SASP und 5-ASA hemmen dosisabhängig die Synthese von Immunglobulinen A, G, und M (IgA, IgG, IgM) durch zirkulierende B-Lymphozyten (61), wobei 5-ASA deutlich weniger wirksam als SASP ist (62). In einer anderen Studie konnte gezeigt werden, dass SASP die durch Staphylococcus aureus stimulierte Proliferation von B-Lymphozyten hemmen kann (63). Bei diesen Versuchen konnte für die 5-ASA und ihren Metabolit Acetyl-5-ASA kein Effekt nachgewiesen werden (63). Die Aktivität von Natürlichen Killerzellen konnte durch SASP, SP und 5-ASA dosisabhängig vermindert werden, während wiederum für 5-ASA kein Effekt nachgewiesen werden konnte (64).
Für Konzentrationen im höheren millimolare Bereich waren diese Effekte irreversibel und damit eher durch die Toxizität der Substanzen bedingt. Eine reversible Verminderung der Natürlichen Killerzellen - Aktivität konnte auch bei Patienten, die mit SASP behandelt wurden, nachgewiesen werden. Bei diesen Patienten hatte 5-ASA keine Effekte (65). Die Wirkung von SASP korrelierte sehr gut mit dem Acetylator-Phänotyp, so dass wahrscheinlich SP hier die wirksame Substanz ist (65). Die Infiltration der Lamina Propria und die Bildung von Kryptenabszessen sind die Charakteristika der akuten Phase der Colitis ulcerosa (57). SASP, nicht jedoch 5-ASA hemmt die Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten (66) in einer modifizierten Boydenkammer. Rhodes und Mitarbeiter bestimmten für SASP eine IC50 von 2,5 mM, also einer Konzentration, die im Dickdarm unter therapeutischen Bedingungen erreicht werden kann (67). Für 5-ASA errechneten sie eine IC50 von 32,7 mM (67) also eine therapeutisch kaum erreichbare Konzentration.
1.7 Sauerstoffradikale als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten
Die bei der akuten Entzündungsreaktion aktivierten neutrophilen Granulozyten setzen große Mengen von Sauerstoffradikalen frei (68, 69). Die Eigenschaft von 5-ASA, Sauerstoffradikale zu neutralisieren, wurde bereits 1983 durch Hiller und Wilson (70)
Bereich vollständig blockiert, sind für pharmakologisch relevante Effekte von 5-ASA fünf und mehr millimolare Konzentrationen notwendig. Studien mit Hemmstoffen der Xanthinoxidase wie z.B. mit Pterinaldehyd belegen, dass die alleinige Hemmung der Synthese von Sauerstoffradikalen für eine therapeutische Wirksamkeit weder bei der chronischen Polyarthritis noch bei den entzündlichen Darmerkrankungen ausreichend ist, sondern wie z.B. bei Allopurinol die Substanz darüber hinaus auch Radikalfänger sein muss (80). Diese Doppelfunktion, bestehend aus Inhibitor und Radikalfänger, ist wahrscheinlich deswegen notwendig weil bei Entzündungsreaktionen eine Vielzahl von Reaktionen ablaufen, bei denen Sauerstoffradikale entstehen, jedoch durch die obigen Substanzen nicht gehemmt werden.
1.8 NF κ κ κ κ B als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten
Abbildung 2.: Aktivierungsmechanismus von NFκB in Anlehnung an Schottelius et al.,(81)
In der Pathogenese der entzündlichen Darmerkrankungen sowie der chronischen Polyarthritis werden immer wieder Umweltfaktoren diskutiert, die bei entsprechend
prädisponierten Patienten zu einer Aktivierung der Erkrankung führen können. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass Umweltfaktoren die Genexpression in Zellen beeinflussen können. Diese Beeinflussung wird durch so genannte Transkriptionsfaktoren vermittelt. Die Bedeutung des Transkriptionsfaktors NFκB für die entzündlichen Darmerkrankungen wurde von P. Barnes 1997 zusammengefasst (82). NFκB wurde als Regulator der Gene für die Synthese von κ-Leichtketten in Mäuselymphozyten identifiziert. Weitere Untersuchungen konnten zeigen, dass es sich bei NFκB nicht um einen einzelnen Faktor, sondern um eine Familie von Faktoren handelt, deren Aufgabe darin besteht, nach einer Stimulation der Zelle spezifisch Gene zu aktivieren und so die Biosynthese von Proteinen zu regulieren.
NFκB ist ein im Zytosol lokalisiertes Heterodimer bestehend aus den beiden Proteinuntereinheiten p65 und p50. Im Zytosol wird NFκB durch die Bindung an die beiden Proteine IκBα und IκBβ inaktiviert. Aktivierung der Zelle führt zur Aktivierung von spezifischen Kinasen (IKKα und IKKβ), die die beiden inhibitorischen Proteine IκBα und IκBβ phosphorylieren und von NFκB abspalten. Das so aktivierte NFκB permeiert in den Zellkern und aktiviert spezifische Sequenzen in der Promotorregion von Zielgenen, was über die Bildung der mRNA zur Synthese von spezifischen Proteinen führt. NFκB induziert aber auch die Synthese von IκBα, welches dann an NFκB bindet und somit NFκB inaktiviert. Diese Inaktivierung ist für den Organismus lebenswichtig, denn ohne diese Inaktivierung würde der Organismus an einer generalisierten Entzündungsreaktion sterben. NFκB induziert eine Vielzahl von Entzündungsmediatotoren wie z.B. TNFα und IL-1, die selbst wieder NFκB aktivieren und auf diese Weise die Entzündungsreaktion verstärken und unterhalten (83). Die Expression der induzierbaren NO - Synthase in Kolonepithelzellen von Patienten mit Colitis ulcerosa wie auch in den Synovialzellen von Patienten mit chronischer Polyarthritis ist durch NFκB vermittelt (81).
Abbildung 3.: Hemmung der NFκB Aktivierung in Anlehnung an Schottelius et al., (81)
Die Bedeutung von NFκB bei entzündlichen Reaktionen wird durch Experimente unterstützt, die belegen, dass ein wesentlicher Anteil der antiinflammatorischen Wirkung von Glukokortikoiden in der Hemmung von NFκB besteht. Glukokortikoide induzieren außerdem die Synthese von IκBα, welches im Zellkern an NFκB bindet und es auf diese Weise inaktiviert. Es konnte gezeigt werden, dass SASP in millimolaren Konzentrationen in Kolonepithelzellen den durch TNFα, LPS und TPA stimulierten Transkriptionsfaktor NFκB hemmt (84). Dies ist insofern von Bedeutung, als das die Bindungsstellen für NFκB in den Promotorregionen verschiedener Gene z.B. für Cytokine und Adhäsionsmoleküle nachgewiesen werden konnten. 5-ASA und zu einem geringen Grad auch ASS hemmen ebenfalls NFκB (84). Weitere Experimente belegen, dass SASP direkt mit der Bindungsstelle von ATP an IKKα und IKKß kompetitiv interagiert (85). In allen den bisher beschriebenen Zellmodellen hatte die 5-ASA nur einen sehr geringen Effekt auf NFκB. In Studien mit anderen Zellmodellen konnte eine im Vergleich zu SASP etwas stärkere Wirkung von 5-ASA
auf NFκB nachgewiesen werden (86) als in den Versuchen der Arbeitsgruppe von R. M. Schmid (84). Dennoch ist der Effekt von 5-ASA auf NFκB sehr gering und dürfte klinisch nur eine untergeordnete Rolle spielen. Im Gegensatz dazu ist die Beeinflussung von NFκB durch SASP von Bedeutung, weil die immunsuppressive Wirkung in therapeutisch erreichbaren Konzentrationen ausgelöst wird und diese sowohl bei der chronischen Polyarthritis als auch bei den entzündlichen Darmerkrankungen relevant ist. Die unterschiedliche starke Wirkung von SASP und 5-ASA auf NFκB könnte auch erklären, weswegen SASP, jedoch nicht die 5-ASA bei der chronischen Polyarthritis wirksam ist.
1.9 PAF als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten
Der Plättchenaktivierende Faktor (PAF) konnte in Biopsaten der Rektumschleimhaut von Patienten mit Colitis ulcerosa, nicht jedoch bei Patienten ohne entzündliche Darmerkrankungen nachgewiesen werden (87, 88). Das Calcium-Ionophor, (A23187) führte in Biopsien von Colitis ulcerosa Patienten zu einem 5 - fachen Anstieg der PAF-Konzentration im Vergleich zu Patienten ohne entzündliche Darmerkrankungen.
Mit SASP und 5-ASA, nicht jedoch mit SP gelang es, diesen Anstieg von PAF zu blockieren (87, 89).
1.10 Prostaglandin - Synthese als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten
Die Hemmung der Prostaglandinsynthese durch nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAID) war ein Meilenstein in der Therapie der chronischen Polyarthritis (90). Für die Therapie einer leichten bis mittelstarken Aktivität ist die antiinflammatorische und analgetische Wirkung von NSAID ausreichend (19). Aufgrund der fehlenden immunsuppressiven Wirkung der NSAID ist es nicht möglich, mit diesen Substanzen
Ulcerationen und Blutungen bis hin zu Vernarbungen mit Strikturen belegt (91-93).
Daher kann eine Hemmung der Prostaglandinsynthese durch NSAID bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen zu einem massiven Schub führen, so dass die Anwendung von NSAID bei diesen Patienten kontraindiziert ist (94). Es ist daher therapeutisch eher nachteilig, wenn SASP oder einer seiner Metabolite die Prostaglandinsynthese hemmen würde.
Abbildung 4.: Prostacycline, Thromboxane und Prostaglandine, Synthese und Wirkung
1.11 Thromboxansynthese als Angriffspunkt von SASP und seinen Metaboliten
Thromboxan (TxA2) ist ein potenter Stimulator der Plättchenaggregation und führt über seine vasokonstriktorische Wirkung zu einer Verminderung der Darmdurchblutung. SASP hemmt die Synthese von TxA2 in Zellhomogenaten aus
rektaler Mukosa (95). Außer den Thrombozyten synthetisieren auch Monozyten und Makrophagen erhebliche Mengen an TxA2, welches dann die lokale Entzündungsreaktion verstärkt. Thromboxan A2 hat eine Halbwertszeit von 30 Sekunden und wird schnell in das inaktive und messbare Thromboxan B2
umgewandelt.
1.12 Hemmung der Leukotriensynthese als Angriffspunkt für SASP und seinen Metaboliten
Leukotriene sind an der physiologischen Regulation des intestinalen Flüssigkeits- und Ionentransportes beteiligt (96). Außerdem spielen sie eine wichtige Rolle für die Regulation der Durchblutung der Magen- und Darmschleimhaut (96, 97). In der Kolonschleimhaut von Patienten mit einem akuten Schub einer Colitis ulcerosa wurden hohe Konzentrationen von Leukotrien B4 (LTB4) gemessen (98). Die Hemmung der Leukotriensynthese wird heute als einer der wichtigsten molekularen Angriffspunkte von SASP und 5-ASA für die Wirksamkeit bei den entzündlichen Darmerkrankungen angenommen (60). Leukotriene konnten auch in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit chronischen Polyarthritis nachgewiesen werden (99). Die LTB4-Konzentration korrelierte signifikant mit der Zellzahl, dem Rheumafaktor, und den Immunkomplexen in der Synovialflüssigkeit (100). Wir konnten durch die Messung von LTE4, dem Hauptmetaboliten der Cysteinyl-Leukotriensynthese im Urin, eine erhöhte Leukotriensynthese bei Patienten mit juveniler rheumatoider Arthritis nachweisen (101). Mit der gleichen Methode lies sich auch bei Patienten mit chronischer Polyarthritis eine aktivierte Leukotriensynthese nachweisen (102). Leukotriene werden im Unterschied zu den Prostaglandinen immer erst nach einer massiven Stimulation und nur durch vom Knochenmark freigesetzte Zellen (neutrophile Granulozyten, Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, Mastzellen, eosinophile und basophile Granulozyten) synthetisiert (Übersicht in (103, 104)).
Abbildung 5.: Leukotriene, Synthese und Wirkung
1.13 Synthese, Metabolismus und biologische Wirkung von Leukotrienen
Essentiell für die Synthese von Leukotrienen ist die Freisetzung von Arachidonsäure aus Zellmembranen durch die im Zytosol lokalisierte Phospholipase A2 (cPLA2) (105-107). Die Arachidonsäure ist das Ausgangssubstrat für die Synthese der Eicosanoide und auch Leukotriene (108). Wird die Zelle aktiviert und ist der damit einhergehende intrazelluläre Ca2+-Anstieg für eine Aktivierung der Ca2+-abhängigen Enzyme cPLA2 und der 5-Lipoxygenase (5-LO) ausreichend, so translozieren die cPLA2 (109) und der bi-funktionelle Enzymkomplex -bestehend aus 5-LO (110-112) und LTA4-Synthase sowie das 5-Lipoxygenase aktivierende Protein (FLAP) (113-115) an die Membran des Zellkerns oder des Golgi - Apparates. Während der
Translokation wird die 5-LO über eine Phosphorylierung aktiviert. Für eine vollständige Aktivierung der 5-LO sind neben Ca2+ auch ATP und zwei weitere zytoplasmatische Proteine notwendig (111). Neuere Forschungsergebnisse konnten auch zeigen, dass die Untereinheit p65 von NFκB ebenfalls an die 5-LO bindet. Es ist allerdings völlig unklar, wie die Aktivität der 5-LO über NFκB beeinflusst wird. Dass 5-LO und NFκB sich gegenseitig beeinflussen können, lässt sich aus experimentellen Modellen ableiten, die zeigen, dass die durch die aktivierte 5-LO entstehenden Sauerstoffradikale NFκB aktivieren können (116). An der Membran bindet der aktivierte Enzymkomplex, bestehend aus 5-LO und LTA4-Synthase an FLAP (113, 117), dessen Funktion wahrscheinlich darin besteht, diesen bifunktionellen Enzymkomplex an der Membran in der Nähe der cPLA2 zu arretieren um so einen optimalen Transfer der Arachidonsäure von der cPLA2 zur 5-LO zu gewährleisten. Das von der 5-LO aus der Arachidonsäure gebildete instabile Endoperoxid 5(S)-Hydroxy-6-trans-8,11,14-cis-eicosatetraensäure (5-HPETE) wird entweder durch eine Glutathion-Peroxidase zu dem biologisch inaktiven 5(S)-Hydroxy-6,8,11,14-eicosatetraensäure (5-HETE) oder durch die LTA4-Synthase zu 5(S)-Hydroxy-6trans-8,11,14-cis-eicosatetraensäure (LTA4) metabolisiert (Übersicht bei Samuelsson und Funk) (118). LTA4 ist der erste Metabolit mit den für die Leukotriene typischen 3 konjugierten Doppelbindungen. LTA4 ist ein extrem instabiler Metabolit, der je nach Zelltyp enzymatisch entweder durch eine LTA4-Hydrolase zu (5S,12R)-12-Dihyroxy-6,14-cis-8,10-trans-eicosatetraensäure (LTB4) (108, 119) oder durch eine Glutathion-S-Transferase (LTC4-Synthase) zu 5(S)-Hydroxy-6(R)-S-glutathionyl-7,9-trans-11,14-cis-eicosatetraensäure (LTC4) (120-122) metabolisiert werden kann.
Abbildung 6.: Synthese und Metabolismus von Leukotrienen
Das Metabolisierungsmuster von LTA4 ist Zelltyp-abhängig (Übersichtsarbeiten (103, 104, 123, 124). So synthetisieren neutrophile Granulozyten und Monozyten hauptsächlich LTB4. Makrophagen können sowohl LTB4 als auch LTC4 synthetisieren, während eosinophile und basophile Granulozyten sowie Mastzellen ausschließlich LTC4 synthetisieren (Übersicht in (125)). Von erheblicher Bedeutung ist auch ein transzellulärer Metabolismus, bei dem LTA4 z. B. durch Endothelzellen zu LTC4 und LTB4 metabolisiert werden kann (126-128). Dies ist insofern von Bedeutung, als Endothelzellen über keine 5-LO verfügen und damit selbst auch keine Leukotriene aus Arachidonsäure synthetisieren könnten.
LTB4 wird durch einen aktiven Transport aus der Zelle geschleust und entfaltet seine Wirkung durch die Bindung an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (129-131). LTB4 ist eines der potentesten endogen gebildeten Chemotaxine für neutrophile Granulozyten und dürfte somit eine wichtige Rolle in der Initialphase einer Entzündung spielen (132, 133). LTB4 wird sehr rasch durch neutrophile Granulozyten zu den biologisch inaktiven Metaboliten 20-OH-LTB4 und 20-COOH-LTB4 oxidiert (134) oder z.B. durch Mesangiumzellen oder Monozyten langsam zu zwei biologisch ebenfalls inaktiven Dihydro - Metaboliten reduziert (135-138). In der Leber werden alle LTB4-Metabolite vollständig durch ß-Oxidation metabolisiert (139).
LTC4 wird nach seiner Synthese durch ein ATP-abhängiges Transportprotein in den Extrazellulärraum transportiert, wo es durch die auf der Außenseite verschiedener Zellen lokalisierte γ-Glutamyltransferase reversibel zu dem biologisch noch aktiveren LTD4 metabolisiert wird (121, 122). In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass das Transportprotein für LTC4 zur Familie der Multidrug Resistance Proteine gehört (MDRP) und so letztlich die Funktion einer zellulären Detoxifizierung übernimmt (140-144). LTC4 und LTD4 entfalten ihre Wirkung nach der Bindung an G-Protein-regulierte Rezeptoren (145). Sie sind hochpotente Konstriktoren der glatten Bronchial- und Gefäßmuskulatur und erhöhen die Gefäßpermeabilität (133, 146-148). LTD4 wird irreversibel durch das Ectoenzym LTD4-Dipeptidase zu dem biologisch nahezu inaktiven LTE4 metabolisiert (Übersicht bei (139). LTE4 wird zu 20-OH-LTE4 und
1.14 Stimulation der Leukotriensynthese
1.14.1 Stimulation mittels dem Calcium-Ionophor (A23187)
Der stärkste zur Verfügung stehende Stimulus der Leukotriensynthese ist das Calcium-Ionophor (A23187). Diese Substanz wurde aus Kulturen von Streptomyces chartreusensis isoliert und hat antibiotische Eigenschaften. Seine Struktur wurde 1974 von Chaney et al. aufgeklärt und ist in Abb. 7. dargestellt. Es bildet einen für Ca2+-Ionen selektiven Kanal durch die Zellmembran. Calcium-Ionophor (A 23187) ist ein unspezifischer Stimulator der 5-LO, da alle Ca2+-abhängigen Reaktionen gleichermaßen stimuliert werden (Abb. 7.). Mit Hilfe von Calcium-Ionophor (A 23187) lässt sich somit die gesamte Enzymaktivität der 5-LO und das Vorhandensein der für die Leukotriensynthese notwendigen Co-Faktoren wie dem FLAP, ATP und zwei bisher nicht näher charakterisierte Proteinen untersuchen.
Abbildung 7.: Struktur von Calcium-Ionophor (A 23187) (152)
1.14.2 Stimulation der Leukotriensynthese mittels fMLP (153-155)
N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) ist ein synthetisches Analogon eines chemotaktischen Peptides aus der Membran gram-negativer Bakterien. fMLP bindet an einen spezifischen Rezeptor und führt zu einem Ca2+-Einstrom in die Zelle (Abb. 7.) (153-155). Der durch fMLP induzierte Ca2+-Einstrom führt in Monozyten von Menschen zu einer gut messbaren Leukotriensynthese. Im Gegensatz hierzu lässt sich in Granulozyten, die von Menschen isoliert wurden, keine Leukotriensynthese induzieren. Ob hierfür der Ca2+-Einstrom zu gering oder zu langsam erfolgt oder ob es zusätzliche Regulationsmechanismen gibt, ist zur Zeit unbekannt. fMLP kann jedoch bei neutrophilen Granulozyten Sauerstoffradikale und lysosomale Enzyme freisetzen.
Der Vorteil von fMLP im Vergleich zu Calcium-Ionophor (A 23187) besteht in der
Tatsache, dass die fMLP - stimulierte Leukotriensynthese durch zelluläre Regulationsmechanismen beeinflusst wird und sich dieser Effekt durch eine Änderung der Leukotriensynthese erfassen lässt.
2 Fragestellung
Bei der Behandlung der chronischen Polyarthritis ist SASP der 5-ASA therapeutisch überlegen. Die entzündungshemmende und immunsuppressive Wirkung von SASP ist jedoch begrenzt, so dass SASP mit anderen Basistherapeutika sowie mit Steroiden und NSAID bei der Therapie der chronischen Polyarthritis kombiniert werden muss.
Im Gegensatz dazu belegen klinische Studien, dass bei der Behandlung entzündlicher Darmerkrankungen die therapeutische Wirksamkeit von SASP und 5-ASA als äquivalent zu beurteilen ist. SASP und 5-ASA sind zur Induktion und zur Erhaltung der Remission bei entzündlichen Darmerkrankungen indiziert. Bei der Induktion der Remission dominiert das Bild der akuten Entzündung mit der Infiltration von neutrophilen Granulozyten in das Entzündungsgebiet. Die Wirksamkeit von SASP und 5-ASA ist im akuten Schub begrenzt und muss meistens durch Steroide oder andere Immunsuppressiva ergänzt werden. Dies belegt, dass sowohl die immunsuppressive als auch entzündungshemmende Wirkung von SASP erheblich schwächer ist als die der Glukokortikoide. Anders in der Remissionserhaltung bei der Therapie der Colitis ulcerosa. Hier ist es möglich mit einer Monotherapie mit SASP oder 5-ASA erfolgreich zu sein. In der Phase der chronischen Entzündung dominieren Monozyten und Makrophagen.
In den bisher durchgeführten In-vitro-Studien unterscheidet sich die Wirksamkeit von SASP und 5-ASA erheblich. Während durch SASP die meisten Entzündungsmediatoren stark vermindert werden, ist die Beeinflussung durch 5-ASA häufig nur geringfügig. Diese Unterschiede in der Wirksamkeit zwischen SASP und 5-ASA könnten durch die angewandten In-vitro-Modelle bedingt sein. So wurden die Untersuchungen zur Beeinflussung der Leukotriensynthese nahezu ausschließlich an neutrophilen Granulozyten durchgeführt, obwohl SASP und 5-ASA bei diesen Zellen nur bedingt wirksam sind. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Validierung der angewandten In-vitro-Modelle. So wird meist nicht untersucht, ob eine vollständige Hemmung der untersuchten Mediatoren bei einer maximalen Stimulation durch Calcium-Ionophor (A23187) überhaupt möglich ist.
In In-vivo-Studien wurde mittels Dialysebeutel, die im Rektum platziert waren, signifikant höhere Konzentrationen von LTB4, TxB2 und PGE2 bei Patienten mit Colitis ulcerosa und Morbus Crohn im Vergleich zu gesunden Probanden gemessen. Die erhöhte Konzentration von LTB korrelierte mit der Krankheitsaktivität bei Patienten
mit Morbus Crohn. Unter der Behandlung mit SASP oder 5-ASA wurden die Konzentration der Eicosanoide im Darm signifikant gesenkt.
Wir haben in der vorliegenden Arbeit folgende Fragestellungen untersucht:
1. Wie beeinflussen SASP, 5-ASA und SP die Leukotriensynthese in neutrophilen Granulozyten und Monozyten?
2. Wie stark ist die Beeinflussung der Leukotriensynthese durch SASP, 5-ASA und SP im Vergleich zu dem hochspezifischen Leukotriensynthese-Inhibitor MK 886?
3. Was könnte die Ursache für die geringere Wirksamkeit von 5-ASA im Vergleich zu SASP auf die Leukotriensynthese sein?
3 Material und Methoden
3.1 Verwendete Materialien, Pharmaka und Chemikalien
3.1.1 Zellpräparation- PBS-Puffer ohne Ca2+ (pH 7,4):
0,2 g/l KCl (Merck)
0,2 g/l KH2PO4 (Merck)
0,1 g/l MgCl2 6H2O (Merck)
8,0 g/l NaCl (Merck)
1,4 g/l Na2HPO4 2H2O (Merck)
- Hanks-Puffer (pH 7,0):
8,0 g/l NaCl (Baker)
0,4 g/l KCl (Merck)
0,3 g/l CaCl2 H2O (Merck) 0,1 g/l MgSO4 2H2O (Merck) 0,1 g/l MgCl2 6H2O (Merck) 0,08 g/l Ca2HPO4 2H2O (Riedel de Haen)
0,04 g/l KH2PO4 (Merck)
1,98 g/l Glucose (Merck)
1,0 g/l BSA (Serva)
NaHCO2 (Merck)
- Wasch-PBS-Puffer ohne Ca2+: Dem o.g. PBS-Puffer wurden 0,1% BSA beigefügt.
- EDTA Titriplex III (Merck) - Ficoll (Pharmacia)
- Plasmasteril (Fresenius AG, Bad Homburg) - Zentrifuge CR 412 (Jouan)
- Inkubationsschrank (Heraeus) - Färbungen : Trypan Blau (Merck) Türksche Lösung (Merck)
- Stimulator : Calcium-Ionophor (A23187) (Sigma-Chemie) Dimethylsulfoxid, DMSO (Merck)
N-Formylmethionylleucylphenylalanin, fMLP (Sigma) Cytochalasin B (Sigma)
3.1.2 Pharmaka
Name: Summenformel: MG: Firma:
Sulfasalazin C18H14N4O5S 398,4 Sigma 5-Aminosalicylsäure C7H7NO3 153,1 Sigma Sulfapyridin C11H11N3O2S 249,3 Sigma Salicylsäure C7H5O3Na 160,1 Sigma Gentisinsäure C9H11O4N 197,19 Aldrich MK 886 C27H33NO2CISNa 459,5 Merck
Sulfasalazin
5-{4-(2-Pyridylsulfamoyl)phenylazo}salicylsäure
5-Aminosalicylsäure Sulfapyridin
Salicylsäure Gentisinsäure
2-Hydroxybenzoesäure 2,5-Dihydroxybenzoesäure
MK 886
Abbildung 9.: Strukturformeln von Sulfasalazin, Sulfapyridin,
5-Aminosalicylsäure, Salicylsäure, Gentisinsäure und MK 886
3.1.3 Analytik
3.1.3.1 Hochleistungsflüssigkeits-Chromatograph:
Niederdrucksystem bestehend aus:
• 1 LKB-Pumpe
• Spectroflow 783-Detektor (Kratos) UV-Detektor
• C-R3A-Integrator (Shimadzu)
3.1.3.2 HPLC- Eluenten :
• Methanol (J.T.Baker)
• Acetonitril (J.T.Baker)
• Wasser (in HPLC-Qualität)
• Isopropanol (J.T.Baker)
• Essigsäure (J.T.Baker)
• Ammoniak (Merck)
• Phosphorsäure (Merck)
Alle Substanzen waren in HPLC-Qualität.
3.1.3.3 Radio – Immuno – Assay für die Bestimmung von TxB
2:
- Szintillator: - Rotiszint ecoplus 0016 (Roth)- Counter: - 1211 Rackbeta (LKB Wallac)
Isolation der Monozyten, Entfernen der Lymphozyten (3.2.1.2.)
⇓
3.2.1.1 Blutentnahme
Vor der Blutentnahme wurden 4 Bluecups mit je 60 mg EDTA und 10 ml PBS vorbereitet. 80 ml Blut wurden bei gesunden 20 bis 40-jährigen Probanden, die eine Woche vorher keine Medikamente eingenommen hatten, aus der Cubitalvene abgenommen. Das Blut wurde auf die 4 Bluecups gleichmäßig verteilt und vorsichtig geschwenkt.
3.2.1.2 Isolation der Monozyten
Entfernen der Thrombozyten :
Die Proben wurden bei 1000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, danach wurde der Überstand vorsichtig abgenommen und bei 3000 rpm für 10 Minuten bei 10°C erneut zentrifugiert. Das Erythrozytenkonzentrat wurde bis nach dem Zentrifugiern auf Eis gestellt. Der abzentrifugierte Überstand wurde vorsichtig wieder mit den Erythrozyten vermischt. Die abzentrifugierten Thrombozyten wurden verworfen.
Dieser Vorgang wurde nochmals wiederholt.
Isolation der Monozyten / Lymphozyten Population :
8 Bluecups wurden mit je 10 ml Ficoll gefüllt und dann gleichmäßig mit dem vermischten Erythrozyten / Überstand überschichtet und bei 3300 rpm für 30 Minuten bei 10°C zentrifugiert. Nach 30 Minuten befand sich zwischen der obersten Schicht und Ficoll eine milchig-weiße Schicht (Monozyten / Lymphozyten-Layer). Dieser Layer wurde mit einer Pasteur-Pipette abgenommen und auf 4 Bluecups verteilt.
Die Bluecups wurden mit Wasch-PBS aufgefüllt und bei 1500 rpm für 15 Minuten bei 10°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert. Die Zellen wurden mit einer 1 ml Eppendorf-Pipette vorsichtig in 2 ml Wasch-PBS resuspendiert und das Bluecup bis auf 50 ml mit Wasch-PBS aufgefüllt und geschwenkt. Dieser Vorgang wurde nochmals wiederholt. Nach dem Zentrifugieren wurden die Zellen vorsichtig in 10 ml Hank`s aufgenommen.
3.2.1.3 Zellzahl und Verteilung:
20 µl dieser Zellsuspension wurden mit 20 µl Trypan Blau angefärbt und in der Neubauer-Zählkammer ausgezählt.
Berechnung:
Zellzahl = 16 x 2 x 10000 x 10
16 = Anzahl der Quadrate der Zählkammer 2 = Verdünnungsfaktor durch Färbung 10000 = Volumen der Zählkammer (10-4 ml)
10 = Aufnahmevolumen der Zellen in Hank`s Puffer
10 = Aufnahmevolumen der Zellen in Hank`s Puffer