

Ca ²⁺ Calcium

COX-1 und COX-2 Cyclooxygenase 1 und 2 cPLA₂ zytosolische Phospholipase A₂

BSA Albumin aus Rinderserum (Bovine Serum Albumin)

DMSO Dimethylsulfoxid

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

FLAP 5-Lipoxygenase Activating Protein

fMLP synthetisches Analogon eines bakteriellen Peptids

GS Gentisinsäure

HPLC Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie IKK Identifizierter IκB Kinase Komplex

LT A4 Leukotrien A4

LT B₄ Leukotrien B₄

LT C₄ Leukotrien C₄

LT D₄ Leukotrien D₄

LT E₄ Leukotrien E₄

M Molar ( = mol/l )

mM Millimolar

MK 886 selektiver 5-Lipoxygenase Inhibitor N-Acetyl-5-ASA N-Acetyl-5-Aminosalicylsäure

NFκB Nuclear Faktor κ B

NO Stickstoffmonoxid

NSAID Nichtsteroidale Antiphlogistika

PAF Plättchenaktivierender Faktor

PBS Phosphatpuffer (Phosphate Buffer Solution)

PG E Prostaglandin E

PG H2 Prostaglandin H2

PG I2 Prostaglandin I2 ( = Prostacyclin )

PL Phospholipide

RIA Radio-Immuno-Assay

rpm Umdrehungszahl pro Minute (Rounds per minute)

SA Salicylsäure

SASP Sulfasalazin, Azulfidine, Salazosulfapyridin

SP Sulfapyridin

SRS-A Slow Reacting Substances of Anaphylaxis

TNFα Tumornekrosefaktor α (Tumor Nekrosis Faktor α)

TPA Tissue Polypetide Antigen

Tx A₂ Thromboxan A₂ (instabiler Metabolit) Tx B₂ Thromboxan B₂ (stabiler Metabolit)

UAW Unerwünschte Arzneimittelwirkung

1 Einleitung

1.1 Geschichte von Sulfasalazin

Sulfasalazin (SASP) wird als Basistherapeutikum zur Behandlung der chronischen Polyarthritis (1), zur Therapie des akuten Schubes und zur Remissionserhaltung der Colitis ulcerosa (2, 3) sowie zur Therapie des akuten Schubes beim Morbus Crohn (4, 5) erfolgreich eingesetzt. Bemerkenswert ist, dass SASP bereits 1940 für diese beiden Indikationen von Nanna Svartz in Zusammenarbeit mit Pharmacia entwickelt wurde (6, 7).

Sulfasalazin ist bis heute eines der wenigen Medikamente, die auf der Basis von pathophysiologischen Überlegungen synthetisiert wurden (7). Svartz konnte zeigen, dass Streptokokken aus dem Rachen und dem Darm von Rheumatikern bei Kaninchen und bei Ratten die für eine chronischen Polyarthritis typischen Gelenkveränderungen auslösen können (6, 7). Sie folgerte aus diesen Experimenten, dass Bakterien sowohl bei der chronischen Polyarthritis als auch bei der Colitis ulcerosa eine pathophysiologisch wichtige Rolle spielen (6, 7). Zur damaligen Zeit waren nur Sulfonamide als Arzneimittel mit antibiotischer Wirkung bekannt.

Therapieversuche mit der gleichzeitigen Gabe eines Sulfonamides zur Antibiose und eines Salicylates als Schmerzmittel waren bei Rheumatikern nicht oder nur ungenügend wirksam (6, 7). Aus heute nicht mehr eruierbaren Gründen wollte Svartz ein Salicylat und Sulfonamid aneinander koppeln um auf diese Weise die Wirkung zu verbessern. Pharmacia synthetisierte eine Reihe solcher Verbindungen zur intravenösen Applikation. Svartz konnte mit diesen Verbindungen bei einigen Rheumatikern eine gewisse Wirkung feststellen. Willstaedt von Pharmacia gelang es, Sulfapyridin (SP) über eine AZO-Verbindung mit 5-Aminosalicylsäure (5-ASA) zu koppeln (6). Diese neue Verbindung wurde als Sulfasalazin, Azulfidine oder Salazosulfapyridin bezeichnet (6, 7). Sulfasalazin war nicht wasserlöslich und musste deshalb für die orale Applikation verkapselt werden (6, 7). Nachdem bei Tierversuchen keine toxischen Wirkungen festgestellt werden konnten, führte Svartz im Herbst 1940 einen erfolgreichen therapeutischen Versuch mit SASP bei Rheumatikern durch (6, 7). In der Folgezeit testete Svartz SASP hauptsächlich bei Patienten mit einer chronischen Polyarthritis bei Colitis ulcerosa oder bei Morbus

Erfolge (6, 7). Außerdem beobachtete sie Teil- und Vollremission bei Patienten mit Colitis ulcerosa. Während bei den meisten Patienten SASP keine unerwünschten Arzneimittelwirkungen (UAW) hatte, kam es bei einigen Patienten zu fieberhaften Reaktionen und Hautausschlägen, wie sie typischerweise unter den Sulfonamiden beobachtet werden können (6, 7). Diese unerwünschten Arzneimittelwirkungen limitierten die Anwendung von SASP.

Obwohl die initiale Hypothese von Svartz, dass die chronischen Polyarthritis und die Colitis ulcerosa durch Streptokokken verursacht werden, heute nicht mehr haltbar ist, verdanken wir diesem Ansatz mit SASP und 5-ASA zwei therapeutisch wirksame Medikamente für die Behandlung beider Krankheiten.

1.2 Bedeutung von SASP für die Therapie entzündlicher Darmerkrankungen

Die Therapie der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen mit Sulfasalazin oder 5-ASA richtet sich nach dem Befallsmuster des Darmes, der Entzündungsaktivität und der extraintestinalen Manifestation der Erkrankungen. Beim Morbus Crohn ist SASP nur bei alleiniger Kolonbeteiligung indiziert (4, 5). Dann können alternativ 5-ASA oder SASP bei milder Aktivität des Morbus Crohn eingesetzt. Metaanalysen konnten keine Überlegenheit von SASP und 5-ASA gegenüber Placebo in der Remissionserhaltung des Morbus Crohn herausstellen, so dass eine Dauertherapie nicht mehr empfohlen wird (8). Bei der Colitis ulcerosa werden alternativ 5-ASA oder SASP bei pankolitischem Befall, chronisch aktivem Verlauf und zur Rezidivprophylaxe eingesetzt (2, 3, 9). Die Überlegenheit in der Remissionserhaltung von oral verabreichtem SASP in einer Dosierung von 0,4 - 4 g/Tag gegenüber Placebo wurde zuerst durch Misiewicz und Mitarbeiter 1965 gezeigt (10). Azad-Kahn et al. konnten 1977 in einer klinischen Studie zeigen, dass 5-ASA in der Behandlung der Colitis ulcerosa die aktive Komponente ist und die unerwünschten Wirkungen von SASP auf den Metaboliten SP zurückzuführen sind (11). Um hohe Konzentrationen in den

5-ASA (13). Bei extraintestinaler Manifestation der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen ist bei Arthritis (20-40%) das SASP dem 5-ASA aufgrund des wirksamen Sulfapyridin-Anteils vorzuziehen. Ransford und Langman fassten die schweren unerwünschten Ereignisse zusammen, die im Vereinigten Königreich in den Jahren 91-98 bezüglich SASP und 5-ASA gemeldet wurden. SASP wurde 4,7 millionenmal und 5-ASA 2,8 millionenmal verschrieben (14). Für 5-ASA erfolgten 11,1 Meldungen einer interstitiellen Nephritis pro Millionen Verordnungen. Eine Pankreatitis wurde für 5-ASA 7,5 mal und für SASP 1,1mal pro Millionen Verordnungen registriert.

Nach dieser Studie treten unter 5-ASA mehr Pankreatitiden und interstitielle Nephritiden pro Million Verordnungen als unter SASP auf (14). Di Paolo und Mitarbeiter untersuchten die Nebenwirkungen der beiden Präparate bei 685 Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (15). 410 erhielten SASP, 130 5-ASA und 145 beide Präparate. Nach 5-7 Jahren wurden bei 20% der mit SASP und bei 6,5% der mit 5-ASA behandelten Patienten Nebenwirkungen festgestellt (15). In dieser Studie hatte also 5-ASA eine geringere Nebenwirkungsrate als SASP (15). Die Verträglichkeit und die Schwere der unerwünschten Arzneimittelwirkungen von 5-ASA und SASP müssen in einer prospektiven und randomisierten Studie untersucht werden.

1.3 Bedeutung von SASP für die Therapie der chronischen Polyarthritis

Obwohl Svartz eine günstige Wirkung von Sulfasalazin (SASP) bei der Behandlung der chronischen Polyarthritis nachweisen konnte (16), wurde die Anwendung von SASP in der Rheumatologie nicht weiter verfolgt. Ursache hierfür war wahrscheinlich eine negative Studie (17) sowie die überzeugenden therapeutischen Effekte mit den neu entwickelten Glukokortikoiden. Die Behandlungsstrategie der chronischen Polyarthritis in jenen Jahren zentrierte sich hauptsächlich auf die Beherrschung der Entzündung mittels der Glukokortikoide und der nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAID). Die Basistherapeutika kamen in der Behandlungspyramide zuletzt (18).

Diese therapeutische Strategie war ausreichend, um die Entzündung und die Schmerzen zu beherrschen, sie war jedoch ungeeignet, die Progression der chronischen Polyarthritis zu beeinflussen (19). Epidemiologische Studien belegen dies (18). So starben trotz einer optimalen Therapie 37% der Patienten innerhalb von 20

Jahren und bei 27% der Patienten führte die Erkrankung zur vollständigen Invalidität (20-22). Darüber hinaus war die Lebenserwartung der Patienten mit einer schweren Verlaufsform der chronischen Polyarthritis um 7-10 Jahre verkürzt (23, 24). Einen erheblichen Anteil an dieser hohen Mortalität hatten die NSAID durch deren hohe gastrointestinale Toxizität (25). Die Arbeitsgruppe von Fries et al. konnte sehr eindrucksvoll die Annahme widerlegen, dass Basistherapeutika wesentlich toxischer sind als NSAID und zeigen, dass NSAID und Basistherapeutika eine vergleichbare Toxizität aufweisen (26).

Bemerkenswert ist, dass SASP für 30 Jahre in der Therapie der chronischen Polyarthritis keine Bedeutung hatte. Das änderte sich erst, als McConkey und Mitarbeiter 1970 in einer klinischen Studie die Wirksamkeit von SASP bei der chronischen Polyarthritis eindeutig belegen konnten (27). Aufgrund dieser positiven Studienergebnisse nahm das Interesse an SASP als Basistherapeutikum wieder zu.

Es folgten eine Vielzahl von vergleichenden klinischen Studien mit Placebo, D-Penicillamin, intravenösem Gold und Methotrexat (28-30). Alle diese Studien zeigen, dass SASP in seiner Wirksamkeit mit dem Goldstandard Methotrexat vergleichbar ist und es signifikant besser wirksam ist als Hydroxychloroquin (30, 31).

Bis heute ist nicht eindeutig geklärt, ob SASP selbst oder einer seiner Metabolite bei der chronischen Polyarthritis wirksam ist (17, 32-35).

O’Dell konnte mit einer über zwei Jahre dauernden Studie nachweisen, dass SASP sehr gut mit Methotrexat und Hydroxychloroquin kombinierbar ist und diese Kombination signifikant wirksamer ist als die Einzelsubstanzen oder die Kombination zweier dieser Basistherapeutika (36). Neben der gut belegten Wirksamkeit, der geringen Toxizität und dem günstigen Preis von SASP im Vergleich zu den oben genannten Basistherapeutika ist SASP auch heute noch immer ein sehr wertvolles Medikament für die Therapie der chronischen Polyarthritis (37). Die günstigen Effekte von SASP auf die chronische Polyarthritis konnten in klinischen Studien auch für die juvenile rheumatoide Arthritis belegt werden (38).

Im Unterschied zu den entzündlichen Darmerkrankungen, bei denen sowohl SASP als

1.4 Pharmakokinetische Eigenschaften von SASP, 5-ASA und SP

Nach oraler Einnahme von SASP werden ca. 30% im oberen Gastrointestinaltrakt resorbiert, während der Rest in unveränderter Form das Kolon erreicht (12). Etwa 80% des im oberen Gastrointestinaltraktes resorbierten SASP wird über die Leber in den Dünndarm eliminiert, so dass insgesamt über 80% der eingenommenen SASP - Dosis das Kolon erreichen (12). Die Arbeitsgruppe von Das et al. bestätigte diese komplexe Kinetik von SASP, indem sie bei Patienten mit einem Ileostoma mehr als 80% der oral eingenommenen SASP - Dosis als intaktes SASP in der Darmflüssigkeit nachweisen konnten (39). SASP wird im Kolon durch bakterielle Reduktion in seine beiden Komponenten 5-Aminosalicylsäure (5-ASA) und Sulfapyridin (SP) gespalten (12, 40). Nicht galenisch geschütztes 5-ASA wird im Magen und im Dünndarm vollständig resorbiert (41). Die Halbwertszeit beträgt zwischen 40 und 60 Minuten und ist dosisabhängig. Der Hauptmetabolit von 5-ASA im Plasma und im Urin ist Acetyl-5-ASA (41). Der acetylierte Anteil ist unabhängig vom Acetylatortyp (39). Studien belegen, dass entgegen der Vermutung 5-ASA nicht in der Leber, sondern nahezu ausschließlich im Darmepithel von Dünn- und Dickdarm acetyliert wird (42, 43). Die Aufnahme in das Darmepithel ist kapazitätsabhängig (44).

Im Blut ist die Proteinbindung von Acetyl-5-ASA ca. 80% und die Halbwertszeit beträgt ca. 6 Stunden (45). Im Urin kann außer Acetyl-5-ASA auch der glukuronidierte Metabolit von Acetyl-5-ASA nachgewiesen werden (45).

In-vitro-Experimente belegen, dass Acetyl-5-ASA nur sehr langsam in Zellen aufgenommen werden kann (46). Klinische Studien mit Acetyl-5-ASA zeigen, dass es keine oder nur sehr geringe therapeutische Wirkung besitzt (47, 48). SASP und 5-ASA zeigen eine hohe Affinität zu kollagenreichem Bindegewebe (49, 50). So konnten in Peritoneal- , Pleura- und Synovialflüssigkeit erhöhte Konzentrationen von SASP und 5-ASA gemessen werden. Die Anreicherung in der Synovialflüssigkeit ist von Bedeutung für die antirheumatische Wirkung von SASP (51). Sulfapyridin (SP) wird aus dem Kolon langsam resorbiert (52-54) und gleichmäßig über die verschiedenen Körperflüssigkeiten und Gewebe verteilt (49). SP wird in der Leber metabolisiert und ca. 2/3 der als SASP eingenommen Menge als acetylierter oder glukuronidierter Metabolit über die Niere in den Urin ausgeschieden (55).

Die Plasmakonzentrationen von SP sind sehr stark von der Acetylierungsrate abhängig (56). So wurden nach der Einnahme von 4g SASP maximale Plasmakonzentrationen von 30,5 µg/ml bei langsamen und 7,2 bei schnellen Acetylierern gemessen (53). Dies ist von Bedeutung als dass bei langsamen Acetylierern häufiger unerwünschte Arzneimittelwirkungen beobachtet werden.

Weitere 7% werden direkt mit dem Stuhl ausgeschieden (39, 54).

1.5 Pharmakologischer Wirkmechanismus von SASP

Die in klinischen Studien eindeutig belegbare therapeutische Wirksamkeit von SASP bei den entzündlichen Darmerkrankungen (3, 5) und der chronischen Polyarthritis (1) sowie die unter SASP auftretenden unerwünschten Arzneimittelwirkungen waren die Hauptgründe für das Bestreben den molekularen Wirkmechanismus von SASP aufzuklären. Mit der Kenntnis des molekularen Wirkmechanismus wäre es dann eventuell möglich, nach Substanzen zu suchen, die ein günstigeres Nutzen-Risiko- Verhältnis als SASP aufweisen. Obwohl man die auslösende Ursache weder für die entzündlichen Darmerkrankungen (57) noch für die chronische Polyarthritis kennt (58), sind diese Erkrankungen durch ein abnorm stimuliertes Immunsystem einerseits und andererseits durch eine im Verlauf und Ausdehnung unregelmäßig auftretende massive Entzündungsreaktion gekennzeichnet (57, 58) SASP und 5-ASA können bei diesen Erkrankungen also nur dann therapeutisch effektiv sein, wenn sie sowohl entzündungshemmend als auch immunmodulatorisch wirksam sind.

Die bisherigen Versuche einen „Hauptwirkmechanismus“ für SASP zu charakterisieren sind bis heute gescheitert (59, 60). Statt dessen konnten eine Vielzahl von unterschiedlichsten Angriffspunkten evaluiert werden (59, 60). Allen diesen Mechanismen ist gemeinsam, dass sich pharmakologische Effekte von SASP in Konzentrationen von 1-3 mM beobachten lassen (59, 60). Im Gegensatz zu SASP lässt sich für 5-ASA für die meisten der untersuchten Mediatoren nur in Konzentrationen von 2-10 mM oder höher ein pharmakologischer Effekt nachweisen (59, 60). Die geringe Potenz von SASP und die noch viel geringere Potenz von 5-ASA ist wahrscheinlich der Grund für die in der Therapie benötigten hohen Dosierungen von 2-5 g / Tag.

1.6 Entzündungszellen als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten

SASP und 5-ASA hemmen dosisabhängig die Synthese von Immunglobulinen A, G, und M (IgA, IgG, IgM) durch zirkulierende B-Lymphozyten (61), wobei 5-ASA deutlich weniger wirksam als SASP ist (62). In einer anderen Studie konnte gezeigt werden, dass SASP die durch Staphylococcus aureus stimulierte Proliferation von B- Lymphozyten hemmen kann (63). Bei diesen Versuchen konnte für die 5-ASA und ihren Metabolit Acetyl-5-ASA kein Effekt nachgewiesen werden (63). Die Aktivität von Natürlichen Killerzellen konnte durch SASP, SP und 5-ASA dosisabhängig vermindert werden, während wiederum für 5-ASA kein Effekt nachgewiesen werden konnte (64).

Für Konzentrationen im höheren millimolare Bereich waren diese Effekte irreversibel und damit eher durch die Toxizität der Substanzen bedingt. Eine reversible Verminderung der Natürlichen Killerzellen - Aktivität konnte auch bei Patienten, die mit SASP behandelt wurden, nachgewiesen werden. Bei diesen Patienten hatte 5-ASA keine Effekte (65). Die Wirkung von SASP korrelierte sehr gut mit dem Acetylator- Phänotyp, so dass wahrscheinlich SP hier die wirksame Substanz ist (65). Die Infiltration der Lamina Propria und die Bildung von Kryptenabszessen sind die Charakteristika der akuten Phase der Colitis ulcerosa (57). SASP, nicht jedoch 5-ASA hemmt die Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten (66) in einer modifizierten Boydenkammer. Rhodes und Mitarbeiter bestimmten für SASP eine IC₅₀ von 2,5 mM, also einer Konzentration, die im Dickdarm unter therapeutischen Bedingungen erreicht werden kann (67). Für 5-ASA errechneten sie eine IC₅₀ von 32,7 mM (67) also eine therapeutisch kaum erreichbare Konzentration.

1.7 Sauerstoffradikale als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten

Die bei der akuten Entzündungsreaktion aktivierten neutrophilen Granulozyten setzen große Mengen von Sauerstoffradikalen frei (68, 69). Die Eigenschaft von 5-ASA, Sauerstoffradikale zu neutralisieren, wurde bereits 1983 durch Hiller und Wilson (70)

Bereich vollständig blockiert, sind für pharmakologisch relevante Effekte von 5-ASA fünf und mehr millimolare Konzentrationen notwendig. Studien mit Hemmstoffen der Xanthinoxidase wie z.B. mit Pterinaldehyd belegen, dass die alleinige Hemmung der Synthese von Sauerstoffradikalen für eine therapeutische Wirksamkeit weder bei der chronischen Polyarthritis noch bei den entzündlichen Darmerkrankungen ausreichend ist, sondern wie z.B. bei Allopurinol die Substanz darüber hinaus auch Radikalfänger sein muss (80). Diese Doppelfunktion, bestehend aus Inhibitor und Radikalfänger, ist wahrscheinlich deswegen notwendig weil bei Entzündungsreaktionen eine Vielzahl von Reaktionen ablaufen, bei denen Sauerstoffradikale entstehen, jedoch durch die obigen Substanzen nicht gehemmt werden.

1.8 NF κ κ κ κ B als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten

Abbildung 2.: Aktivierungsmechanismus von NFκB in Anlehnung an Schottelius et al.,(81)

In der Pathogenese der entzündlichen Darmerkrankungen sowie der chronischen Polyarthritis werden immer wieder Umweltfaktoren diskutiert, die bei entsprechend

prädisponierten Patienten zu einer Aktivierung der Erkrankung führen können. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass Umweltfaktoren die Genexpression in Zellen beeinflussen können. Diese Beeinflussung wird durch so genannte Transkriptionsfaktoren vermittelt. Die Bedeutung des Transkriptionsfaktors NFκB für die entzündlichen Darmerkrankungen wurde von P. Barnes 1997 zusammengefasst (82). NFκB wurde als Regulator der Gene für die Synthese von κ-Leichtketten in Mäuselymphozyten identifiziert. Weitere Untersuchungen konnten zeigen, dass es sich bei NFκB nicht um einen einzelnen Faktor, sondern um eine Familie von Faktoren handelt, deren Aufgabe darin besteht, nach einer Stimulation der Zelle spezifisch Gene zu aktivieren und so die Biosynthese von Proteinen zu regulieren.

NFκB ist ein im Zytosol lokalisiertes Heterodimer bestehend aus den beiden Proteinuntereinheiten p65 und p50. Im Zytosol wird NFκB durch die Bindung an die beiden Proteine IκBα und IκBβ inaktiviert. Aktivierung der Zelle führt zur Aktivierung von spezifischen Kinasen (IKKα und IKKβ), die die beiden inhibitorischen Proteine IκBα und IκBβ phosphorylieren und von NFκB abspalten. Das so aktivierte NFκB permeiert in den Zellkern und aktiviert spezifische Sequenzen in der Promotorregion von Zielgenen, was über die Bildung der mRNA zur Synthese von spezifischen Proteinen führt. NFκB induziert aber auch die Synthese von IκBα, welches dann an NFκB bindet und somit NFκB inaktiviert. Diese Inaktivierung ist für den Organismus lebenswichtig, denn ohne diese Inaktivierung würde der Organismus an einer generalisierten Entzündungsreaktion sterben. NFκB induziert eine Vielzahl von Entzündungsmediatotoren wie z.B. TNFα und IL-1, die selbst wieder NFκB aktivieren und auf diese Weise die Entzündungsreaktion verstärken und unterhalten (83). Die Expression der induzierbaren NO - Synthase in Kolonepithelzellen von Patienten mit Colitis ulcerosa wie auch in den Synovialzellen von Patienten mit chronischer Polyarthritis ist durch NFκB vermittelt (81).

Abbildung 3.: Hemmung der NFκB Aktivierung in Anlehnung an Schottelius et al., (81)

Die Bedeutung von NFκB bei entzündlichen Reaktionen wird durch Experimente unterstützt, die belegen, dass ein wesentlicher Anteil der antiinflammatorischen Wirkung von Glukokortikoiden in der Hemmung von NFκB besteht. Glukokortikoide induzieren außerdem die Synthese von IκBα, welches im Zellkern an NFκB bindet und es auf diese Weise inaktiviert. Es konnte gezeigt werden, dass SASP in millimolaren Konzentrationen in Kolonepithelzellen den durch TNFα, LPS und TPA stimulierten Transkriptionsfaktor NFκB hemmt (84). Dies ist insofern von Bedeutung, als das die Bindungsstellen für NFκB in den Promotorregionen verschiedener Gene z.B. für Cytokine und Adhäsionsmoleküle nachgewiesen werden konnten. 5-ASA und zu einem geringen Grad auch ASS hemmen ebenfalls NFκB (84). Weitere Experimente belegen, dass SASP direkt mit der Bindungsstelle von ATP an IKKα und IKKß kompetitiv interagiert (85). In allen den bisher beschriebenen Zellmodellen hatte die 5-ASA nur einen sehr geringen Effekt auf NFκB. In Studien mit anderen Zellmodellen konnte eine im Vergleich zu SASP etwas stärkere Wirkung von 5-ASA

auf NFκB nachgewiesen werden (86) als in den Versuchen der Arbeitsgruppe von R. M. Schmid (84). Dennoch ist der Effekt von 5-ASA auf NFκB sehr gering und dürfte klinisch nur eine untergeordnete Rolle spielen. Im Gegensatz dazu ist die Beeinflussung von NFκB durch SASP von Bedeutung, weil die immunsuppressive Wirkung in therapeutisch erreichbaren Konzentrationen ausgelöst wird und diese sowohl bei der chronischen Polyarthritis als auch bei den entzündlichen Darmerkrankungen relevant ist. Die unterschiedliche starke Wirkung von SASP und 5- ASA auf NFκB könnte auch erklären, weswegen SASP, jedoch nicht die 5-ASA bei der chronischen Polyarthritis wirksam ist.

1.9 PAF als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten

Der Plättchenaktivierende Faktor (PAF) konnte in Biopsaten der Rektumschleimhaut von Patienten mit Colitis ulcerosa, nicht jedoch bei Patienten ohne entzündliche Darmerkrankungen nachgewiesen werden (87, 88). Das Calcium-Ionophor, (A23187) führte in Biopsien von Colitis ulcerosa Patienten zu einem 5 - fachen Anstieg der PAF-Konzentration im Vergleich zu Patienten ohne entzündliche Darmerkrankungen.

Mit SASP und 5-ASA, nicht jedoch mit SP gelang es, diesen Anstieg von PAF zu blockieren (87, 89).

1.10 Prostaglandin - Synthese als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten

Die Hemmung der Prostaglandinsynthese durch nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAID) war ein Meilenstein in der Therapie der chronischen Polyarthritis (90). Für die Therapie einer leichten bis mittelstarken Aktivität ist die antiinflammatorische und analgetische Wirkung von NSAID ausreichend (19). Aufgrund der fehlenden immunsuppressiven Wirkung der NSAID ist es nicht möglich, mit diesen Substanzen

Ulcerationen und Blutungen bis hin zu Vernarbungen mit Strikturen belegt (91-93).

Daher kann eine Hemmung der Prostaglandinsynthese durch NSAID bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen zu einem massiven Schub führen, so dass die Anwendung von NSAID bei diesen Patienten kontraindiziert ist (94). Es ist daher therapeutisch eher nachteilig, wenn SASP oder einer seiner Metabolite die Prostaglandinsynthese hemmen würde.

Abbildung 4.: Prostacycline, Thromboxane und Prostaglandine, Synthese und Wirkung

1.11 Thromboxansynthese als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten

Thromboxan (TxA₂) ist ein potenter Stimulator der Plättchenaggregation und führt über seine vasokonstriktorische Wirkung zu einer Verminderung der Darmdurchblutung. SASP hemmt die Synthese von TxA₂ in Zellhomogenaten aus

rektaler Mukosa (95). Außer den Thrombozyten synthetisieren auch Monozyten und Makrophagen erhebliche Mengen an TxA2, welches dann die lokale Entzündungsreaktion verstärkt. Thromboxan A₂ hat eine Halbwertszeit von 30 Sekunden und wird schnell in das inaktive und messbare Thromboxan B2

umgewandelt.

1.12 Hemmung der Leukotriensynthese als Angriffspunkt für SASP und seinen Metaboliten

Leukotriene sind an der physiologischen Regulation des intestinalen Flüssigkeits- und Ionentransportes beteiligt (96). Außerdem spielen sie eine wichtige Rolle für die Regulation der Durchblutung der Magen- und Darmschleimhaut (96, 97). In der Kolonschleimhaut von Patienten mit einem akuten Schub einer Colitis ulcerosa wurden hohe Konzentrationen von Leukotrien B₄ (LTB₄) gemessen (98). Die Hemmung der Leukotriensynthese wird heute als einer der wichtigsten molekularen Angriffspunkte von SASP und 5-ASA für die Wirksamkeit bei den entzündlichen Darmerkrankungen angenommen (60). Leukotriene konnten auch in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit chronischen Polyarthritis nachgewiesen werden (99). Die LTB₄-Konzentration korrelierte signifikant mit der Zellzahl, dem Rheumafaktor, und den Immunkomplexen in der Synovialflüssigkeit (100). Wir konnten durch die Messung von LTE₄, dem Hauptmetaboliten der Cysteinyl-Leukotriensynthese im Urin, eine erhöhte Leukotriensynthese bei Patienten mit juveniler rheumatoider Arthritis nachweisen (101). Mit der gleichen Methode lies sich auch bei Patienten mit chronischer Polyarthritis eine aktivierte Leukotriensynthese nachweisen (102). Leukotriene werden im Unterschied zu den Prostaglandinen immer erst nach einer massiven Stimulation und nur durch vom Knochenmark freigesetzte Zellen (neutrophile Granulozyten, Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, Mastzellen, eosinophile und basophile Granulozyten) synthetisiert (Übersicht in (103, 104)).

Abbildung 5.: Leukotriene, Synthese und Wirkung

1.13 Synthese, Metabolismus und biologische Wirkung von Leukotrienen

Essentiell für die Synthese von Leukotrienen ist die Freisetzung von Arachidonsäure aus Zellmembranen durch die im Zytosol lokalisierte Phospholipase A₂ (cPLA₂) (105-107). Die Arachidonsäure ist das Ausgangssubstrat für die Synthese der Eicosanoide und auch Leukotriene (108). Wird die Zelle aktiviert und ist der damit einhergehende intrazelluläre Ca²⁺-Anstieg für eine Aktivierung der Ca²⁺-abhängigen Enzyme cPLA₂ und der 5-Lipoxygenase (5-LO) ausreichend, so translozieren die cPLA2 (109) und der bi-funktionelle Enzymkomplex -bestehend aus 5-LO (110-112) und LTA4-Synthase sowie das 5-Lipoxygenase aktivierende Protein (FLAP) (113-115) an die Membran des Zellkerns oder des Golgi - Apparates. Während der

Translokation wird die 5-LO über eine Phosphorylierung aktiviert. Für eine vollständige Aktivierung der 5-LO sind neben Ca²⁺ auch ATP und zwei weitere zytoplasmatische Proteine notwendig (111). Neuere Forschungsergebnisse konnten auch zeigen, dass die Untereinheit p65 von NFκB ebenfalls an die 5-LO bindet. Es ist allerdings völlig unklar, wie die Aktivität der 5-LO über NFκB beeinflusst wird. Dass 5-LO und NFκB sich gegenseitig beeinflussen können, lässt sich aus experimentellen Modellen ableiten, die zeigen, dass die durch die aktivierte 5-LO entstehenden Sauerstoffradikale NFκB aktivieren können (116). An der Membran bindet der aktivierte Enzymkomplex, bestehend aus 5-LO und LTA₄-Synthase an FLAP (113, 117), dessen Funktion wahrscheinlich darin besteht, diesen bifunktionellen Enzymkomplex an der Membran in der Nähe der cPLA₂ zu arretieren um so einen optimalen Transfer der Arachidonsäure von der cPLA₂ zur 5-LO zu gewährleisten. Das von der 5-LO aus der Arachidonsäure gebildete instabile Endoperoxid 5(S)-Hydroxy-6-trans-8,11,14-cis-eicosatetraensäure (5-HPETE) wird entweder durch eine Glutathion-Peroxidase zu dem biologisch inaktiven 5(S)-Hydroxy-6,8,11,14-eicosatetraensäure (5-HETE) oder durch die LTA₄-Synthase zu 5(S)-Hydroxy-6trans-8,11,14-cis-eicosatetraensäure (LTA₄) metabolisiert (Übersicht bei Samuelsson und Funk) (118). LTA4 ist der erste Metabolit mit den für die Leukotriene typischen 3 konjugierten Doppelbindungen. LTA4 ist ein extrem instabiler Metabolit, der je nach Zelltyp enzymatisch entweder durch eine LTA4-Hydrolase zu (5S,12R)-12-Dihyroxy-6,14-cis-8,10-trans-eicosatetraensäure (LTB₄) (108, 119) oder durch eine Glutathion-S-Transferase (LTC₄-Synthase) zu 5(S)-Hydroxy-6(R)-S-glutathionyl-7,9-trans-11,14-cis-eicosatetraensäure (LTC4) (120- 122) metabolisiert werden kann.

Abbildung 6.: Synthese und Metabolismus von Leukotrienen

Das Metabolisierungsmuster von LTA4 ist Zelltyp-abhängig (Übersichtsarbeiten (103, 104, 123, 124). So synthetisieren neutrophile Granulozyten und Monozyten hauptsächlich LTB₄. Makrophagen können sowohl LTB₄ als auch LTC₄ synthetisieren, während eosinophile und basophile Granulozyten sowie Mastzellen ausschließlich LTC₄ synthetisieren (Übersicht in (125)). Von erheblicher Bedeutung ist auch ein transzellulärer Metabolismus, bei dem LTA₄ z. B. durch Endothelzellen zu LTC₄ und LTB₄ metabolisiert werden kann (126-128). Dies ist insofern von Bedeutung, als Endothelzellen über keine 5-LO verfügen und damit selbst auch keine Leukotriene aus Arachidonsäure synthetisieren könnten.

LTB₄ wird durch einen aktiven Transport aus der Zelle geschleust und entfaltet seine Wirkung durch die Bindung an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (129-131). LTB₄ ist eines der potentesten endogen gebildeten Chemotaxine für neutrophile Granulozyten und dürfte somit eine wichtige Rolle in der Initialphase einer Entzündung spielen (132, 133). LTB₄ wird sehr rasch durch neutrophile Granulozyten zu den biologisch inaktiven Metaboliten 20-OH-LTB₄ und 20-COOH-LTB₄ oxidiert (134) oder z.B. durch Mesangiumzellen oder Monozyten langsam zu zwei biologisch ebenfalls inaktiven Dihydro - Metaboliten reduziert (135-138). In der Leber werden alle LTB₄-Metabolite vollständig durch ß-Oxidation metabolisiert (139).

LTC4 wird nach seiner Synthese durch ein ATP-abhängiges Transportprotein in den Extrazellulärraum transportiert, wo es durch die auf der Außenseite verschiedener Zellen lokalisierte γ-Glutamyltransferase reversibel zu dem biologisch noch aktiveren LTD4 metabolisiert wird (121, 122). In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass das Transportprotein für LTC₄ zur Familie der Multidrug Resistance Proteine gehört (MDRP) und so letztlich die Funktion einer zellulären Detoxifizierung übernimmt (140- 144). LTC₄ und LTD₄ entfalten ihre Wirkung nach der Bindung an G-Protein-regulierte Rezeptoren (145). Sie sind hochpotente Konstriktoren der glatten Bronchial- und Gefäßmuskulatur und erhöhen die Gefäßpermeabilität (133, 146-148). LTD₄ wird irreversibel durch das Ectoenzym LTD₄-Dipeptidase zu dem biologisch nahezu inaktiven LTE₄ metabolisiert (Übersicht bei (139). LTE₄ wird zu 20-OH-LTE₄ und

1.14 Stimulation der Leukotriensynthese

1.14.1 Stimulation mittels dem Calcium-Ionophor (A23187)

Der stärkste zur Verfügung stehende Stimulus der Leukotriensynthese ist das Calcium-Ionophor (A23187). Diese Substanz wurde aus Kulturen von Streptomyces chartreusensis isoliert und hat antibiotische Eigenschaften. Seine Struktur wurde 1974 von Chaney et al. aufgeklärt und ist in Abb. 7. dargestellt. Es bildet einen für Ca²⁺-Ionen selektiven Kanal durch die Zellmembran. Calcium-Ionophor (A 23187) ist ein unspezifischer Stimulator der 5-LO, da alle Ca²⁺-abhängigen Reaktionen gleichermaßen stimuliert werden (Abb. 7.). Mit Hilfe von Calcium-Ionophor (A 23187) lässt sich somit die gesamte Enzymaktivität der 5-LO und das Vorhandensein der für die Leukotriensynthese notwendigen Co-Faktoren wie dem FLAP, ATP und zwei bisher nicht näher charakterisierte Proteinen untersuchen.

Abbildung 7.: Struktur von Calcium-Ionophor (A 23187) (152)

1.14.2 Stimulation der Leukotriensynthese mittels fMLP (153-155)

N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) ist ein synthetisches Analogon eines chemotaktischen Peptides aus der Membran gram-negativer Bakterien. fMLP bindet an einen spezifischen Rezeptor und führt zu einem Ca²⁺-Einstrom in die Zelle (Abb. 7.) (153-155). Der durch fMLP induzierte Ca²⁺-Einstrom führt in Monozyten von Menschen zu einer gut messbaren Leukotriensynthese. Im Gegensatz hierzu lässt sich in Granulozyten, die von Menschen isoliert wurden, keine Leukotriensynthese induzieren. Ob hierfür der Ca²⁺-Einstrom zu gering oder zu langsam erfolgt oder ob es zusätzliche Regulationsmechanismen gibt, ist zur Zeit unbekannt. fMLP kann jedoch bei neutrophilen Granulozyten Sauerstoffradikale und lysosomale Enzyme freisetzen.

Der Vorteil von fMLP im Vergleich zu Calcium-Ionophor (A 23187) besteht in der

Tatsache, dass die fMLP - stimulierte Leukotriensynthese durch zelluläre Regulationsmechanismen beeinflusst wird und sich dieser Effekt durch eine Änderung der Leukotriensynthese erfassen lässt.

2 Fragestellung

Bei der Behandlung der chronischen Polyarthritis ist SASP der 5-ASA therapeutisch überlegen. Die entzündungshemmende und immunsuppressive Wirkung von SASP ist jedoch begrenzt, so dass SASP mit anderen Basistherapeutika sowie mit Steroiden und NSAID bei der Therapie der chronischen Polyarthritis kombiniert werden muss.

Im Gegensatz dazu belegen klinische Studien, dass bei der Behandlung entzündlicher Darmerkrankungen die therapeutische Wirksamkeit von SASP und 5-ASA als äquivalent zu beurteilen ist. SASP und 5-ASA sind zur Induktion und zur Erhaltung der Remission bei entzündlichen Darmerkrankungen indiziert. Bei der Induktion der Remission dominiert das Bild der akuten Entzündung mit der Infiltration von neutrophilen Granulozyten in das Entzündungsgebiet. Die Wirksamkeit von SASP und 5-ASA ist im akuten Schub begrenzt und muss meistens durch Steroide oder andere Immunsuppressiva ergänzt werden. Dies belegt, dass sowohl die immunsuppressive als auch entzündungshemmende Wirkung von SASP erheblich schwächer ist als die der Glukokortikoide. Anders in der Remissionserhaltung bei der Therapie der Colitis ulcerosa. Hier ist es möglich mit einer Monotherapie mit SASP oder 5-ASA erfolgreich zu sein. In der Phase der chronischen Entzündung dominieren Monozyten und Makrophagen.

In den bisher durchgeführten In-vitro-Studien unterscheidet sich die Wirksamkeit von SASP und 5-ASA erheblich. Während durch SASP die meisten Entzündungsmediatoren stark vermindert werden, ist die Beeinflussung durch 5-ASA häufig nur geringfügig. Diese Unterschiede in der Wirksamkeit zwischen SASP und 5-ASA könnten durch die angewandten In-vitro-Modelle bedingt sein. So wurden die Untersuchungen zur Beeinflussung der Leukotriensynthese nahezu ausschließlich an neutrophilen Granulozyten durchgeführt, obwohl SASP und 5-ASA bei diesen Zellen nur bedingt wirksam sind. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Validierung der angewandten In-vitro-Modelle. So wird meist nicht untersucht, ob eine vollständige Hemmung der untersuchten Mediatoren bei einer maximalen Stimulation durch Calcium-Ionophor (A23187) überhaupt möglich ist.

In In-vivo-Studien wurde mittels Dialysebeutel, die im Rektum platziert waren, signifikant höhere Konzentrationen von LTB₄, TxB₂ und PGE₂ bei Patienten mit Colitis ulcerosa und Morbus Crohn im Vergleich zu gesunden Probanden gemessen. Die erhöhte Konzentration von LTB korrelierte mit der Krankheitsaktivität bei Patienten

mit Morbus Crohn. Unter der Behandlung mit SASP oder 5-ASA wurden die Konzentration der Eicosanoide im Darm signifikant gesenkt.

Wir haben in der vorliegenden Arbeit folgende Fragestellungen untersucht:

1. Wie beeinflussen SASP, 5-ASA und SP die Leukotriensynthese in neutrophilen Granulozyten und Monozyten?

2. Wie stark ist die Beeinflussung der Leukotriensynthese durch SASP, 5-ASA und SP im Vergleich zu dem hochspezifischen Leukotriensynthese-Inhibitor MK 886?

3. Was könnte die Ursache für die geringere Wirksamkeit von 5-ASA im Vergleich zu SASP auf die Leukotriensynthese sein?

3 Material und Methoden

3.1 Verwendete Materialien, Pharmaka und Chemikalien

- PBS-Puffer ohne Ca²⁺ (pH 7,4):

0,2 g/l KCl (Merck)

0,2 g/l KH₂PO₄ (Merck)

0,1 g/l MgCl₂ 6H₂O (Merck)

8,0 g/l NaCl (Merck)

1,4 g/l Na₂HPO₄ 2H₂O (Merck)

- Hanks-Puffer (pH 7,0):

8,0 g/l NaCl (Baker)

0,4 g/l KCl (Merck)

0,3 g/l CaCl2 H2O (Merck) 0,1 g/l MgSO₄ 2H₂O (Merck) 0,1 g/l MgCl2 6H2O (Merck) 0,08 g/l Ca₂HPO₄ 2H₂O (Riedel de Haen)

0,04 g/l KH₂PO₄ (Merck)

1,98 g/l Glucose (Merck)

1,0 g/l BSA (Serva)

NaHCO₂ (Merck)

- Wasch-PBS-Puffer ohne Ca²⁺: Dem o.g. PBS-Puffer wurden 0,1% BSA beigefügt.

- EDTA Titriplex III (Merck) - Ficoll (Pharmacia)

- Plasmasteril (Fresenius AG, Bad Homburg) - Zentrifuge CR 412 (Jouan)

- Inkubationsschrank (Heraeus) - Färbungen : Trypan Blau (Merck) Türksche Lösung (Merck)

- Stimulator : Calcium-Ionophor (A23187) (Sigma-Chemie) Dimethylsulfoxid, DMSO (Merck)

N-Formylmethionylleucylphenylalanin, fMLP (Sigma) Cytochalasin B (Sigma)

3.1.2 Pharmaka

Name: Summenformel: MG: Firma:

Sulfasalazin C₁₈H₁₄N₄O₅S 398,4 Sigma 5-Aminosalicylsäure C₇H₇NO₃ 153,1 Sigma Sulfapyridin C₁₁H₁₁N₃O₂S 249,3 Sigma Salicylsäure C7H5O3Na 160,1 Sigma Gentisinsäure C9H11O4N 197,19 Aldrich MK 886 C₂₇H₃₃NO₂CISNa 459,5 Merck

Sulfasalazin

5-{4-(2-Pyridylsulfamoyl)phenylazo}salicylsäure

5-Aminosalicylsäure Sulfapyridin

Salicylsäure Gentisinsäure

2-Hydroxybenzoesäure 2,5-Dihydroxybenzoesäure

MK 886

Abbildung 9.: Strukturformeln von Sulfasalazin, Sulfapyridin,

5-Aminosalicylsäure, Salicylsäure, Gentisinsäure und MK 886

3.1.3 Analytik

3.1.3.1 Hochleistungsflüssigkeits-Chromatograph:

Niederdrucksystem bestehend aus:

• 1 LKB-Pumpe

• Spectroflow 783-Detektor (Kratos) UV-Detektor

• C-R3A-Integrator (Shimadzu)

3.1.3.2 HPLC- Eluenten :

• Methanol (J.T.Baker)

• Acetonitril (J.T.Baker)

• Wasser (in HPLC-Qualität)

• Isopropanol (J.T.Baker)

• Essigsäure (J.T.Baker)

• Ammoniak (Merck)

• Phosphorsäure (Merck)

Alle Substanzen waren in HPLC-Qualität.

3.1.3.3 Radio – Immuno – Assay für die Bestimmung von TxB

:

- RIA-Puffer:

- 0,01 mol Na₂HPO₄ - 0,01 mol NaH₂PO₄

- 0,1 mol NaCl - 0,1 % BSA

(Merck) (Merck) (Merck) (Serva) - Antikörper: - TxB2-Antikörper P 7291 (Sigma) - Tracer: - ³H-TxB2 NET 603 (NEN)

- Aktivkohle: - Norit A 30890 (Serva)

- Dextran: - Dextran T 70 (Merck)

- Standard: - Standard TxB₂ T0516 (Sigma) - Szintillator: - Rotiszint ecoplus 0016 (Roth)

- Counter: - 1211 Rackbeta (LKB Wallac)

3.2 Methoden

3.2.1 Monozytenpräparation

Übersichtsdiagramm 1: Monozytenversuche

Blutabnahme (3.2.1.1.)

⇓

Isolation der Monozyten, Entfernen der Lymphozyten (3.2.1.2.)

⇓

Zellzahl und Verteilung (3.2.1.3.)

⇓

Inkubation (3.2.1.4.)

⇓

Inkubationsansätze und Stimulation (3.2.1.5.)

⇓

3.2.1.1 Blutentnahme

Vor der Blutentnahme wurden 4 Bluecups mit je 60 mg EDTA und 10 ml PBS vorbereitet. 80 ml Blut wurden bei gesunden 20 bis 40-jährigen Probanden, die eine Woche vorher keine Medikamente eingenommen hatten, aus der Cubitalvene abgenommen. Das Blut wurde auf die 4 Bluecups gleichmäßig verteilt und vorsichtig geschwenkt.

3.2.1.2 Isolation der Monozyten

Entfernen der Thrombozyten :

Die Proben wurden bei 1000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, danach wurde der Überstand vorsichtig abgenommen und bei 3000 rpm für 10 Minuten bei 10°C erneut zentrifugiert. Das Erythrozytenkonzentrat wurde bis nach dem Zentrifugiern auf Eis gestellt. Der abzentrifugierte Überstand wurde vorsichtig wieder mit den Erythrozyten vermischt. Die abzentrifugierten Thrombozyten wurden verworfen.

Dieser Vorgang wurde nochmals wiederholt.

Isolation der Monozyten / Lymphozyten Population :

8 Bluecups wurden mit je 10 ml Ficoll gefüllt und dann gleichmäßig mit dem vermischten Erythrozyten / Überstand überschichtet und bei 3300 rpm für 30 Minuten bei 10°C zentrifugiert. Nach 30 Minuten befand sich zwischen der obersten Schicht und Ficoll eine milchig-weiße Schicht (Monozyten / Lymphozyten- Layer). Dieser Layer wurde mit einer Pasteur-Pipette abgenommen und auf 4 Bluecups verteilt.

Die Bluecups wurden mit Wasch-PBS aufgefüllt und bei 1500 rpm für 15 Minuten bei 10°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert. Die Zellen wurden mit einer 1 ml Eppendorf-Pipette vorsichtig in 2 ml Wasch-PBS resuspendiert und das Bluecup bis auf 50 ml mit Wasch-PBS aufgefüllt und geschwenkt. Dieser Vorgang wurde nochmals wiederholt. Nach dem Zentrifugieren wurden die Zellen vorsichtig in 10 ml Hank`s aufgenommen.

3.2.1.3 Zellzahl und Verteilung:

20 µl dieser Zellsuspension wurden mit 20 µl Trypan Blau angefärbt und in der Neubauer-Zählkammer ausgezählt.

Berechnung:

Zellzahl = 16 x 2 x 10000 x 10

16 = Anzahl der Quadrate der Zählkammer 2 = Verdünnungsfaktor durch Färbung 10000 = Volumen der Zählkammer (10^-4 ml)

10 = Aufnahmevolumen der Zellen in Hank`s Puffer

Die Zellsuspension wurde mit Hank`s Puffer so verdünnt, dass eine Konzentration von 10⁶ Zellen / ml erreicht wurde. Die Zellsuspension wurde gleichmäßig auf die Schalen verteilt, so dass eine Zelldichte von 10⁶ Zellen pro Schale erreicht wurde.

Zusätzlich wurde in jede Schale 1 ml Hank`s Puffer pipettiert.

3.2.1.4 Inkubation der Zellen, Entfernen der Lymphozyten

Die so präparierten Ansätze wurden für 1 Stunde zur Aggregation der Monozyten bei 37°C / 5% CO₂ / 95 % Luft im Brutschrank inkubiert und dann je Schale zum Entfernen der Lymphozytenpopulation dreimal mit eiskalten Wasch-PBS gewaschen. Die Schalen wurden dann mit 2 ml Hank's aufgefüllt und für weitere 3 Stunden bis zur Stimulation in den Brutschrank gestellt.

3.2.1.5 Inkubationsansätze und Stimulation

SASP und seine Metabolite wurden in Milligramm abgewogen und in Hank`s Puffer gelöst, so dass eine Pharmakonkonzentration von 10^-2 M erreicht wurde. Aus

wurde in einer 1:10 Verdünnung eine Verdünnungsreihe von 10^-5 bis 10^-12 M hergestellt und bis zum Gebrauch in den Brutschrank gestellt. Allen MK 886-Konzentrationen und den Kontrollen für die MK 886-Vesuchsreihe wurde 1µl Ethanol zugesetzt, um so den Fehler durch die absteigende Alkoholkonzentration zu minimieren. Alle Lösungen und Konzentrationsreihen wurden am jeweiligen Versuchstag neu angesetzt.

Die Schalenüberstände wurden nach 3 Stunden dekantiert und gegen je 1 ml der vorbereiteten Inhibitorlösung in der entsprechenden Konzentration ausgetauscht, so dass jeweils zwei Schalen die gleiche Konzentration enthielten. In die Kontrollen wurde 1 ml Hank`s Puffer eingesetzt. Die Schalen wurden vorsichtig geschwenkt und dann für 20 Minuten bei 37°C im Brutschrank inkubiert.

Die Stimulation erfolgte entweder mit 5 µl Calcium-Ionophor (A23187) (26 µl Stammlösung ( 1 µg A23187 / 1 µg DMSO ) / 24 µl DMSO ) für 10 Minuten oder erst mit Cytochalasin B ( 20 µl Stammlösung (5 mg Cytochalasin B / 1 ml Ethanol) / 380 ml Hank`s Puffer) und dann mit fMLP 10 µl Stammlösung ( 4,376 mg fMLP / 1 ml DMSO ) / 990 µl Hank`s Puffer (10 Minuten) mit je 10 µl für 10 Minuten. Nach der Zugabe des Stimulators wurden die Schalen vorsichtig geschwenkt und in den Brutschrank gestellt. Nach 10 Minuten wurde der Überstand aus zwei Schalen mit gleicher Konzentration ( je 1 ml ) zu einer Probe zusammengefasst und in 5 ml Röhrchen pipettiert. Von den 2 ml Überstand wurden 500 µl abpipettiert und bei -20°C für den TxB₂-RIA aserviert. Die restlichen 1500 µl wurden bei -4°C über Nacht aufbewahrt.

3.2.1.6 Probenaufbereitung und Aservation

Die verbleibenden 1500 µl wurden am nächsten Tag in einer Vakuumzentrifuge auf

~300 µl eingeengt, mit 100 µl Methanol zur Proteinfällung versetzt und gut durchmischt. Vor dem Chromatographieren wurden die Proben bei -4°C gelagert und kurz vor der Probenaufgabe für 10 Minuten bei 11000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Chromatographenspritze abgenommen und chromatographiert.

3.2.2 Granulozytenpräparation

Übersichtsdiagramm 2 : Granulozytenversuche Isolation der Granulozyten (3.2.2.2.)

⇓

Hämolyse (3.2.2.3.)

⇓

Verdünnung und Verteilung (3.2.2.4.)

⇓

Inkubation und Stimulation (3.2.2.5.)

⇓

Probenaufbereitung (3.2.2.6.)

⇓

Analytik (3.2.3.)

Die Granulozyten wurden nach der von Boyum beschriebenen Methode präpariert (157)

3.2.2.1 Buffy-Coat

Der Buffy-Coat wurde im Rahmen der Blutspende in der Blutbank der Medizinischen Hochschule Hannover aufbereitet.

3.2.2.2 Isolation der Granulozyten

zur Sedimentation der Erythrozyten bei Raumtemperatur (~20°C ) stehen gelassen.

Dann wurden 4 Bluecups mit je 10 ml Ficoll gefüllt, über die nach 30 Minuten der abpipettierte Überstand geschichtet wurde. Das Erythrozytensediment wurde verworfen. Nach 30 Minuten bei 1200 rpm und 10°C wurde der Überstand aus den Bluecups dekantiert und das Sediment in 1 ml Hank`s vorsichtig resuspendiert.

3.2.2.3 Hämolyse

In jedes Bluecup wurden 10 ml eiskaltes Wasser pipettiert und nach 20 Sekunden mit 10 ml hyperosmolarem PBS-Puffer (1,8% NaCl und 0,2% BSA) neutralisiert.

Nach 10 Minuten bei 1000 rpm und 10°C wurde der Überstand dekantiert und die Hämolyse noch einmal wiederholt. Nach dem letzten Zentrifugieren wurden die Zellen in 10 ml Hank`s resuspendiert.

3.2.2.4 Verdünnung und Verteilung

Aus den 10 ml Zellsuspension wurden 20 µl abpipettiert, mit 20 µl Türkscher Lösung angefärbt und in der Neubauer-Zählkammer ausgezählt (Die Berechnung erfolgte wie unter 3.2.1.3. beschrieben). Danach wurde die Zellsuspension so mit Hank`s Puffer verdünnt, dass eine Zelldichte von 2 x 10⁷ Zellen / ml entstand.

1 ml Zellsuspension wurde gleichmäßig auf 5 ml-Röhrchen verteilt. Dann wurde 1 ml Hank`s Puffer hinzupipettiert und für eine Stunde in den Brutschrank gestellt.

3.2.2.5 Inkubation und Stimulation

Die Inhibitorlösungen wurden, wie unter 3.2.1.5. beschrieben, vorbereitet.

Nach dem Zentrifugieren für 10 Minuten bei 1000 rpm und 10°C wurde der Überstand der Röhrchen dekantiert, die Zellen in 1ml Pharmakon / Hank`s Puffer resuspendiert und für 20 Minuten im Brutschrank bei 37°C/ 5% CO₂/ 95% Luft inkubiert. Danach wurde der Stimulator hinzupipettiert, die Inkubationsansätze vorsichtig geschüttelt und für 10 Minuten in den Brutschrank gestellt.

Nach 10 Minuten Stimulation wurden die Ansätze bei 4000 rpm abzentrifugiert und in Eppendorf-Cups pipettiert. Die Proben wurden bis zur weiteren Aufarbeitung bei -4°C aufbewahrt.

3.2.2.6 Probenaufbereitung

Die Probenaufbereitung erfolgte wie unter 3.2.1.6. beschrieben.

3.2.3 Analytik der Arachidonsäure - Metaboliten

3.2.3.1 Analytik der Leukotriene mit Hochleistung – Flüssigkeits- Chromatographie (HPLC)

Die Leukotriene wurden mittels UV-Detektion gemessen, indem wir einen HP1040 Chromatographen mit einem HP3396A Integrator (beide von Hewlett-Packard) oder einen SP8800 Chromatographen (Spectaphysics) mit einem Spectroflow 783 (Kratos) und einem C-R3A-Integrator (Shimadzu) verwendeten.

Die stationäre Phase bestand aus einer Säule (250 x 4.6 mm) aus ODS (5 µm Partikeln, Shandon). Die mobile Phase war ein linearer Gradient zwischen Puffer A (Acetonitril / Methanol / Wasser / Essigsäure, 20: 20 : 60 : 0,005, v / v) und Puffer B (Acetonitril / Methanol / Wasser / Essigsäure, 56 : 14: 30 : 0,05, v / v), die mit NH₄ auf einen pH von 5,4 eingestellt wurden. Die Konzentrationsgradienten der Puffer A und B liefen in entgegen gesetzten Konzentrationen, wobei Puffer A zum Zeitpunkt 0 Minute mit 100% in absteigender Richtung startete und Puffer B mit 0%. Die Flußrate betrug 1 ml / min. Die Leukotriene wurden bei einem Absorptionsmaximum von 280 nm quantifiziert. 20-COOH-LTB₄, 20-OH-LTB₄, LTB₄, LTC₄ , LTD₄ und LTE₄ konnten im Vergleich der Retentionszeiten mit synthetischen Standards identifiziert und quantifiziert werden (Abbildung 8.) Die untere Nachweisgrenze für LTB₄ lag bei 1 ng und für LTC₄ , LTD₄ , LTE₄ bei 1,25 ng.

Abbildung 10.: Chromatogramm mit bekannten Mengen an Leukotrienen

Abbildung 11.: Chromatogramm Kontrolle aus einem Granulozytenüberstand

Abbildung 12.: Chromatogramm Kontrolle aus einem Monozytenüberstand

3.2.3.2 TxB

-Radio-Immuno-Assay

Die Konzentration an TxB₂ wurde mittels Radio-Immuno-Assay (RIA) nach Giannessi et al., 1982 (158) gemessen. Der RIA wurde nach dem unten dargestellten Pipettierschema hergestellt. Alle Inkubationsansätze enthielten 100 µl an radioaktivmarkierten ³H-TxB₂ mit 5000 cpm/100 µl. Die 100 µl TxB₂-Standard wurden in einer 1:2 Verdünnungsreihe von 10000 pg/ml bis 8 pg/ml angesetzt.

Sowohl die Standardreihe als auch die totale Radioaktivität, die unspezifischen Bindungen und die totale Bindungskapazität wurden doppelt bestimmt. Aus den zu messenden Proben wurden ebenfalls 100 µl entnommen und an Stelle des Standards im RIA eingesetzt. Nach Zugabe von 100 µl eines spezifischen TxB₂-Antikörpers und 100 µl RIA-Puffers (0,01 M Na₂HPO₄ / 0,01 M NaH₂PO₄ / 0,1 M NaCl / 0,1% BSA mit einem pH von 7,4) wurden die Proben 12 Stunden bei 4°C inkubiert. Dann wurden den Inkubationsansätzen 250 µl Aktivkohle (1g Norit A / 1g Dextran in 200 ml RIA-Puffer) zugegeben und für 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. 500 µl der Überstände wurden nach 15 minütigem Zentrifugieren bei 14000 rpm abpipettiert und mit 10 ml Szintillator zur Radioaktivitätsmessung in den Liquid Scintillation Counter gestellt.