dem Institut für Experimentelle Unfallchirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover
Verhalten von neutrophilen Granulozyten nach Thoraxtrauma und Marknagelung
INAUGRAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Veterinärmedizin ( Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Oliver Harms
aus Hamburg
Hannover 2008
Tierärztliche Hochschule Hannover
Univ. - Prof. Dr. Dr. habil. M. van Griensven Medizinische Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. M. Fehr 2. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. M. Ganter
Tag der mündlichen Prüfung: 10.11.2008
Für Anna und Leo
und meinen Vater
2. Literaturübersicht... 10
2.1 Historische Übersicht ... 10
2.2 Die Fettembolie... 11
2.3 Marknagelung mit Bohrung verglichen mit Marknagelung ohne Bohrung ... 12
2.4 Mechanismen der pulmonalen Schädigung ... 13
2.5 Die inflammatorischen Mediatoren... 13
2.6 Einfluss der Femurnagelung auf die Immunantwort... 16
2.7 Kurzfassung ... 17
3. Material und Methode... 18
3.1 Versuchstiere ... 18
3.2 Versuchstiergruppen ... 18
3.3 Versuchsprotokoll... 19
3.3.1 Versuchstiervorbereitung... 19
3.3.2 Bronchoalveoläre Lavage (BAL)... 20
3.3.3 Blutproben ... 21
3.3.4 Thorakotomie und Lungenkontusion ... 21
3.3.5 Osteosyntheseverfahren ... 21
3.3.6 Histologische Proben... 22
3.4 Untersuchungen... 23
3.4.1 Pulmonalkapilläre Permeabilität ... 23
3.4.2 Polymorphkernige Leukozyten (PMNL) Aktivitätskapazität ... 23
3.4.3 Gerinnungsparameter... 24
3.4.3.1 Fibrinogen ………...25
3.4.3.2 Faktor V………..25
3.4.3.3 Antithrombin III………..25
3.4.3.4 D–Dimere………...26
3.4.4 Histologie... 26
3.5. Statistik ... 27
4.3.Fibrinogen ... 32
4.4. Faktor V ... 34
4.5. Antithrombin III... 36
4.6. D-Dimere... 39
4.7. Histologie ... 42
4.7.1. PMNL Diapedese ... 42
4.7.2. Interstitielle Verdickung der Lunge ... 44
5. Diskussion ... 47
6. Zusammenfassung... 52
7. Summary ... 53
8. Literaturverzeichnis... 54
9. Anhang ... 71
ARDS Adult respiratory distress Syndrom AT III Antithrombin 3
BAL Bronchoalveoläre Lavage CD Cluster of Differentiation
cm Zentimeter
cm2 Quadratzentimeter
CO2 Kohlendioxid
dl Deziliter
EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Azetat
EKG Elektrokardiogramm
Fa. Firma
FES Fett-Embolie-Syndrom Fix ex Fixateur externe
HLA-DR Humanes Leukozytenantigen-System mit Isotyp Bezeichnung
IgG Immunglobulin G
IL Interleukin
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
l Liter
mm Millimeter
mmHg Druck, den ein Milimeter einer Quecksilbersäule ausübt
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
MOV Multiorganversagen
MW Mittelwert
µg Mikrogramm
n Anzahl
OS Osteosynthese
O2 Sauerstoff
p Irrtumswahrscheinlichkeit PMNL Polymorphkernige Leukozyten
RFN Reamed femoral nailing = aufgebohrte Marknagelung RIA reaming, irrigation, aspiration
STAWN Standardabweichung
UFN Unreamed femoral nailing = Unaufgebohrte Marknagelung U/P Ratio Urea=Harnstoff/Protein Ratio
% Prozent
°C Grad Celcius
> größer als
< kleiner als
1. Einleitung
Als eine der häufigsten Methoden zur Versorgung einer Femurschaftfraktur, gilt die intramedulläre Nagelung. Neben deren Vorteile, stellt die Intravasation von Knochenmarkfett in die Lunge eine der Hauptkomplikationen dar. In der Folge können kardiorespiratorische und systemische Komplikationen auftreten (HARMAN u. RAGAZ 1950; GURD 1970; GURD u. WILSON 1974; WENDA et al. 1988; PAPE et al. 1991; HAUSMAN u. HUDABIUNIGG 1994; MÜLLER et al. 1994; HEIM et al.
1995; KRATOCHWILL et al. 1995; JOHNSON u. LUCAS 1996; HOFMANN et al.
1999). Bereits im 19. Jahrhundert wurde die Fettembolie in Lungengefäßen als Krankheitsbild bei einem Patienten, der nach einem Trauma verstorben war, beschrieben (ZENKER 1862). Ende der sechziger Jahre wurde die Fettembolie und ein daraus resultierender Komplex als Fett-Embolie-Syndrom (FES) beschrieben (PELTIER 1969, 1988; GURD 1970; GURD u. WILSON 1974; WENDA et al. 1993;
PELL et al. 1993; KRATOCHWILL et al. 1995; HOFMANN et al. 1999). Beim Menschen kann das FES zu schweren Lungenfunktionsstörungen führen, die als das adult respiratory distress syndrome (ARDS) bekannt sind und zum Tod führen können (PELL et al. 1993). Polytraumatisierte Patienten, insbesondere die an einer zusätzlichen Lungendysfunktion, z. B. Lungenkontusion im Rahmen eines Thoraxtraumas leiden, sind besonders gefährdet (WENDA et al. 1990; PAPE et al.
1991; HUGHES et al. 1993; WELLER 1993; HAUSMANN u. HUDABIUNIGG 1994;
MÜLLER et al. 1994; WOZASEK et al. 1994; HEIM et al. 1995; KRATOCHWILL et al.
1995; JOHNSON u. LUCAS 1996; DUWELIUS et al. 1997; KRÖPFL et al. 1997;
SCHEMITSCH et al. 1997; HOFMANN et al. 1999; HERSCOVICI et al. 2000). Die Ätiologie der Fettembolie war Mittelpunkt vieler Studien. Wie die Untersuchungen von HOFMANN et al. (1999) zeigen, kann jede Erhöhung des intramedullären Drucks zu einer Intravasation von Markraumbestandteilen führen. Mögliche Ursachen dieser Druckerhöhungen stellen instabile Frakturen oder das Einführen von Instrumenten, Osteosyntheseimplantaten, Bohrungen oder Knochenzement in den Markraum dar
medullären venösen Sinus gepresst (HOFMANN et al. 1999). Aus der Markraumhöhle werden Mikroemboli über das venöse System und das Herz in die Lungengefäße transportiert. Dort kommt es zu einer Obstruktion der Kapillaren, welches zu erhöhtem pulmonalen arteriellen Druck und schließlich zur Herzdekompensation führen kann. Bei der Pathogenese von FES und ARDS als ein komplexes Phänomen, sind mechanische, inflammatorische, zelluläre und humorale Faktoren sowie die Aktivierung der Gerinnungskaskade beteiligt (WENDA et al.
1990; MÜLLER et al. 1992, 1994; HAUSMANN u. HUDABIUNIGG 1994; HEIM et al 1995; JOHNSON u. LUCAS 1996; PAPE et al. 1998; HOFMANN et al. 1999).
Entlang eines chemotaktischen Gradienten migrieren die neutrophilen Granulozyten in das Zielgewebe. Bei Polytrauma wird eine verringerte Apoptose der neutrophilen Granulozyten beobachtet, was darauf hindeutet, dass die neutrophilen Granulozyten länger überleben und somit zu einer Lungenschädigung beitragen können (ERTEL 1997; JIMENEZ 1997).
Die vorliegende Arbeit untersucht, ob die durch herkömmliche Osteosyntheseverfahren verursachten Effekte auf die systemische inflammatorische Antwort, die Aktivierung der Gerinnungskaskade und die pulmonale Permeabilität durch die Anwendung eines neuen Bohrsystems, welches bohren, saugen und spülen vereint, vermindert werden kann. Darüber hinaus wird der Einfluss bei einer vorhandenen Lungenkontusion untersucht.
2. Literaturübersicht
2.1 Historische Übersicht
Bevor man im letzten Jahrhundert mit der osteosynthetischen Frakturversorgung begann, galt die Fettembolie als ein bekanntes Phänomen. Verschiedene ätiologische Theorien, u.a. die Ausschüttung humoraler Mediatoren wie Thromboxan, toxische Effekte und Veränderungen in der Gerinnungskaskade wurden damals postuliert (BRADFORD et al. 1970; BAKER et al. 1971; MEEK et al. 1972; WATKINS et al. 1982). Bis in die siebziger Jahre des letzten Jahrhunderts war die zweithäufigste, nicht akute Todesursache nach dem Trauma, das Fett–Embolie–
Syndrom. Frakturen wurden durch Traktion behandelt, die Häufigkeit von Fettembolien wurde allerdings nicht reduziert (GORIS et al. 1982). Mehrere Autoren konnten zeigen, dass die frühzeitige Frakturversorgung der Schlüssel zur Vermeidung einer Fettembolie ist (HURTER 1970; RISKA et al. 1976; COPPOLA u.
ANZEL 1983; SEIBEL et al. 1985).
Erstmals wurde der Zusammenhang zwischen intramedullärer Nagelung und dem Auftreten einer Fettembolie von PELTIER 1952 dokumentiert. Dennoch dauerte es bis in die achtziger Jahre des letzten Jahrhunderts, dass der pulmonalen Komplikationen vermehrte Aufmerksamkeit geschenkt wurde. In einer Studie von ECKE et al. (1985) wurden die Daten von 1127 Patienten mit Femurschaftfrakturen ausgewertet. Die Studie weist auf ein hohes Auftreten pulmonaler Komplikationen bei unter 30 Jahre alten Patienten hin, wenn diese mit einer primären aufgebohrten Marknagelung operativ versorgt wurden. Eine Fettintravasation aus dem Markraum wurde als Hauptursache für die pulmonalen Dysfunktionen angenommen.
Anfang der neunziger Jahre des letzten Jahrhunderts erschienen viele Publikationen mit unterschiedlichen Ergebnissen, besonders bei Patienten mit Thoraxtraumata. Die frühe Versorgung einer Femurfraktur durch eine aufgebohrte Marknagelung führte häufig zum ARDS mit erhöhter Mortalität (REIKERAS 1987; NAST-KOLB et al. 1990;
dass nicht die Methode, sondern die Brustverletzung die Häufung von ARDS und Mortalität bedingt (BONE et al. 1995, 1998). Zahlreiche klinische Studien haben sich mit dieser Fragestellung befasst und weitere Publikationen in der Molekularmedizin verweisen auf das inflammatorische System in der Pathogenese des ARDS und des Multiorganversagens (MOV) (GRANGER u. KUBES 1994; MOORE u. MOORE 1995;
GIANNOUDIS et al. 1999b). Neue Möglichkeiten, biochemische Wege zu detektieren und zu messen, wurden entwickelt und das Wissen um die immuninflammatorischen Antworten des Körpers wurde immens ausgeweitet. Es hat sich gezeigt, dass eine Kaskade der inflammatorischen Reaktion direkt nach dem Trauma in Gang gesetzt wird (GIANNOUDIS et al. 1998b) und die Marknagelung diese Reaktion verstärken kann (PAPE et al. 1994).
Die systemischen Effekte der Femurmarknagelung werden im folgenden beschrieben.
2.2 Die Fettembolie
Als potentielle Nachteile der aufgebohrten intramedullären Marknagelung gelten die systemischen Effekte, die man dem erhöhten intramedullären Druck und der Fettembolisation zuschreiben kann, wie dies KÜNTSCHER (1950) erstmals beschrieb. Zur gleichen Zeit beobachten auch andere Autoren unerwartete Nebenwirkungen bei Patienten nach aufgebohrter Femurmarknagelung (WATSON et al. 1950; PELTIER 1952). Es gibt Belege, dass eine Instrumentation der Markraumhöhle eine Intravasation von Knochenmarkfett zur Folge hat. Blutproben, die aus der Femoralisvene während der Femurbohrung entnommen wurden, enthielten Markraumbestandteile (DANCKWARDT-LILLIESTROM 1969).
Untersuchungen an einem Patienten, der nach bilateraler aufgebohrter Femurnagelung verstorben war, zeigten Knochenmarkfett in Lunge, Nieren und Gehirn (GIANNOUDIS 1999a). BAUMER et al. (1989) beschrieben einen weiteren Fall von intraoperativer Fettembolie während bilateraler aufgebohrter Femurnagelung, bei dem eine gelbe ölige Flüssigkeit aus dem Trachealtubus des Patienten abgesaugt wurde. Während der intraoperativen Echographie kann auch eine Intravasation von Fett in Lungengefäße nachgewiesen werden (PELL et al.
1993; AOKI et al. 1998). Etliche Mechanismen für die systemische Intravasation von Fett werden vermutet. Die Erhöhung des intramedullären Drucks während der Nagelung wird von vielen Publikationen bestätigt, experimentell wurden Drücke über 300 mmHg am Femur gemessen (STURMER 1993). In einem Modell mit Schafstibiae wurden Drücke um die 1000 mmHg gemessen (STURMER u.
SCHUCHARDT 1980). Bei Patienten mit Femurfrakturen wurden Drücke von 140 bis 830 mm Hg beschrieben (WENDA et al. 1988). Andere Autoren erklären sich die Komplikationen durch einen Shunt zwischen dem arteriellen und venösen Gefäßsystem und vermuten, dass ein Anstieg im intramedullären Druck dieses Gleichgewicht stört (TOTHILL et al. 1987). Möglicherweise ist es eine Kombination all dieser Überlegungen, die eine Intravasation von Fett in die Zirkulation bewirken.
2.3 Marknagelung mit Bohrung verglichen mit Marknagelung ohne Bohrung
Die Bedenken aufgrund der Fettembolisation durch Markraumbohrung führt zur Verwendung dünnerer Nägel, die ohne Markraumbohrung eingebracht werden können. Verschiedene Autoren haben versucht, den Grad der Fettembolisation bei den beiden Techniken zu quantifizieren. NEUDECK et al. (1994) untersuchten den intramedullären Druck bei aufgebohrter und unaufgebohrter Marknagelung sowie bei der Plattenosteosynthese an einer experimentell herbeigeführten Fraktur am Schaffemur. Allerdings ergaben sich bei aufgebohrter wie auch bei unaufgebohrter Marknagelung keine Unterschiede im Druckanstieg. Die Plattenosteosynthese verursachte hingegen keinen nennenswerten Anstieg des intramedullären Drucks.
KRÖPFL et al. (1997) verweisen darauf, dass das Einbringen eines unaufgebohrten Marknagels mit einem signifikanten Anstieg des intramedullären Drucks verbunden ist. Die selben Autoren berichten von einem signifikanten Unterschied zwischen unaufgebohrter Marknagelung und aufgebohrter Marknagelung. Zudem verweisen sie darauf, dass die Knochenmarkintravasation bei der unaufgebohrten Marknagelung weniger häufig als in der aufgebohrten Marknagelung bei Femurfrakturen auftritt.
(COLES et al. 2000). Andere betonen einen unterschiedlichen Anstieg in Ausmaß und Anzahl der Embolie nach aufgebohrter Marknagelung (WENDA et al. 1993).
2.4 Mechanismen der pulmonalen Schädigung
Eine Embolisation von Knochenmark in die Lunge führt zur Obstruktion der pulmonalen Gefäße und Schädigung der Lunge. In experimentellen Studien am Tier wurden Drücke von 300 bis 400 mmHg in der intakten Femurmarkhöhle erzeugt, danach zeigten Blutproben aus der Vena cava caudalis Emboli aus Knochenmarkfett und Thrombozyten mit einer Größe von bis zu drei Zentimeter (NERLICH u.
NERLICH 1985). Als pathogenetisch bedeutsam wurde der hohe Gehalt an Thromboplastin im Knochenmark, welches zur Agglutination von Thrombozyten und Fett beiträgt, vermutet (STRECKER et al. 1993). Daneben wurden Veränderungen des pulmonalen arteriellen Druckes (PAPE et al. 1992) und die Aktivierung eines alternativen Weges der Koagulation durch zerstörte Fettzellen und Knochenmarksraumdebris aufgeführt (PAPE et al. 1998). Allerdings scheinen diese Mechanismen nicht auszureichen, um die auftretenden Veränderungen zu erklären.
Desweiteren wurden nachteilige Effekte von Fett innerhalb der Lunge postuliert, so favorisieren einige Autoren die Idee, dass der toxische Einfluss von Fett zu pulmonalen Endothelschäden führen kann (MANNING et al. 1983). Dokumentiert war, dass Fett zu Triglyceriden abgebaut werden kann und diese die alveoläre Architektur beschädigen können (PELTIER 1955). Andere Autoren vermuten, dass der durch eine Hypoxie verursachte Endothelschaden zur Freisetzung humoraler Mediatoren führt, was dann die Lungenfunktion verschlechtert (MONCADA u. VANE 1980).
2.5 Die inflammatorischen Mediatoren
JAKOBOVITZ-DERKS und DERKS (1979) untersuchten die zeitliche Abfolge von pulmonalen morphologischen Veränderungen nach Fettinfusion beim Hund. Sie konnten multiple Hinweise für eine Invasion inflammatorischer Zellen in das
pulmonale Gewebe sowie Anzeichen für eine erhöhte pulmonale Permeabilität feststellen.
Auch ein traumatischer Insult stellt einen inflammatorischen Zustand her. Innerhalb dieses Prozesses existiert ein feines Gleichgewicht zwischen heilsamen Effekten der Entzündung und dem Potential, dass dieser Prozess Gewebeschäden hervorruft, die letztendlich zum ARDS und MOV führen können. Wahrscheinlich sind die wichtigsten Bestandteile der Körperabwehr in diesem Prozess die Cytokine, die Leukozyten, das Endothel und deren Interaktionen (GRANGER u. KUBES 1994). Außerdem spielen reaktive Sauerstoffradikale, Eicosanoide und Störungen in der Mikrozirkulation eine wichtige Rolle (CIPOLLE et al. 1993). In der Pathogenese der Lungenschädigung und der systemischen Organschädigung kommt den inflammatorischen Zellen die größte Bedeutung zu. So zeigten Untersuchungen der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit bei Patienten mit ARDS eine erhöhte Anzahl von neutrophilen Granulozyten und deren schädigenden Substanzen, wie die Elastase (IDELL et al.
1985). Desweiteren ergaben Autopsien von Patienten, die an ARDS gestorben waren, dass eine hohe Anzahl von neutrophilen Granulozyten in der Mikrozirkulation der Lunge sequestriert waren (ORELL 1971). Hydrogenperoxide, die man in der Ausatemluft von Patienten mit ARDS nachweisen konnte, stammen wahrscheinlich von aktivierten inflammatorischen Zellen innerhalb der geschädigten Lunge (RIEDE et al. 1978; BALDWIN et al. 1986). Zudem werden eine erhöhte Superoxid- und Hydroxyl-Radikalen-Produktion für den veringerten Gasaustausch verantwortlich gemacht (RIVIKIND et al. 1991). Auch Tiermodelle mit akuter Lungenschädigung verursacht durch Endotoxine, Bakterien, Hyperoxie und Mikroembolisation haben die große Bedeutung der neutrophilen Granulozyten gezeigt (ST JOHN et al. 1991). So vermindert eine Verringerung der Neutrophilen vor dem traumatischen Insult die Lungenschädigung (STEPHENS et al. 1988). Es konnten die Fett induzierten Lungenschäden durch Neutropenie verhindert werden (BALK et al. 1988;
ANDREASSON et al. 1989; DOERSCHUK et al. 1989). Isolierte humane mit Ölsäure versetzte neutrophile Granulozyten zeigten einen Anstieg der CD11b Expression auf der Zelloberfläche (MASTRANGELO et al. 1998). Dies führt zu der Annahme, dass
wesentlichen Faktoren für den Anstieg der polymorphkernigen Leukozyten ist (MASTRANGELO et al. 1998). Lipidmediatoren, wie das Leukotrien B4 führen ebenfalls zu einem CD11b Anstieg und geben das Signal für die gleichzeitige Freisetzung von Elastase und Superoxiden in humanen neutrophilen Granulozyten, was die Stimulationskraft der Fettmediatoren auf die polymorphkernigen Leukozyten unterstützt (PARTRICK et al 1997). Damit scheint der kritische Punkt in der Entwicklung des Lungenschadens in der Adhäsion der Neutrophilen mit dem Endothel zu liegen. Die Applikation von Cyclooxygenasehemmern, wie z.B.
Ibuprofen, führt zur Reduktion von Prostaglandinen und somit zu einer Reduzierung der Lungenschädigung im Tiermodell (CAREY et al. 1991). Auch die Gabe von monoklonalen Antikörpern gegen CD11b und CD18 Komponenten des Adhäsionsrezeptorkomplex von neutrophilen Granulozyten mit dem Endothel verringert die Lungenschädigung signifikant (WALSH et al. 1991).
Die durch die Intravasation von Fett hervorgerufene Obstruktion der Mikrozirkulation und die inflammatorische Reaktion sollen die Neutrophilenkinetik modifizieren und somit günstige Bedingungen für die durch neutrophile Granulozyten vermittelte Schädigung der Lunge schaffen (DOERSCHUK et al. 1989). In gesunden Lungengefäßen zirkulieren die neutrophilen Granulozyten am Rand oder entlang der Gefäßwand, da nur schwach adhäsive Kräfte vorhanden sind (DOERSCHUK et al.
1989). Dieses Marginationsphänomen wurde anhand von Untersuchungen an postkapillären Venulen des systemischen Gefäßbettes gezeigt (MACNEE u. SELBY 1990). Dennoch weist einiges darauf hin, dass die pulmonale Zirkulation einzigartig ist, da sich die Mehrzahl der neutrophilen Granulozyten der Lunge in den Kapillaren befindet (MACNEE u. SELBY 1990). Videomikroskopische Untersuchungen der subpleuralen pulmonalen Zirkulation bei Hunden beweisen den Aufenthalt der neutrophilen Granulozyten im Kapillarbett und nicht in den postkapillären Venulen (LIEN et al. 1987). WORTHEN et al. (1989) veränderten die Steiffigkeit der neutrophilen Granulozyten durch deren Aktivierung oder durch pharmakologische Zerstörung des Cytoskeletts und zeigten dadurch die veränderte Fähigkeit der neutrophilen Granulozyten, durch fünf µm große Filter zu passieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die physikalischen Hemmnisse des pulmonalen Kapillarbetts, die Steifheit des Cytoskeletts der neutrophilen Granulozyten und die
Adhäsionsmechanismen eine Rolle in der Kinetik der frühen neutrophilen Antwort bei Lungenschädigungen spielen und im weiteren Verlauf zu Organdysfunktionen führen können (HARLAN 1987). Die Adhäsion der neutrophilen Granulozyten an und die Migration durch das Endothel wird gekennzeichnet durch „Rolling, „Attachment“
(Aggregation) und „Diapedesis“(Transmigration). Beim „Tethering“ und „Rolling“
kommt es zu einer transienten Adhäsion der neutrophilen Granulozyten mit dem Endothel (Anderson 1987; Springer 1990; Butcher 1991). Danach kommt es zu einem abstoppen („attchment“) der neutrophilen Granulozyten auf den Endothelzellen, was zu einem stabilen Zell-Zellkontakt führt (VAN GRIENSVEN 1999).
2.6 Einfluss der Femurnagelung auf die Immunantwort
In einer Gegenüberstellung bezüglich der Ausschüttung von inflammatorischen Mediatoren wurden die Auswirkungen der primären Marknagelung am Femur auf die Lungenfunktion nach aufgebohrter und unaufgebohrter Marknagelung untersucht (PAPE et al. 1993b). Ein signifikanter Anstieg der Konzentration von Elastase im venösen Blut zeigte sich während der aufgebohrten Marknagelung, verbunden mit einer Aktivierung der polymorphkernigen Leukozyten, gemessen durch die Cheminolumineszenz. In einer weiteren Studie wurde die Nagelung als „second hit“, das initiale Trauma als „first hit“ bezeichnet (GIANNOUDIS et al. 1999a). Dabei wurden sowohl bei der aufgebohrten als auch bei der unaufgebohrten Marknagelung ähnliche Ergebnisse hinsichtlich der Elastaseausschüttung, der Neutrophilenaktivität, IL-6 und der Expression von Adhäsionsmolekülen festgestellt. Andere Autoren untersuchten die immunsuppressiven Auswirkungen der Marknagelung, indem sie die IL-10 Ausschüttung sowie die Expression von HLA-DR auf mononuklearen Zellen untersuchten (SMITH et al. 2000). Sie stellten fest, dass die aufgebohrte Marknagelung mit einer größeren Beeinträchtigung der Immunantwort verbunden ist als die unaufgebohrte Marknagelung.
In Tierstudien an Ratten wurden die Auswirkungen einer Femurfraktur sowie der
Permeabilität führt, wohl aber die Fraktur und die Fixation zusammen (WILLIS et al.
1999).
2.7 Kurzfassung
Zusammenfassend bleibt festzustellen, dass die pulmonale Gefäßobstruktion, die nach einer intramedullären Nagelung auftreten kann, nicht allein für die Lungenschädigung verantwortlich ist. Vielmehr sind zahlreiche systemische Parameter aktiviert, die zusammen die Fähigkeit haben, die Lunge zu schädigen.
Darüber hinaus weisen Cofaktoren wie Volumendefizit, Schock und Lungenkontusion einen synergistischen Effekt auf. In der Folge kommt es schneller zu einer irreversiblen Schädigung. Desweiteren spielen die individuellen Gegebenheiten des einzelnen Patienten eine wichtige Rolle. So belegen Publikationen unterschiedliche, posttraumatische Komplikationen bei Patienten mit gleicher Verletzungsschwere und gleichen Risiken (GUILLOU 1993).
3. Material und Methode
3.1 Versuchstiere
Die Untersuchungen wurden an 48 weiblichen Merinolämmern mit einem mittleren Körpergewicht von 35 kg und einem durchschnittlichen Alter von einem halben Jahr durchgeführt. Bei der Einstallung der Tiere wurde von jedem Schaf eine Kotprobe auf Endoparasiten untersucht und eine Entwurmung mit Febendazol (Panacur®, Intervet, Unterschleißheim) 2,5%ig durchgeführt. Zwei Tage vor Beginn der Versuche wurden die Tiere aus der Herde (Weidehaltung) isoliert und in Einzelboxen auf Stroh untergebracht. Vor der Operation wurde eine zwölfstündige Nahrungskarenz eingehalten. Alle Schafe waren klinisch gesund. Sie zeigten eine physiologische Wasser- und Futteraufnahme. Die Versuche wurden durch die Bezirksregierung Hannover genehmigt (Tierversuchsnummer 504-42502-02/512).
3.2 Versuchstiergruppen
Die 48 Merinoschafe wurden in zwei Hauptgruppen (Lungenkontusion und Kontrollgruppe) mit jeweils vier Untergruppen eingeteilt (Tabelle 1). In der Kontrollgruppe wurde eine Thorakotomie und die unterschiedlichen Osteosyntheseverfahren (Fixateur Externe (Fix ex), unaufgebohrte Femurnagelung (UFN), aufgebohrte Femurnagelung (RFN) sowie die aufgebohrte Marknagelung mit dem neuen Bohrsystem (RIA)) durchgeführt. In der Kontusionsgruppe wurde die Lunge zusätzlich vor Durchführung der selben Osteosyntheseverfahren komprimiert.
Kontrollgruppe Kontusionsgruppe
Osteosynthese Anzahl (n) Osteosynthese Anzahl (n)
Fix.Ex. 6 Fix.Ex. 6
RFN 6 RFN 6
UFN 6 UFN 6
RIA 6 RIA 6
Tabelle 1: Einteilung der Versuchstiere in Gruppen und Methode der angewendeten Manipulation am Femur. Fix.Ex.: Fixateur externe; RFN: reamed femoral nailing
=aufgebohrte Marknagelung; UFN: unreamed femoral nailing = unaufgebohrte Marknagelung; RIA: reaming, irrigation, aspiration)
3.3 Versuchsprotokoll
3.3.1 Versuchstiervorbereitung
Am Morgen des Versuchstages wurden die Schafe mit einem venösen Katheter zur Blutentnahme und zur Narkoseinduktion ausgestattet. Dazu wurde die Vena jugularis externa sinistra nach Rasur und Desinfektion punktiert und ein Jugulariskatheter (Cava-fix, 1,2x1,7 mm, 50 cm lang, Fa. Braun, Melsungen) platziert. Die Prämedikation wurde mit Propofol (4 mg/kg KGW; Klimofol®, IVAmed, Mannheim) und 0,01 mg/kg KGW Buprenorphin (Temgesic®, Essex, München) durchgeführt.
Nach Eintritt der Intubationsfähigkeit wurden die Tiere mit einem Trachealtubus (CH 36; Fa. Mallinckrodt, Burgwedel) intubiert. Um eine Tympanie zu verhindern, wurde
eine weitlumige Sonde aus Kunststoff (Boschrohr, Teleflex Medical GmbH, Kernen, Innendurchmesser 10 mm, Außendurchmesser 15 mm) in den Vormagen oral eingeführt. Im weiteren Verlauf wurde die Anästhesie mittels eines Sauerstoff- Isofluran-Gemisches fortgeführt. Dazu schloss man die Tiere an ein volumengesteuertes Beatmungsgerät (Romulus 19, Dräger Werke, Lübeck) an. Das Beatmungsgemisch bestand dabei aus 1,8 l/min Sauerstoff und 0,8 % Isofluran. Die Atemfrequenz betrug 14/min mit einem Atemzugvolumen von 450 ml. Nach erfolgtem Hautschnitt wurden neben der Arteria carotis communis, die Arteria carotis communis dexter und die Vena jugularis externa dextra freipräpariert. Zur kontinuierlichen Kontrolle des arteriellen Blutdruckes wurde ein ca. 15 cm langer Silikonkatheter (Down Corning Silastics Medical Grade Tubing, Nr. 602-285, Fa.
Down Corning Medical Products, Midland, USA) in die Arteria carotis communis implantiert. Ein gleichartiger Katheter wurde in die Vena jugularis externa dextra platziert. Zur Volumensubstitution (10 ml/kg/h) wurde Ringer Lactat Infusionslösung (Fa. Braun, Melsungen) verwendet. Kontinuierliche EKG-, inspiratorische und exspiratorische O2- und CO2- sowie Puls- und Blutdruckkontrollen wurden durchgeführt.
3.3.2 Bronchoalveoläre Lavage (BAL)
Zur Bestimmung der Basiswerte in den Thorakotomiegruppen und den Kontusionsgruppen wurde zunächst eine BAL durchgeführt. Auf den Tubus wurde ein Verbindungsstück (Portex, Altdorf) aufgesetzt, welches das Einführen des Bronchoskops (Olympus-BF 1T10, New York, USA) bei fortwährender Beatmung erlaubte. Unter leichter Anästhesie (Isofloran) wurde das Bronchoskop in einen Bronchus vierter Ordnung des Lobus caudalis der rechten oder linken Seite vorgeschoben. Der durch das Bronchoskop nach tracheal verschlossene Bronchus (sog. Wedge-Position) wurde durch Injektion von 60 ml steriler 0,9 %iger NaCl- Lösung (Fa. Braun, Melsungen) und sofortiges Absaugen durch das Bronchoskop derselben gespült. Durchschnittlich wurden 70% der injizierten Flüssigkeitsmenge
Lavagen nicht zu beeinträchtigen, wurden verschiedene Segmente beider Seiten ausgesucht. Die durch die BAL gewonnene Flüssigkeit wurde über 10 Minuten mit 350 g bei einer Temperatur von 10°C zentrifugiert (Allegra 6KR Centrifuge, Beckmann Coulter, USA).
3.3.3 Blutproben
Nach Durchführung der BAL wurde zur Bestimmung der Basiswerte Blut aus der Vena jugularis externa entnommen. Dies wurde jede halbe Stunde bis zur Euthanasie wiederholt. Nach Zentrifugieren des Blutes wurde das Serum bis zur Weiterverarbeitung im Labor auf Eis gelagert.
3.3.4 Thorakotomie und Lungenkontusion
Die experimentelle Lungenkontusion in der Kontusionsgruppe wurde durch direkte Lungenquetschung im Rahmen der Thorakotomie durchgeführt. Die Methode ist 1980 von OESTERN beschrieben worden. Der Zugang erfolgte über den fünften Interkostalraum von rechts. Es erfolgte eine sorgfältige Inspektion der Lunge, um Vorschädigungen und offene Parenchymverletzungen auszuschließen. Nach vorsichtigem vorlagern der Lunge wurde mit Hilfe einer speziell angefertigten Fasszange ein standardisierter Druck von 1–1,5 kg/cm2 auf den rechten Mittellappen ausgeübt. Dadurch wurde eine Kontusion des pulmonalen Gewebes erzeugt, ohne dabei Rupturen im Lungengewebe zu bewirken. Anschließend wurde eine Thoraxdrainage aus Silikon (Down Corning Silastics Medical Grade Tubing, Nr. 602- 285, Fa. Down Corning Medical Products, Midland, USA) gelegt. In der Kontrollgruppe wurde nur eine Thorakotomie mit Thoraxdrainage durchgeführt.
3.3.5 Osteosyntheseverfahren
Bei der aufgebohrten Marknagelung (RFN Gruppe) wurde der operative Eingriff am Oberschenkel in Anlehnung an eine von STÜRMER und SCHUCHARDT (1980) beschriebene Methode an der Schafstibia vorgenommen. Über einen lateralen
Zugang auf Höhe des Trochanter major wurde die Fossa trochanterica dargestellt.
Auf Höhe der palpierbaren Trochanterspitze wurde ein ca. drei Zentimeter langer Hautschnitt in Verlängerung der Femurschaftachse nach kranial durchgeführt. Die Fasern der Glutealmuskulatur wurden quer zur Faserrichtung auseinandergedrängt.
Die Eröffnung des Markraumes erfolgte mittels Pfriem. Nach Einführen des drei Millimeter Führungsspießes erfolgte das Vorbohren mit einer Standard AO Bohrmaschine (Synthes, Bochum). Um den Markraum für das Einbringen des Nagels entsprechend zu weiten, wurde der Vorgang mit einer biegsamen Welle ohne festen Kopf unter sukzessivem Austausch von Bohrköpfen in den Größen von 9,5 bis 10,5 mm dreimal wiederholt. Dann erfolgte das Einbringen eines Femurnagels (Synthes, Bochum), dessen Durchmesser 0,5 mm geringer als der des dicksten Bohrers war.
Die Vorgehensweise bei der unaufgebohrten Marknagelung (UFN Gruppe) erfolgte bis einschließlich des Vorbohrens zur Eröffnung der Markhöhle wie bei der aufgebohrten Marknagelung. Statt des mehrfachen Aufbohrens des Markraumes wurde ein solider in der Humanmedizin verwendeter Femurnagel (Synthes, Bochum) von zehn Millimeter Durchmesser eingeschlagen.
Bei dem neu entwickelten Bohrsystem (RIA Gruppe) erfolgte das gleiche Vorgehen wie bei der Gruppe mit aufgebohrtem Markraum. Statt des herkömmlichen Bohrers wurde jedoch das neue System benutzt (Synthes, Paoli, Pennsylvania).
In einer vierten Gruppe, wurde statt eines Marknagels ein standardisierter Fixateur externe (Fix Ex Gruppe) angebracht, wie bereits von PAPE et al. (1995) beschrieben.
3.3.6 Histologische Proben
Für die histologischen Untersuchungen wurden nach der Euthanasie Gewebeproben von der Lunge entnommen. Sie wurden direkt nach Entnahme in 5%ige Formalinlösung eingelegt und nach dreiwöchiger Fixation der weiteren Bearbeitung zugeführt.
3.4 Untersuchungen
3.4.1 Pulmonalkapilläre Permeabilität
Das Ausmaß der Lungenparenchymschädigung wurde durch die Ratio zwischen dem Proteingehalt in der BALF und dem Serum charakterisiert. Um die Proteinkonzentration der BALF volumenabhängig zu berechnen wurde der absolute Proteingehalt über die gleichzeitig gemessene Harnstoffkonzentration im Plasma und in der BALF korrigiert nach:
Ratio: (Protein)BAL*(Protein)Plasma*(Harnstoff)Plasma/(Harnstoff)BAL
Harnstoff kann ungehindert zwischen alveolaren und kapillaren Kompartiment ausgetauscht werde wegen der minimale Größe. Konzentrationen von Protein und Harnstoff wurden mittels Standardmethoden gemessen (Protein: Lowry Assay, (LOWRY et al. 1951); Harnstoff: Biochemical Test (PAPE et al. 1998)).
3.4.2 Polymorphkernige Leukozyten (PMNL) Aktivitätskapazität
Die Seperation der Granulozyten aus dem Vollblut erfolgte mit Hilfe eines einstufigen Dichtegradienten unter Verwendung von 50 % Percoll (mit Polyvinylpyrolidon ummantelte Kieselerdepartikel, Pharmacia Schweden), das eine Dichte von 1,077 g x cm-3 bewirkt. Blutproben wurden aus dem Katheter der Vena jugularis externa in Natrium-Citrat-Monovetten entnommen und weiter verarbeitet. Dazu wurden 4 ml Percoll-Lösung in ein Reagenzröhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) gegeben und überschichtet mit 1 ml einer 1:1 verdünnten Vollblut/0,9% NaCl Suspension.
Anschliessend wurde die Probe bei 530 g unter 20°C für 20 Minuten zentrifugiert.
Der Überstand, Monozyten, Thrombozyten, Lymphozyten, Plasma und Percoll enthaltend, wurde dekantiert. Das Sediment wurde mit PBS aufgefüllt und fünf Minuten bei 530 g unter 20°C zentrifugiert und der Überstand mit Resten der Percoll- Lösung dekantiert. Die im granulozytenreichen Sediment enthaltenen Erythrozyten wurden mit 2 ml Aqua bidest im Eisbad lysiert. Zur Wiederherstellung der physiologischen Osmolarität wurde nach 20 Sekunden 1 ml 2,7%-ige
Kochsalzlösung zu der Suspension gegeben. Es folgten erneut zwei Waschvorgänge mit PBS durch Zentrifugation bei 530 g und 20°C für fünf Minuten. Das Zellsediment wurde abschliessend in 1 ml MEM-Puffer (Fa. Boehringer, Mannheim) resuspendiert und in einer Neubauer-Kammer gezählt. Bei stichprobenartig durchgeführten Trypanblau-Exklusionstesten ergab sich jeweils eine Zellviabilität von über 90%.
Die Chemilumineszenz bestimmt die Aktivität der Granulozyten bezüglich der generellen Phagozytosefähigkeit und des oxidativen Metabolismus. Die Chemilumineszenz wurde unter Luminol Verstärkung nach einer von Tono-Oka (TONO-OKA et al., 1983) beschriebenen Methode an einem Bioluminaten (Biolumate LB 9505, Berthold Technologies, Wildbad) durchgeführt. Die Messungen erfolgten bei einer Temperatur von 37°C. Für die Bestimmung der Chemilumineszenz isolierter Granulozyten wurde zur Messung der Basisaktivität 520 µl MEM, 10 µl Luminol (22,6 mM), 50 µl Granulozytensuspension und 50 µl gepooltes Plasma angesetzt. Zur Messung der Aktivität an den Versuchszeitpunkten wurden 500 µl MEM, 10 µl Luminol, 50 µl Granulozytensuspension, 50 µl gepooltes Plasma und 20 µl nicht-opsoniertes Zymosan (Fa. Sigma, St. Louis, USA) angesetzt. Das verwendete gepoolte Plasma stammte aus einer Blutabnahme vor Versuchsbeginn und gewährleistete damit eine gleich bleibende Opsonierung des Zymosans im Ansatz.
Die maximal erreichten Chemilumineszenz-Werte wurden bestimmt. Die Messungen wurden simultan gestartet und die Photoemission in counts per minute (cpm) über 60 Minuten aufgezeichnet.
3.4.3 Gerinnungsparameter
Alle Messungen der Gerinnungsparameter wurden aus EDTA-Plasma durchgeführt.
Das Probenmaterial der Versuchstiere wurde zwecks Kalibrierung der Testsysteme gegen einen gepoolten Standard von zehn, nicht im Versuch befindlichen Schafen gemessen. Für die Fibrinogen- und Faktor-V-messungen wurde eine Verdünnungsreihe aus dem gepoolten Plasma hergestellt.
3.4.3.1 Fibrinogen
Die Fibrinogenmessung nach CLAUSS (1957) wird zur Erfassung des hämostatisch aktiven Fibrins eingesetzt. In Gegenwart eines Thrombin-Überschusses ist die Gerinnungszeit einer verdünnten Probe der Fibrinogenkonzentration umgekehrt proportional. Die Messungen erfolgten mit dem von der Fa. Roche (Diagnostica Stago, Roche Diagnostics, Mannheim) entwickelten Testkit. Die Messungen wurden im Häkchenkoagulometer (Schnitger und Gross, Amelung GmbH, Lemgo) durchgeführt. Als 100 % - Wert galt eine Verdünnung von 1:40.
3.4.3.2 Faktor V
Die Faktor V Messungen wurden ebenfalls mit dem Häkchenkoagulometer (Schnitger und Gross, Amelung GmbH, Lemgo) durchgeführt. Der STA Faktor V – Testkit (Diagnostica Stago, Roche Diagnostics, Mannheim) basiert auf dem Grundprinzip, dass die Gerinnungszeit des Testansatzes nur von der Aktivität des zu messenden Faktors in der Probe abhängt. Alle übrigen Faktoren liegen im Mangelplasma des Testkits im Überschuss vor. Als 100%-Wert galt eine Verdünnung von 1:20.
3.4.3.3 Antithrombin III
Die Probe wurde mit Heparin und einer definierten Menge Thrombin im Überschuss versetzt. Sämtliches Antithrombin III wird in einen inaktiven Komplex überführt. Nicht gehemmtes Thrombin wird aus einem chromogenen Substrat p–Nitroanilin frei. Die Restmenge Thrombin ist umgekehrt proportional dem Antithrombin III Gehalt. Aus der Extinktionszunahme bei 405 nm kann die Antithrombin III Aktivität berechnet werden. Die quantitative Bestimmung der Antithrombin III Aktivität wurde mit dem Antithrombin III Testkit der Fa. Roche (Roche, Mannheim) auf dem Roche / Hitachi Gerät 912 (Roche, Mannheim) gemessen.
3.4.3.4 D–Dimere
Latexpartikel einheitlicher Größe wurden mit monoklonalen Antikörpern gegen das D –Dimer–Epitop beschichtet. Die bei Zugabe von D–Dimer–haltigen Blutproben entstehenden Antigen–Antikörper–Komplexe bewirken eine Zunahme der Trübung des Testansatzes. Die Extinktionsänderungen pro Zeit ist abhängig von der Konzentration an D–Dimer–Epitopen in der Probe. Die Messungen wurden mit dem D–Dimer Testkit (Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) auf dem Roche / Hitachi 912 Gerät (Roche , Mannheim) durchgeführt.
3.4.4 Histologie
In der vorliegenden Arbeit wurden die histologischen Befunde der Lunge beschrieben. Hierfür wurden die entsprechenden Proben aus dem Fixationsmedium entnommen und mit einem Einbettautomaten (Hypercenter 2, Fa. Shandon, London, Großbritannien) nach laborüblichem Schema, d.h. Entwässerung durch aufsteigende Alkoholreihen, zwei Bäder mit Essigsäurebuthylester als Intermedium und zwei Bäder Paraffin (Fa. Vogel, Gießen, Schmelzpunkt 58–60°C) eingebettet. Mit einem Schlittenmikrotom (Fa. Reichert–Jung, Heidelberg) erfolgte die Herstellung ca. 2 µm dicken Schnitten. Zur Beurteilung wurde bei allen Schnitten eine Hämalaun–Eosin–
Übersichtsfärbung vorgenommen. Es folgte die Beurteilung der Präparate unter dem Lichtmikroskop anhand einer Gradeinteilung der Veränderungen in gering- mittel- und hochgradig. Zum einen wurde die PMNL Diapedese zum anderen die interstitielle Verdickung beurteilt.
3.5. Statistik
In die statistische Auswertung gingen jeweils die Mittelwerte und die Standardabweichungen der Parameter ein. Die statistischen Untersuchungen wurden mit SPSS 11.5 für Windows ® (SPSS, Chicago, Illinois, USA) durchgeführt.
Das für alle Vergleiche zugrunde liegende Signifikanzniveau wurde unterhalb von 0,05 festgelegt (p<0,05). Um Unterschiede zwischen den Gruppen festzustellen, wurde ein ANOVA Test und ein posthoc Student´s t-Test eingesetzt.
4. Ergebnisse
4.1. Pulmonalkapilläre Permeabilität
Es gab keine signifikanten Unterschiede bei den Ausgangswerten der Harnstoff/Protein Ratio zwischen den Thorakotomie- und den Lungenkontusions- Gruppen (p>0,05).
Die Kontrollgruppe der Fix ex Gruppe zeigt keinen signifikanten Anstieg der Urea/Protein (U/P) Ratio vom Basiswert bis vier Stunden nach der Osteosynthese (p>0,05). Die Kontusion hingegen führte zu einem signifikanten Anstieg der U/P Ratio (p<0,05); dagegen führte die Instrumentation zu keinem Anstieg (p>0,05).
Die Thorakotomie führte nicht zu einem signifikanten Anstieg der U/P-Ratio in der RFN-Gruppe (p>0,05). Demgegenüber steht der signifikante Anstieg der U/P Ratio nach Lungenkontusion (p<0,05). Die Bohrung führte zu einem deutlichen Anstieg der U/P-Ratio in beiden Gruppen der RFN Gruppe (p<0,05). Vier Stunden nach der Osteosynthese war ein signifikanter Abfall der U/P-Ratio in der Thorakotomiegruppe im Vergleich zum Basiswert nachzuweisen (p<0,05). Demgegenüber war ein weiterer deutlicher Anstieg in der Kontusionsgruppe zu beobachten (p<0,05).
In der Kontrollgruppe der UFN Gruppe führte die Thorakotomie nicht zu einem deutlichen Anstieg der U/P Ratio (p>0,05), dagegen führte die Kontusion zu einem signifikanten Anstieg der Harnstoff/Protein Ratio (p<0,05). In beiden Gruppen gab es keinen signifikanten Anstieg der Lungenpermeabilität nach der Osteosynthese (p>0,05). Beide Gruppen verzeichneten einen Abfall der U/P Ratio, vier Stunden nach der Instrumentation, der nicht signifikant war (p>0,05).
In der RIA Gruppe kam es ebenfalls zu keinem deutlichen Anstieg der U/P Ratio nach der Thorakotomie (p>0,05). Die Kontusion führte auch in dieser Gruppe zu einem signifikanten Anstieg der U/P Ratio (p<0,05). In beiden Gruppen gab es keinen signifikanten Anstieg der U/P Ratio nach der Osteosynthese (p>0,05). In der Kontroll- und der Kontusionsgruppe des neuen Bohrsystems kam es zu einem Abfall der U/P Ratio vier Stunden nach der Instrumentation, der nicht signifikant war
In jeder Gruppe stieg die U/P Ratio nach der Kontusion signifikant an (p<0,05). Nach der Instrumentation am Knochen stieg die U/P Ratio nur in der RFN-Gruppe deutlich an.
In den Kontusionsgruppen aller Osteosytheseverfahren waren die Werte direkt nach der Lungenkontusion vergleichbar. Vier Stunden nach der Instrumentation war der U/P Ratio Wert in der RFN Gruppe signifikant höher als in allen anderen Kontusionsgruppen. In der Kontrollgruppe war dies nicht zu beobachten. (Abbildung 1 und 2; Anhang Tabelle 1-4)
Abbildung 1: Pulmonale Permeabilität in den Kontrollgruppen. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. U/P Ratio: Urea/Protein Ratio. 4 post OS: Vier Stunden nach Osteosynthese. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
*
Pulmonale Permeabilität in den Kontrollgruppen
0 20 40 60 80 100 120
Basiswert
Thorakotomie
Osteosynthese
4 post OS U/P Ratio
Fix ex RFN UFN RIA
Abbildung 2: Pulmonale Permeabilität in den Kontusionsgruppen. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. U/P Ratio: Urea/Protein Ratio. 4 post OS: Vier Stunden nach Osteosynthese. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
4.2. Polymorphkernige Leukozyten (PMNL) Aktivitätskapazität im Blut
Die Kapazität der PMNL Aktivierung der Grundwerte wurde als 100% Wert angesetzt und die weiteren Werte wurden in Relation zu diesem Ausgangswert bemessen. In allen vier Kontrollgruppen waren keine signifikanten Unterschiede in der PMNL Aktivitätskapazität festzustellen (p>0,05).
Außer in der RIA Gruppe (p>0,05) führte die Kontusion der Lunge zu einem signifikanten Abfall der peripheren/zirkulierenden PMNL Aktivitätskapazität (p<0,05).
In der RFN Gruppe gab es darüber hinaus einen signifikanten Abfall der PMNL Aktivitätskapazität bis vier Stunden nach der Osteosynthese (p<0,05) (Abbildung 3 und 4; Anhang Tabelle 5-8).
Pulmonale Permeabilität in den Kontusionsgruppen
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Basiswert
Kontusion
Osteosynthese
4 post OS U/P Ratio
Fix ex RFN UFN
RIA
Abbildung 3: PMNL Aktivitätskapazität in den Kontrollgruppen. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. PMNL: Polymorphkernige Leokozyten. 4 post OS:
Vier Stunden nach Osteosynthese. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
PMNL Aktivitätskapazität in den Kontrollgruppen
0 20 40 60 80 100 120 140
Basiswert
Thorakotomie
Osteosynthese
4 post OS
%
Fix ex RFN UFN RIA
Abbildung 4: PMNL Aktivitätskapazität in den Kontusionsgruppen. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. PMNL: Polymorphkernige Leokozyten. 4 post OS:
Vier Stunden nach Osteosynthese. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
4.3. Fibrinogen
In der Kontrollgruppe der Fix ex Gruppe wurden keine signifikanten Unterschiede im Fibrinogengehalt nachgewiesen (p>0,05). Vier Stunden nach der Osteosynthese kam es in der Kontusionsgruppe zu einem signifikanten Abfall der Fibrinogenkonzentration im Vergleich zum Ausgangswert (p<0,05).
In der RFN Gruppe waren die Unterschiede in der Plasma Fibrinogenkonzentration vier Stunden post Osteosynthese im Vergleich zum Zeitpunkt der Kontusion und des Ausgangswertes signifikant (p<0,05).
PMNL Aktivitätskapazität in den Kontusionsgruppen
0 20 40 60 80 100 120 140
Basiswert
Kontusion
Osteosynthese
4 post OS
%
Fix ex RFN UFN RIA
jedoch ein deutlicher Abfall der Fibrinogenkonzentration im Vergleich zum Ausgangswert und zum Zeitpunkt der Kontusion festzustellen (p<0,05). Vier Stunden nach Marknagelimplantation kam es in der Kontusionsgruppe zu einem signifikanten Absinken in der Fibrinogenkonzentration im Vergleich zur UFN-Kontrollgruppe (p<0,05).
In der Kontrollgruppe des neuen Bohrsystems traten zu jedem Zeitpunkt signifikante Erniedrigungen in der Fibrinogenkonzentration im Vergleich zu den anderen Gruppen auf (p<0,05). Vier Stunden post Osteosynthese kam es zu einem deutlichen Unterschied der Fibrinogenkonzentration im Vergleich zum Zeitpunkt der Kontusion und des Ausgangwertes (p<0,05). Außerdem kam es zu einem signifikanten Abfall der Fibrinogenkonzentration zum Zeitpunkt der Osteosynthese und dem Ausgangswert (p<0,05). Zu jedem Zeitpunkt besteht ein signifikanter Unterschied in der Konzentration von Fibrinogen innerhalb der RIA Kontusionsgruppe (p<0,05) (Abbildung 5 und 6; Anhang Tabelle 17-20).
Abbildung 5: Fibrinogenkonzentration in den Kontrollgruppen. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. 4 post OS: Vier Stunden nach Osteosynthese. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
Fibrinogenkonzentration in den Kontrollgruppen
0 20 40 60 80 100 120 140
Basiswert Thorakotomie Osteosynthese 4 post OS
%
Fix ex RFN UFN RIA
Abbildung 6: Fibrinogenkonzentration in den Kontusionsgruppen. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. 4 post OS: Vier Stunden nach Osteosynthese. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
4.4. Faktor V
In keiner der Gruppen, die mit dem Fixateur externe oder dem konventionellen Bohrer versorgt wurden, traten auffällige Unterschiede in der Faktor-V-Konzentration auf (p>0,05).
Vier Stunden post Osteosynthese wurde in der UFN Kontrollgruppe ein deutlicher Abfall der Faktor-V-Konzentration beobachtet (p<0,05). Ein deutlicher Abfall der Faktor V Konzentration in der Kontusionsgruppe lag zwischen dem Ausgangswert und vier Stunden nach Osteosynthese vor (p<0,05).
Zum Ende des Versuchsprotokolls der RIA Kontrollgruppe wurden signifikante Unterschiede im Vergleich zur Osteosynthese, zur Thorakotomie und zum Ausgangswert gemessen (p<0,05).
Der Ausgangswert der Faktor-V-Konzentration in der RIA Kontusionsgruppe war Fibrinogenkonzentration in den Kontusionsgruppen
0 20 40 60 80 100 120 140
Basiswert Kontusion Osteosynthese 4 post OS
%
Fix ex RFN UFN RIA
Abbildung 7: Faktor V Konzentration in den Kontrollgruppen. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. 4 post OS: Vier Stunden nach Osteosynthese. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
Faktor V Konzentration in den Kontrollgruppen
0 20 40 60 80 100 120 140
Basiswert
Thorakotomie
Osteosynthese
4 post OS
%
Fix ex RFN UFN RIA
Abbildung 8: Faktor V Konzentration in den Kontusionsgruppen. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. 4 post OS: Vier Stunden nach Osteosynthese. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
4.5. Antithrombin III (AT III)
Vier Stunden nach der Osteosynthese kam es in der Thorakotomiegruppe der Fix ex Gruppe zu einem deutlichen Abfall der AT III Konzentration im Vergleich zum Ausgangswert (p<0,05). In der Kontusionsgruppe kam es zu einem signifikanten Abfall der AT III Konzentration vier Stunden nach der Osteosynthese im Vergleich zum Ausgangswert (p<0,05). Auffällige Unterschiede zwischen der Kontusions- und Kontrollgruppe ergaben sich nicht (p>0,05).
In der Kontrollgruppe der Markraumbohrung mit dem konventionellen Bohrer gab es einen deutlichen Abfall der AT III Konzentration im Verlauf der Studie (p<0,05). Der Basiswert der AT III Konzentration in der Kontusionsgruppe war signifikant höher als zum Zeitpunkt der Osteosynthese (p<0,05). Ebenfalls wurde ein signifikanter Abfall der AT III Konzentration vier Stunden nach der Osteosynthese im Vergleich zum
Faktor V Konzentration in den Kontusionsgruppen
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Basiswert Kontusion Osteosynthese 4 post OS
%
Fix ex RFN UFN RIA
Der Basiswert in der UFN-Kontrolle war signifikant höher als zum Zeitpunkt der Osteosynthese und vier Stunden nach der Osteosynthese (p<0,05). Außerdem gab es einen deutlichen Abfall der AT III Konzentration zwischen der Thorakotomie und vier Stunden nach der Osteosynthese (p<0,05). Der Vergleich der Basiswerte zum Zeitpunkt der Osteosynthese mit denen vier Stunden nach der Osteosynthese zeigt einen signifikanten Abfall der AT III Konzentration in der Kontusionsgruppe (p<0,05).
Vier Stunden nach der Osteosynthese war die AT III Konzentration deutlich geringer ausgeprägt, als zum Zeitpunkt der Kontusion (p<0,05)
Zum Zeitpunkt der Thorakotomie lag die AT III Konzentration deutlich höher als zum Zeitpunkt der Osteosynthese in der RIA Gruppe (p<0,05). Desweiteren wurde ein signifikanter Unterschied zwischen dem Ausgangswert und der Osteosynthese sowie vier Stunden nach der Osteosynthese festgestellt (p<0,05). Zwischen der Thorakotomie und vier Stunden post Osteosynthese gab es ebenfalls einen signifikanten Abfall der AT III Konzentration (p<0,05).
Es gab in der Kontroll- und Kontusionsgruppe der RIA Gruppe gab es einen deutlichen Unterschied zum Zeitpunkt der Osteosynthese und vier Studen nach der Osteosynthese zum Ausgangswert der jeweiligen Gruppen (p<0,05). (Abbildung 9 und 10; Anhang Tabelle 13-16).
Abbildung 9: AT III Konzentration in den Kontrollgruppen. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. AT III: Antithrombin 3. 4 post OS: Vier Stunden nach Osteosynthese. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
AT III Konzentration in den Kontrollgruppen
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Basiswert Thorakotomie Osteosynthese 4 post OS
%
Fix ex RFN UFN RIA
Abbildung 10: AT III Konzentration in den Kontusionsgruppen. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. AT III: Antithrombin 3. 4 post OS: Vier Stunden nach Osteosynthese. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
4.6. D-Dimere
In der Kontroll- und der Kontusionsgruppe der Fix ex Gruppe wurden keine auffälligen Unterschiede in den Konzentrationen der D-Dimere festgestellt (p>0,05).
Die Kontusion führte nicht zu einem signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe im gesamten Studienzeitraum (p>0,05). Vier Stunden nach der Osteosynthese ließ sich ein deutlicher Unterschied in der D-Dimer Konzentration zwischen den Gruppen (p<0,05) nachweisen.
Es gab einen deutlichen Anstieg vier Stunden nach der Markraumbohrung mit dem herkömmlichen Bohrer der Konzentration der D-Dimere in der Kontroll- und Kontusionsgruppe (p<0,05).
Bei den Tieren mit unaufgebohrter Marknagelung kam es vier Stunden post Osteosynthese zu einem signifikanten Anstieg der D-Dimer Konzentration in der
AT III Konzentration in den Kontusionsgruppen
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Basiswert Kontusion Osteosynthese 4 post OS
%
Fix ex RFN UFN RIA
Kontrollgruppe (p<0,05). In der Kontusionsgruppe stieg der D-Dimer Spiegel signifikant innerhalb des Studienzeitraums an (p<0,05). Allerdings liessen sich keine deutlichen Unterschiede nach der Kontusion und nach der Osteosynthese (p>0,05) ermitteln. Es konnte kein deutlicher Unterschied der D-Dimer Konzentration durch die Kontusion im Vergleich mit der Kontrollgruppe festgestellt werden (p>0,05). Es ergab sich ein signifikanter Unterschied vier Stunden nach der Osteosynthese (p<0,05) Die Kontrolluntersuchungen der RIA Gruppe verzeichnete während des Versuchs einen deutlichen D-Dimer Konzentrationsanstieg (p<0,05). Vom Ausgangswert bis vier Stunden nach Osteosynthese kam es in der Kontusionsgruppe der RIA Gruppe zu einem signifikanten Anstieg der D-Dimer Konzentration (p<0,05). Keine anderen deutlichen Unterschiede wurden festgestellt (p>0,05). Es konnte kein auffälliger Unterschied zwischen der Kontroll- und Kontusionsgruppe der RIA Gruppe festgestellt werden (p>0,05).
Die Markraumbohrung mit dem herkömmlichen Bohrer führte zu einem signifikanten Anstieg der D-Dimer Konzentration verglichen mit dem Fix ex. in der Kontusionsgruppe (p< 0,05).
Außerdem wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den Kontrollgruppen vier Stunden nach der Osteosynthese beobachtet (Abbildung 11 und 12; Anhang Tabelle 9-12).
Abbildung 11: D-Dimer Konzentration in den Kontrollgruppen. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. 4 post OS: Vier Stunden nach Osteosynthese. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
D-Dimer Konzentration in den Kontrollgruppen
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
Basiswert
Thorakotomie
Osteosynthese
4 post OS ng/dl
Fix ex RFN UFN RIA
Abbildung 12: D-Dimer Konzentration in den Kontusionsgruppen. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. 4 post OS: Vier Stunden nach Osteosynthese. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
4.7. Histologie
4.7.1. PMNL Diapedese
Die Diapedese der PMNL war nicht signifikant unterschiedlich in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Kontusionsgruppe der Fix ex Gruppe (p>0,05). In der RFN Gruppe kam es zu einer signifikante Erhöhung der PMNL Diapedese in der Kontusionsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (p<0,05). Keine deutliche Erhöhung der PMNL im Interstitium der Lunge wurde in beiden Gruppen der unaufgebohrten Marknagelung festgestellt (p>0,05).
Auch lagen keine auffälligen Unterschiede zwischen den einzelnen Osteosyntheseverfahren in den Kontrollgruppen vor (p>0,05). Allerdings wies die
D-Dimer Konzentration in den Kontusionsgruppen
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Basiswert
Kontusion
Osteosynthese
4 post OS ng/dl
Fix ex RFN UFN RIA
Abbildung 13: PMNL Diapedese in den Kontrollgruppen Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. PMNL: Polymorphkernige Leukozyten. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
PMNL Diapedese in den Kontrollgruppen
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
PMNL Diapedese Score
Fix ex RFN UFN RIA
Abbildung 14: PMNL Diapedese in den Kontusionsgruppen. Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. PMNL: Polymorphkernige Leukozyten. Fix Ex:
Fixateur externe Gruppe. RFN: reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA: reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
4.7.2. Interstitielle Verdickung der Lunge
Im Vergleich der Kontroll- und der Kontusionsgruppe der einzelnen Osteosyntheseverfahren waren hinsichtlich der interstitiellen Ödembildung keine signifikanten Unterschiede festzustellen (p>0,05). Allerdings kam es bei der aufgebohrten Marknagelung im Vergleich zu den anderen Verfahren in der Kontrollgruppe sowie in der Kontusionsgruppe zu auffälligen Unterschieden (p<0,05).
So wiesen die Lungen der RFN Tiere eine deutlich vermehrte Ödembildung auf (Abbildung 15 und 16).
PMNL Diapedese in den Kontusionsgruppen
0 0,5 1 1,5 2 2,5
PMNL Diapedese Score
Fix ex RFN UFN RIA
Abbildung 15: Interstitielle Verdickung der Lunge in den Kontrollgruppen Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN:
reamed femoral nailing Gruppe. UFN: unreamed femoral nailing Gruppe. RIA:
reamed, irrigation, aspiration Gruppe.
Interstitielle Verdickung der Lunge in den Kontrollgruppen
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8
Interstitielle Verdickung der Lunge Score
Fix ex RFN UFN RIA
Abbildung 16: Interstitielle Verdickung der Lunge in den Kontusionsgruppen Die Werte sind dargestellt als Mittelwert+STAWN. Fix Ex: Fixateur externe Gruppe. RFN:
Interstitielle Verdickung der Lunge in den Kontusionsgruppen
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Interstitielle Verdickung der Lunge Score
Fix ex RFN UFN RIA
5. Diskussion
In der vorliegenden Studie wurden die Auswirkungen verschiedener Osteosyntheseverfahren am Femur auf die pulmonale Permeabilität, die PMNL Aktivitätskapazität und auf diverse Gerinnungsparameter untersucht.
Dabei zeigte sich, dass die aufgebohrte Marknagelung mit einem signifikanten Anstieg der pulmonalen Permeabilität verbunden war, wenn gleichzeitig eine Lungenkontusion vorlag. Zusätzlich war ein auffälliger Anstieg der D-Dimer- Konzentration und ein deutlicher Abfall der Fibrinogenkonzentration während der Operation festzustellen. Histologisch war eine auffällige Ausprägung eines pulmonalen Ödems und eine erhöhte Diapedese der polymorphkernigen Leukozyten zu erkennen. Ohne Lungenkontusion resultierte die aufgebohrte Marknagelung in einem vorübergehenden signifikanten Anstieg der pulmonalen Permeabilität und signifikant höheren D-Dimer-Konzentrationen im Vergleich zur Fixateur externe Gruppe.
In der Gruppe der Tiere, die mit der unaufgebohrten Marknagelung versorgt wurden, zeigte sich eine ähnliche geringere Aktivierbarkeit der neutrophilen Granulozyten wie bei den Tieren, die mittels aufgebohrten Marknagelung fixiert wurden. Auch wurden signifikant niedrigere Konzentrationen von Fibrinogen und höhere D-Dimer- Konzentrationen gefunden. Eine kurze vorübergehende Veränderung der pulmonalen Permeabilität wurde nach der Lungenkontusion festgestellt, jedoch nicht nach der Instrumentation am Femur. Diese Ergebnisse stimmen mit denen der Histologie überein, da das Ausmaß der Ödembildung und der Diapedese der Leukozyten in der Lunge im Vergleich zur aufgebohrten Marknagelung geringer war.
Die Anwendung des neuen Spül- und Saug-Bohrsystem bewirkte keine Veränderungen in der pulmonalen Permeabilität bei erhaltener Aktivierbarkeit der polymorphkernigen Leukozyten sowie einen signifikant geringeren Anstieg der D- Dimer-Konzentration im Vergleich zum konventionellen Bohrsystem. Histologisch
