Tierärztliche Hochschule Hannover Arbeitsgruppe Immunologie
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Untersuchungen zur Beeinflussung funktioneller Eigenschaften von
polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten in der initialen Phase der bovinen Mastitis
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Sonja Meyer aus Wildeshausen
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth 2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. M. Hoedemaker
Tag der mündlichen Prüfung: 21. Mai 2008
Gefördert im Rahmen des DFG-Projektes FOR585 (Pathogen-spezifische Abwehrmechanis- men in der Milchdrüse) durch Personal- und Sachmittel
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
1 Einleitung und Zielsetzung ... 13
2 Literaturübersicht... 15
2.1 Die Mastitis des Rindes... 15
2.1.1 Definition und Einteilung ... 15
2.1.2 Ätiologie und Pathogenese ... 16
2.1.3 Erregerspezifische Mechanismen ... 17
2.2 Immunrelevante Zellen der Milchdrüse ... 21
2.2.1 Die funktionelle Relevanz der Leukozyten... 21
2.2.2 Zellpopulationen in der Milch einer gesunden Milchdrüse ... 33
2.2.3 Zellpopulationen in der Milch nach Infektion der Milchdrüse... 35
2.2.4 Die funktionelle Relevanz der Milchdrüsenepithelzelle für die Immunabwehr ... 36
2.3 Immunrelevante lösliche Faktoren in der Milch ... 39
2.3.1 Zytokine ... 39
2.3.2 Histamin... 41
2.3.3 Andere lösliche Faktoren ... 43
2.4 Formen des Zelltodes ... 43
2.4.1 Signalwege der Apoptose ... 45
2.4.2 Modulation der Apoptose bei neutrophilen Granulozyten... 47
2.4.3 Die Rolle der Mitochondrien in der Apoptose... 51
2.5 Mastitis-Infektionsmodelle... 52
3 Geräte, Material und Methoden ... 55
3.1 Geräte ... 55
3.2 Material ... 56
3.2.1 Klinikbedarf ... 56
3.2.2 Laborbedarf... 57
3.2.3 Reagenzien ... 58
3.2.4 Versuchstiere... 60
3.2.5 Bakterienstämme... 61
3.2.6 Antikörper für die Membranimmunfluoreszenz und zur Herstellung von Referenzzellen... 61
3.2.7 Antikörper und rekombinante Zytokine im ELISA ... 63
3.2.8 Kulturmedien, Puffer und Lösungen... 63
3.3 Methoden... 70
3.3.1 Gewinnung von venösem Blut... 70
3.3.2 Gewinnung boviner mononukleärer Zellen ... 70
3.3.3 Gewinnung neutrophiler Granulozyten... 71
3.3.4 Durchflusszytometrie ... 72
3.3.5 Vitalitätsbestimmung von Zellen ... 73
3.3.6 Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode)... 73
3.3.7 Herstellung von Referenzzellen... 74
3.3.8 Durchflusszytometrische Bestimmung des Anteils apoptotischer Zellen ... 74
3.3.9 Experimentelle Infektion einzelner Euterviertel ... 77
3.3.10 Erhebung und Beurteilung Euter-spezifischer und allgemein klinischer Parameter ... 79
3.3.11 Bakteriologische Untersuchung der Milchproben ... 80
3.3.12 Analyse der Milchzellen ... 81
3.3.13 Gewinnung von Milchserumproben ... 84
3.3.14 Bestimmung des Histamingehaltes durch den Radioimmunoassay... 84
3.3.15 Bestimmung des Zytokingehaltes durch den Enzyme-linked Immunosorbent Assay ... 87
3.3.16 Methoden zur Untersuchung der Modulation der Apoptose durch Milchinhaltsstoffe in vitro... 88
3.3.17 Gewinnung und Stimulation von primären bovinen Milchdrüsenepithelzellen ... 91
3.4 Statistische Verfahren ... 95
4 Ergebnisse ... 98
4.1 Eutergesunde Tiere... 98
4.1.1 Klinische Symptome im Zeitverlauf ... 98
4.1.2 Zellpopulationen in der Milch eutergesunder Tiere... 99
4.1.3 Mediatoren in der Milch ... 104
4.2 Infizierte Tiere... 106
4.2.1 Klinische Symptome im Zeitverlauf ... 106
4.2.2 Dynamik der Milchzellpopulationen nach Inokulation mit E. coli und S. aureus... 109
4.2.3 Expression immunrelevanter Gene in infizierten und nicht-infizierten Kontroll-Eutervierteln... 118
4.2.4 Zytokingehalte der Milch... 120
4.2.5 Histamingehalte der Milch... 123
4.3 Funktionelle Beeinflussung der Überlebenszeit neutrophiler Granulozyten... 126
4.3.1 Etablierung des Apoptosenachweises ... 126
4.3.2 Modulierender Einfluss von Zytokinen ... 129
4.3.3 Modulierender Einfluss von Milchseren und deren Inhaltsstoffen... 132
4.3.4 Regulation der Zellvitalität durch Histamin in vitro... 137
4.3.5 Die Rolle der Milchdrüsenepithelzelle ... 139
5 Diskussion... 142
5.1 Das Tiermodell ... 142
5.1.1 Zelluläre Reaktionen nach Inokulation von E. coli ... 145
5.1.2 Zelluläre Reaktionen nach Inokulation von S. aureus ... 146
5.1.3 Lösliche Faktoren in der Milch... 147
5.1.4 Beeinflussung benachbarter Euterviertel durch die Inokulation mit Erregern... 149
5.2 In-Vitro-Untersuchungen zur Klärung des Einflusses von Milchinhaltsstoffen auf die Vitalität von neutrophilen Granulozyten ... 151
5.2.1 Methodischer Ansatz ... 152
5.2.2 Einfluss von Milchseren gesunder und infizierter Milchdrüsen ... 153
5.2.3 Einfluss von Zytokinen ... 155
5.2.4 Einfluss von Histamin... 156
5.2.5 Einfluss aktivierter Milchdrüsenepithelzellen ... 157
6 Zusammenfassung ... 159
7 Summary... 162
8 Literaturverzeichnis ... 165
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Abb. Abbildung
AIF apoptosis inducing factor APAF 1 apoptosis activating factor-1
Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)
Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) ATP Adenosin-5′-triphosphat
bspw. beispielsweise
bzw. beziehungsweise
C3b opsonisierendes Fragment der Komplementkomponente C3 C5a opsonisierendes Fragment der Komplementkomponente C5 CD cluster of differentiation
CMT California Mastitis Test
CO2 Kohlenstoffdioxid
cpm counts per minute (Zählereignisse pro Minute) CXCL8 Interleukin-8
DISC death inducing signalling complex
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
E. coli Escherichia coli
EDTA ethylendiamine-tetraacetic acid (Ethylendiamintetraacetat)
ELISA enzyme linked immunosorbent assay (Enzym-gekoppelter Immunadsorb- tionstest)
et al. et alii (lateinisch: und andere)
FACScan® fluorescence activated cell scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät) Fc fragment cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxy-terminales
Fragment von Immunglobulinen nach Papain-Spaltung) FCCP Carbonylcyanid-4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazon FCM flow cytometer (Durchflusszytometer)
FCS fetal calf serum (Fetales Kälberserum) FITC Fluoresceinisothiocyanat
FL-1, -2, -3 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm;
FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm;
FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm
FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan®
g Gramm
G-CSF granulocyte-colony stimulating factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor)
ggr. geringgradig
GM-CSF granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (Granulozyten- Makrophagen-Wachstumsfaktor)
Gst Goldstandard
h hora (lateinisch: Stunde)
H2O Wasser
HBSS Hanks Balanced Salt Solution
HBSS+ Hanks Balanced Salt Solution mit Antibiotikumzusatz
hgr. hochgradig
HL hinteres linkes Euterviertel HR hinteres rechtes Euterviertel
HSP heat shock protein (Hitze-Schock Protein) i.d.R. in der Regel
I10F+ Iscove®-Medium mit L-Glutamin, Antibiotikumzusatz und 10% fetalem Kälberserum
ICAM intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül)
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
iNOS induzierbare Stickoxid Synthetase
JC-1 5, 5´, 6, 6´-Tetrachloro-1, 1´, 3, 3´-Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid
KbE Kolonie-bildende Einheiten
L Liter
LBP lipopolysaccharid-binding protein
LFA leukocyte function antigen (Leukozyten Funktionsantigen) LMU Ludwig-Maximimilians-Universität
LPS Lipopolysaccharid
LTA Lipoteichonsäure
LTB4 Leukotrien B4
LTC4 Leukotrien C4
m milli (x10-3)
mAK monoklonaler Antikörper
MAPK mitogen-activated protein kinase (Serine/Threonin-spezifische Protein- kinase)
mgr. mittelgradig
mol Mol
mAk monoklonale(r) Antikörper
µ mikro (x10-6)
MEC Milchdrüsenepithelzelle
MHC major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
MIF Membranimmunfluoreszenz
Min. Minute(n)
mm Millimeter
µm Mikrometer
MMP Mitochondrienmembranpotential
MNC mononuclear cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes)
mRNA messenger RNA
mV Millivolt
MW arithmetischer Mittelwert
n nano (x10-9)
n= bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen
NaCl Natriumchlorid
NADPH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat-Wasserstoff NET neutrophil extracellular trap
NFΚB nuclear factor-kappa B (Transkriptionsfaktor)
NGF nerve growth factor
NO nitric oxide (Stickstoffmonoxid)
NSB nicht-spezifische Präzipitationsserum-Bindung
o.B. ohne Befund
p Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Daten- gruppen
PAF platelet activating factor
PAMP pathogen associated molecular pattern (Molekulare Muster von Erregern) pbMEC primäre bovine Milchdrüsenepithelzelle
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PECAM platelet endothelial cell adhesion molecule
PGE2 Progesteron E2
PGF 2α Prostaglandin F 2α
PGN Peptidoglykan
p.i. post infectionem
PJ Propidiumjodid
PMA Phorbol-12 Myristate-13 Acetate
PMN polymorphonuclear leukocytes (polymorphkernige neutrophile Granulozy- ten)
PRR pattern recognition receptor (Muster-Erkennungsrezeptor)
PS Phosphatidylserin
RIA Radioimmunoassay (Radioimmuntest)
R10F+ RPMI-Medium mit Hepes, L-Glutamin, Antibiotikumzusatz und 10% fetalem Kälberserum
ROS reactive oxygen species (Reaktive Sauerstoffspezies) rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT Raumtemperatur
s Standardabweichung
S. aureus Staphylococcus aureus
SCC somatic cell count (Somatische Zellen in der Milch) sCD 14 soluble CD 14 (lösliches CD 14)
SEA Staphylococcus aureus Enterotoxin A
SEM standard error of the mean (Standardfehler des Mittelwertes)
Smac/Diabolo second mitochondria-derived activator of caspase/ direct IAP-binding pro- tein with low pI (während Apoptose freigesetztes mitochondriales Protein)
s.o. siehe oben
sog. so genannte(r)
SSC side scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® Str. agalactiae Streptococcus agalactiae
Str. dysgalactiae Streptococcus dysgalactiae Str. uberis Streptococcus uberis
Tab. Tabelle
TCRi-24 T-Cell Receptor i-24 (γδ-T-Zellrezeptor)
Th1, Th2 bezeichnet den Phänotyp einer T-Helfer-Zelle 1 oder 2 TLR toll-like-receptor (Toll-ähnlicher-Rezeptor)
TNF tumor necrosis factor (Tumornekrosefaktor) TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand
TRAMP TNF-receptor related apoptosis mediating protein
u.a. unter anderem
v.a. vor allem
vgl. vergleiche
VL vorderes linkes Euterviertel VR vorderes rechtes Euterviertel
x g multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²)
v/v Volumen pro Volumen
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
1 Einleitung und Zielsetzung
Die bovine Mastitis ist eine der bedeutendsten Einzelerkrankungen in der Milchviehhaltung (MILLER et al. 1993). Jährlich erkranken etwa 30% der Kühe an einer Mastitis, die mit ho- hen Kosten bzw. Verdienstausfällen verbunden sind (SEEGERS et al. 2003). Beim Rind wer- den die Infektionen durch ein Spektrum unterschiedlicher Bakterien und Pilze hervorgerufen.
Staphylococcus aureus und Escherichia coli sind die häufigsten Erreger der gram-positiven bzw. gram-negativen Bakterien, die klinische Mastitiden verursachen.
Als gram-positiver Erreger führt Staphylococcus aureus oft zu subklinisch verlaufenden, chronischen Infektionen, bei denen sich die Erreger in das interstitielle Gewebe der Drüse einnisten (SUTRA u. POUTREL 1994). Diese chronischen Infektionen verursachen etwa 80% der wirtschaftlichen Gesamtschäden. Außerdem stellen sie im Hinblick auf Antibiotika- Rückstände in der Milch ein Problem für die Lebensmittelsicherheit dar (TENHAGEN et al.
2006). Intramammäre Infektionen mit dem gram-negativen Pathogen E. coli rufen fast immer akute Mastitiden hervor, die meist durch einen schwerwiegenden Verlauf gekennzeichnet sind. In Einzelfällen kann es zur Septikämie und sogar Versterben des betroffenen Tieres kommen. Der immunologische Hintergrund für die unterschiedliche Abwehrfähigkeit des Wirtes gegenüber verschiedenen Pathogenspezies ist weitgehend ungeklärt.
Generelles Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktion zwischen Erregern, Milchdrüsenepithel- zellen und somatischen Zellen der Milch in der frühen Entzündungsphase vergleichend zwi- schen Staphylococcus aureus und Escherichia coli zu untersuchen. Dafür sollte ein Mastitis- Modellsystem etabliert werden, in dem Tiere definierten Alters, Laktationsstadiums und Milchzellzahl eingesetzt werden, um mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit initiale Signal- und Abwehrmechanismen erfassen zu können. Der vorliegenden Arbeit liegt die An- nahme zu Grunde, dass Erkennungs- und Immunmechanismen in der frühen Phase der Milchdrüsen-Infektion von entscheidender Bedeutung sind.
Die Analyse des Tiermodells sollte daher in einem zweiten Teil der Arbeit um funktionelle Analysen ergänzt werden, welche insbesondere die Rolle von Milchdrüsenepithelzellen und Mastzellen beleuchten. Die Erkennung von Pathogenen oder ihren Bestandteilen kann durch verschiedene Zellen erfolgen. Als sog. Sensorzellen kommen in der Milchdrüse Milch- drüsenepithelzellen und Mastzellen hypothetisch in Frage. Von beiden Zelltypen konnte ge- zeigt werden, dass sie entsprechende Erregerrezeptoren exprimieren und in der Lage sind, nach der Erkennung immunmodulatorische Mediatoren zu sezernieren (GOLDAMMER et al.
2003; WELLNITZ u. KERR 2004; YANG et al. 2008). Von Mastzellen ist überdies bekannt, dass sie in verschiedenen Infektionsmodellen eine überragende Funktion einnehmen (MARSHALL 2004). Die Funktionalität dieser Sensorzellen kann somit entscheidend für die
Anlockung und die Regulation der Haupteffektorzellen bei der bovinen Mastitis – die neutro- philen Granulozyten - sein. Insofern galt ein Hauptaugenmerk in dieser Arbeit der Regulation dieser Zellpopulation. Hier stand der Zelltod, sowohl die Apoptose als auch die Nekrose im Vordergrund, da die Modulation der Lebensspanne dieser Zellpopulation vor Ort von elemen- tarer Bedeutung für die Homöostase des Systems, das Abklingen der Entzündung und letzt- lich für die funktionelle Kapazität dieser Haupteffektorzellpopulation ist. Um die Apoptose, vermittelt über Zytokine, Histamin und generelle Milchinhaltsstoffe, zuverlässig charakteri- sieren zu können, sollte ein sensitives Nachweisverfahren etabliert werden.
2 Literaturübersicht
2.1 Die Mastitis des Rindes
2.1.1 Definition und Einteilung
Als Mastitis wird die Entzündung der Milchdrüse in der Gesamtheit ihrer milchbildenden, speichernden und ableitenden Abschnitte bezeichnet, die nahezu ausschließlich infektiös be- dingt ist. Es sind sowohl akute als auch chronische, sowie klinische und subklinische Verläufe möglich.
Eine scharfe Trennung zwischen einer gesunden und einer kranken Milchdrüse ist wie bei jedem anderen Organ nicht möglich. Um eine Orientierung dennoch zu ermöglichen, hat die Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft (DVG) auf Grundlage der Erkenntnisse von HESS und EGGER (1969) sowie REICHMUTH (1975) vier Kategorien der Eutergesundheit definiert, wobei für die Beurteilung zytologisch-mikrobiologische Befunde von Viertelan- fangsgemelksproben festgelegt wurden (Tab. 1).
Tab. 1 Beurteilung zytologischer und mikrobiologischer Befunde im Rahmen der Mastitis-Kategorisierung (DVG 1994).
Euterpathogene Mikroorganismen Nicht nachgewiesen Nachgewiesen
< 100.000 SCC/mL Normale Sekretion Latente Infektion
> 100.000 SCC/mL Unspezifische Mastitis Mastitis
Diese Definition gilt für die Untersuchung von Viertelgemelksproben, die zur üblichen Melk- zeit aus dem Anfangsgemelk von Kühen in normaler Laktation entnommen wurden. Die Fest- legung der Zellzahlen beruht auf Untersuchungen des Zellgehalts im Viertelanfangsgemelk ungeschädigter Euter von Erstkalbinnen (HESS u. EGGER 1969; REICHMUTH 1975;
DOGGWEILER u. HESS 1983). Der Modalwert (Maximum der Häufigkeitsverteilung) be- trug 20.000 Zellen/mL. Die zweifache Standardabweichung, die in der Medizin übliche Si- cherheitsgrenze der Norm, umfasste als obersten Wert 100.000 Zellen/mL.
2.1.1.1 Verlaufsformen der Mastitis
Euterentzündungen treten in unterschiedlichen Verlaufsformen und in Verbindung mit ver- schiedenartigen klinischen Symptomen auf (HAMANN u. FEHLINGS 2002).
Subklinische Mastitiden sind Entzündungen des Euters ohne äußerlich erkennbare Sympto- me, aber mit Vorliegen von erhöhter Zellzahl und dem Nachweis von Mastitiserregern.
Eine geringgradige klinische Mastitis liegt beim Auftreten von Flocken in der Milch, insbe- sondere im Vorgemelk, ohne zusätzliche klinische Symptome des Euters vor.
Eine mittel- bis hochgradige klinische Mastitis besteht bei offensichtlichen Entzündungs- symptomen des Euters wie erhöhte Temperatur, Schmerzen und Schwellung. Die Milch ist makroskopisch verändert und die Tiere zeigen häufig Fieber.
Die Begriffe subakut, akut und chronisch beschreiben die zeitliche Dauer der Erkrankung.
Eine chronische Mastitis ist durch ein nicht zur Ausheilung gekommenes langfristiges Er- krankungsgeschehen gekennzeichnet. Betroffene Euterviertel neigen zur Atrophie oder wei- sen zeitlebens anomale klinische oder subklinische Befunde auf.
2.1.2 Ätiologie und Pathogenese
Die Mastitis wird durch Eindringen von pathogenen Mikroorganismen durch den Zitzenkanal und Vermehrung in der Milchdrüse hervorgerufen (BANNERMAN et al. 2004). Das Risiko einer Erkrankung kann durch traumatische, chemische und physiologische Einflüsse erhöht werden. Daher muss die Mastitis als eine multifaktorielle Erkrankung betrachtet werden, die durch das Rind als Wirt, dem Mikroorganismus als verursachendes Agens und durch Mana- gementfaktoren beeinflusst wird (HOGAN u. SMITH 2003; OVIEDO-BOYSO et al. 2007).
Von den über 135 verschiedenen Mikroorganismen, die aus bovinen intramammären Infekti- onen isoliert wurden, war ein großer Teil Bakterien, gefolgt von Pilzen (vor allem Hefen) und Algen (Prothoteken) (BRADLEY u. GREEN 2001). Der Nachweis von Viren ist schwer zu führen. Die DVG (1994) schlägt eine Einteilung nach Reservoiren der Mastitiserreger vor.
Hier wird zum einen die infizierte Milchdrüse als Infektionsherd genannt, über den die Keime (z.B. S. aureus, Str. agalactiae oder Str. dysgalactiae) übertragen werden. Dies erfolgt in ers- ter Linie über die Melkmaschinen in der Melkzeit oder über den Melker. Das zweite Reser- voir ist die Umwelt, wozu E. coli, Str. uberis oder Klebsiellen zählen. Das Infektionsrisiko liegt hier vor allem in den Zwischenmelkzeiten. Im Falle von E. coli wird auch der hämatoge- ne Infektionsweg diskutiert.
Klinische Mastitiden werden überwiegend durch coliforme Keime, Streptokokken, Staphylo- kokken und Arcanobacterium pyogenes ausgelöst, subklinische Mastitiden werden durch Sta- phylokokken und Streptokokken verursacht (WIESNER u. RIBBECK 2000).
In der Trockenstehzeit und im peripartalen Zeitraum treten Mastitiden besonders häufig auf.
Dies wird auf die massiven metabolischen und hormonellen Veränderungen in der periparta- len Phase zurückgeführt. In diesem Zusammenhang wird die pathogenetische Bedeutung er- höhter Plasmaketonkörper (SURIYASATHAPORN et al. 2000a) und die immunmodulatori- sche Kompetenz der peripartal stark veränderlichen Steroidhormone, wie Östrogene, Pro- gesteron und Kortikosteroide diskutiert (WESSENDORF et al. 1998; SCHEIBL u. ZERBE 2000). Einen weiteren Einfluss auf die Anfälligkeit für Mastitis wird in der Zellzahl der Milch vermutet. Geringe Zellzahlen der Milch sollen die Anfälligkeit der Euter für Umwelterreger erhöhen (SURIYASATHAPORN et al. 2000b).
2.1.3 Erregerspezifische Mechanismen
Da Staphylococcus aureus und Escherichia coli zu den häufigsten bovinen Mastitiserregern zählen (BARKEMA et al. 1998) und im experimentellen Mastitismodell diese Erreger einge- setzt wurden, fokussiert sich die folgende Darstellung auf diese beiden Keime.
2.1.3.1 Escherichia coli
Escherichia coli (E. coli) ist ein säurebildendes, Laktose-fermentierendes, gram-negatives, stäbchenförmiges Bakterium, das zur Familie der Enterobacteriaceae gehört (HAHN et al.
2005). E. coli ist ein opportunistischer Mastitiserreger (BARROW u. HILL 1989; NEMETH et al. 1994).
Im Gegensatz zu den enteropathischen und bakteriämischen Stämmen, die durch eine geringe Anzahl an E.-coli-Serotypen ausgelöst wird, gehören die aus bovinen klinischen Mastitiden isolierten E.-coli-Bakterien zu einer weiten Bandbreite an serologischen Gruppen. E.-coli- Serotypen in Mastitismilch gleichen denen in Faeces (BURVENICH et al. 2003). In einer Studie konnten die für die Mastitis verantwortlichen Erreger im Darm desselben Tieres oder anderer Kühe und Kälber des Bestands gefunden werden (LINTON u. ROBINSON 1984).
Eine intramammäre Infektion mit E. coli findet vermutlich überwiegend über das Eindringen durch den Zitzenkanal und eine Vermehrung im Lumen der Milchdrüse statt. Auch eine hä- matogene Besiedlung des Euters ist möglich. Es bedarf weder einer Adhärenz am Drüsene- pithel noch besonderer Virulenzfaktoren zur Manifestation einer intramammären Infektion mit E. coli (OPDEBEECK et al. 1988). Der Erreger besitzt die Eigenschaft, sich auch im Milchsekret zu vermehren. Voraussetzung ist die Laktoseverwertung und das Wachstum unter nahezu anaeroben Bedingungen. Zudem sind die Keime in der Lage, Milchinhaltsstoffe zu verstoffwechseln und können somit Populationsdichten von 108 Kolonie-bildenden Einheiten pro mL Milch erreichen (HOGAN et al. 1992) Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass
E. coli auch in der Trockensteherphase im Euter persistieren kann (BRADLEY u. GREEN 2001). 65% aller coliformen Mastitiden, die in den ersten zwei Monaten der Laktation auftre- ten, sollen auf eine Infektion in der Trockenstehphase zurückzuführen sein (SMITH et al.
1985). Im Sekret einer involutierenden Milchdrüse kann nur bedingt eine Vermehrung des Bakteriums stattfinden, da die limitierende nutritive Grundlage für E. coli, das Eisen, von ho- hen Konzentrationen Lactoferrin gebunden wird und den Bakterien nicht zur Verfügung steht (WELTY et al. 1976).
Die Vermehrung des Keimes und die Störung des Allgemeinbefindens sind von der Effektivi- tät und Schnelligkeit der Antwort der neutrophilen Granulozyten abhängig. Kapselproduzie- rende E.-coli-Stämme verursachen länger andauernde Euterinfektionen als E.-coli-Stämme, die keine Kapselbildung aufweisen (HILL et al. 1983).
Intramammäre Infektionen mit E. coli führen fast immer zu akuten Mastitiden, die meistens durch einen schwerwiegenden Verlauf gekennzeichnet sind. Häufig wird eine hochgradige Störung des Allgemeinbefindens beobachtet. Die intramammäre Infektion mit E. coli kann zur Septikämie und vereinzelt zu Todesfällen führen. Ebenso wie das rasche Auftreten, findet aber auch oftmals eine zügige Heilung statt (HOGAN u. SMITH 2003). So dauert eine „Coli- Mastitis“ in der Regel während der Laktation weniger als zehn Tage (TODHUNTER et al.
1991) und wird durch den Einsatz von Antibiotika nicht wesentlich verkürzt (SMITH et al.
1985).
Allerdings werden auch euteradaptierte E.-coli-Stämme gleicher Serotypen (LINTON u. ROBINSON 1984) und Genotypen bei wiederkehrenden Erkrankungen be- schrieben (LIPMAN et al. 1995; BRADLEY u. GREEN 2001). Stämme, die rekurrente Mastitiden verursachen, vermochten in vitro schneller und in größerer Anzahl in Epithelzellen einzudringen als Stämme, die nur gelegentlich Mastitiden hervorrufen (DOPFER et al. 2000).
2.1.3.2 Lipopolysaccharid
Lipopolysaccharid (LPS) ist der primäre Virulenzfaktor der gram-negativen Bakterien. Dieses Strukturmotiv ist charakteristisch für E. coli und phylogenetisch hoch konserviert. Aufgrund dieser Eigenschaften wird es den Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (engl. Patho- gen-associated molecular patterns, PAMPs) zugeordnet. PAMPs werden durch pattern re- cognition receptors (PRRs) erkannt, die bei Immunzellen weit verbreitet sind. Eine Unter- gruppe der PRRs, die Toll-like-Rezeptoren, spielt eine wichtige Rolle bei der Auslösung einer Entzündungsreaktion. TLR4 ist der signaltransduzierende Rezeptor für LPS. Hierzu muss sich TLR4 gemeinsam mit CD14 und einem weiteren Molekül, dem MD2, zu einem trimolekula-
ren Komplex zusammenfügen, bevor LPS gebunden und die entsprechenden Aktivierungssig- nale transduziert werden können.
Neben Phospholipiden und weiteren Membranproteinen ist LPS ein Bestandteil der äußeren Zellmembran von E. coli. Es besteht aus dem lipophilen Lipid A, dem Lipopolysaccharidkern und sich wiederholenden Polysaccharid-Einheiten, so genannten 0-Antigenen, die außen lie- gen (CULLOR u. TYLER 2001). Das Lipid A von dem der toxische Effekt des LPS ausgeht (TYLER et al. 1992) dient der Interaktion zwischen LPS und dem Lipopolysaccharid- bindenden-Protein (LBP) und der Interaktion mit Lipoproteinen, sowie der Aktivierung des Komplementsystems (CULLOR u. TYLER 2001). Das an das LBP gebundene LPS wird CD14-abhängig durch den Toll-like-Rezeptor 4 der PMN und Epithelzellen der Milchdrüsen erkannt (STRANDBERG et al. 2005).
Das LPS wird bei der Vermehrung der Bakterien und mit dem Tod der Zelle aus der Zellwand freigesetzt und initiiert eine entzündliche Reaktion. Die Milchdrüse reagiert sehr empfindlich auf LPS und eine Mastitis kann schon durch geringe LPS-Konzentrationen induziert werden.
Es schädigt die sekretorischen Milchdrüsenepithelzellen nicht direkt, sondern es unterbricht den Blutfluss (SHUSTER et al. 1991). Systemische Effekte wie Anorexie, Fieber, Dehydra- tion und Diarrhoe werden ebenfalls durch LPS verursacht. Die Reduktion der Milchproduk- tion wird direkt und indirekt auf die lokalen und systemischen LPS-Effekte zurückgeführt.
2.1.3.3 Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist ein kugelförmiges, gram-positives Bakterium, das häu- fig in Traubenform angeordnet ist (sog. Haufenkokken). Seinen Namen verdankt es der häufig goldfarbenen Pigmentierung der Kolonien (BLOBEL et al. 1980). Staphylokokken sind un- beweglich und bilden keine Sporen. Die Größe des Bakteriums liegt üblicherweise zwischen 0,8–1,2 µm. S. aureus gehört zu den gram-positiven, fakultativ pathogenen Bakterien, die als Kommensalen auf Haut und Schleimhäuten vorkommen, jedoch auch lebensbedrohliche Er- krankungen wie beispielsweise Wundinfektionen, Toxisches Schocksyndrom, Endokarditis oder Sepsis auslösen können. Somit können als Ansteckungsherd für S.-aureus-Infektionen neben der Übertragung von Tier zu Tier durch das Melkgeschirr auch Wunden in der Euter- und Zitzenhaut dienen. Die Pathogenität von S. aureus beruht auf der Wirkung verschiedener Virulenzfaktoren (BLOBEL et al. 1980). Dazu gehört eine Polysaccharidkapsel (Biofilm) mit Protein A, die das Bakterium vor Phagozytose schützt. Das Protein A bindet Antikörper über deren Fc-Teil, und verhindert damit eine effektive Opsonisierung. Die Koagulase und der Clumpingfaktor bewirken die Ausbildung eines Fibrinwalls, der eine Erkennung von S. aureus durch Faktoren und Zellen des Immunsystems erschwert oder verhindert. Erst wenn sich der Keim stark vermehrt, wird mit Hilfe von Staphylokinase Fibrinolysin gebildet und
der Wall aufgebrochen. Mittels der Hyaluronidase, DNAsen, Lipasen und dem Hämolysin ist S. aureus im Stande, interzelluläres Bindegewebe und Parenchymzellen zu lysieren und inva- siv in den Wirtsorganismus vorzudringen. Leukocidine helfen dabei, die zellulären Bestand- teile der Immunantwort (Granulozyten und Makrophagen) zu schädigen. S. aureus kann, je nach Stamm, einzelne oder verschiedene Enterotoxine (ETC) produzieren. Diese wirken als Superantigene, indem sie an MHC-Klasse-II-Moleküle binden und nach Kreuzvernetzung T- Zellen zur Produktion von Zytokinen stimulieren (NOVICK 2003). Zu den Pathogenitätsfak- toren gehören zudem die Zellwandbestandteile Lipoteichonsäure (LTA) und Peptidoglykan (PGN) (MORATH et al. 2002b). Obwohl der Wirkmechanismus einzelner Virulenzfaktoren bereits bekannt ist, sind ihr Zusammenspiel und ihre Regulation bisher wenig verstanden (NOVICK 2003).
S. aureus kann den Zitzenkanal aktiv passieren, wodurch eine galaktogene Infektion begüns- tigt wird (HOEDEMAKER et al. 2001). Eine Infektion wird durch die Bildung von anti- phagozytotischer Faktoren (Polysaccharidkapsel, Protein A) begünstigt (SUTRA u. POUT- REL 1994; HENSEN et al. 2000b).
Die Fähigkeit dem Immunsystem zu entkommen und in verschiedenen Zellen zu überleben ist für die Persistenz der Erreger essentiell. S. aureus vermag an Epithelzellen des Euters zu ad- härieren, in diese einzudringen, sich in ihnen zu vermehren und zu persistieren (CIFRIAN et al. 1994b; ALMEIDA et al. 1996; HENSEN et al. 2000b). Überdies besitzt S. aureus die Fä- higkeit in Makrophagen (HEBERT et al. 2000) zu überleben. Darüber hinaus vermag Staphy- lokinase (SAK) an α-Defensine zu binden und deren bakterizide Wirkung zu blockieren (TARGOWSKI 1983) Außerdem hemmt die SAK die Opsonisierung, da sie Plasminogen zu Plasmin transformiert, welches IgG und C3b bindet.
Neben Streptococcus agalactiae und Streptococcus dysgalactiae ist S. aureus ein überaus wichtiger Erreger von subklinischen Mastitiden. Er ist der häufigste Auslöser der Mastitis beim Rind (SOBIRAJ et al. 1997; DE HAAS et al. 2004) und ist neben der großen Anzahl subklinischer Fälle auch ursächlich für klinischen Fälle (LAM et al. 1996). Im Gegensatz zur intramammären Infektion mit E. coli verlaufen die durch S. aureus hervorgerufenen Mastiti- den meist weniger schwer, resultieren aber sehr häufig in chronischen, bisweilen lebenslangen Infektionen (SUTRA u. POUTREL 1994). Dabei kommt es nicht selten zu subklinischen Mastitiden, die im Gegensatz zu den klinisch manifesten Verlaufsformen nicht durch eine grobsinnliche Symptomatik, jedoch durch bakteriologisch positive Befunde und erhöhte Milchzellzahlen (SCC, somatic cell count) gekennzeichnet sind (HAMANN u. FEHLINGS
2002). Betroffene Tiere stellen somit ein ständiges Erregerreservoir in der Herde dar (ROBERSON et al. 1994).
2.1.3.4 Lipoteichonsäure
Die Lipoteichonsäure (LTA, lipoteichonic acid) gilt als Pendant zum LPS der gram-negativen Bakterien, da sie ähnlich dem LPS immunmodulatorische Prozesse induziert (MORATH et al.
2002b; VON AULOCK et al. 2003).
Lipoteichonsäuren bestehen aus einer hydrophilen Kette aus Alditolphosphaten und einem amphiphilen Glycolipid, das als Membrananker fungiert. Andere Teichonsäuren haben im Gegensatz zu LTA keinen Lipidanker (GHUYSEN et al. 1994). Die physiologische Funktion von LTA ist bis heute nicht eindeutig geklärt. Es wird vermutet, dass LTA bei der Bindung von Metallionen und bei der Regulation der Aktivität von autolytischen Enzymen eine Rolle spielen könnte (FISCHER 1994). Die Rolle von LTA im Immunsystem des infizierten Wirtes ist vielfältig. Beispielsweise fördert es die Induktion bestimmter Transkriptionsfaktoren und folglich die Produktion und Sekretion von Zytokinen und Chemokinen (VON AULOCK et al.
2004). Die Erkennung von LTA erfolgt hauptsächlich von Makrophagen über CD14- Rezeptoren, teilweise vermittelt durch das LBP (Lipopolysaccharid-Binding Protein) (HERMANN et al. 2002). Unterschiedliche Angaben gibt es über die Beteiligung der Toll- like-Rezeptoren TLR2 und TLR4. Zum einen berichten einige Arbeitsgruppen über einen TLR4-abhängigen Erkennungsweg (YANG et al. 2001; UEHARA et al. 2002). Andere haben festgestellt, dass die LTA-Erkennung TLR2-abhängig ist (LEHNER et al. 2001; OPITZ et al.
2001; MORATH et al. 2002b).
Für die Persistenz der Keime könnte eine Modifikation der LTA verantwortlich sein. Geringe Veränderungen dieser Strukturen können die Erkennung über TLRs deutlich vermindern. Der Verlust von D-Alanylresten der LTA mindert bspw. die pro-inflammatorische Zytokinfrei- setzung drastisch (MORATH et al. 2002a).
2.2 Immunrelevante Zellen der Milchdrüse
2.2.1 Die funktionelle Relevanz der Leukozyten
Die Abwehr in der Milchdrüse beruht auf zwei komplexen Systemen, die miteinander gekop- pelt sind. Sie werden als „unspezifisch/angeboren“ und als „spezifisch/erworben“ bezeichnet.
Das Zusammenspiel dieser Systeme sorgt für eine effektive Abwehr und Elimination von Pa- thogenen.
Die zentrale Funktion des angeborenen Immunsystems ist darauf ausgerichtet, Erreger zu be- seitigen und – im Bedarfsfall – die Rekrutierung von antigenspezifischen Effektorzellen des spezifischen Immunsystems an den Ort der Infektion zu veranlassen. Es bedarf keiner voraus- gehenden Erregerexposition, um antigenunspezifische Effektorzellen zu aktivieren. Lösliche und zelluläre Bestandteile der angeborenen Immunität werden i.d.R. konstitutiv bereitgestellt.
Die Erkennung der Erreger kann entweder über präformierte, zellständige oder lösliche Re- zeptoren erfolgen (HOLLÄNDER 2006). Diese können eine große Anzahl an Pathogenen über deren konservierte PAMPs erkennen. Solche Motive sind zum Beispiel Zellwandbe- standteile, Lipopolysaccharide (LPS), Peptidoglykan (PGN), unmethylierte Oligonucleotide mit einem zentralen Cytosin-Guanosin-Motive (CpG-Motive) und Lipoteichonsäure (LTA) (GOLDAMMER et al. 2004). Diese ermöglichen dem angeborenen Immunsystem mit einem limitierten Repertoire an wirtsspezifischen Erkennungsmechanismen auf ein breites Erreger- spektrum zu reagieren (BANNERMAN et al. 2003).
Die im Rahmen von bakteriellen Infektionen wichtigen Zelltypen der Immunabwehr sind die- jenigen, welche das Vorliegen des Pathogens erkennen und nach dessen Bindung modulieren- de Signale aussenden (dendritische Zellen, Makrophagen, Mastzellen, Milchdrüsenepithelzel- len). Ziel dieser Signalgebung ist es, die Rekrutierung maßgeblicher Effektorzellen einzulei- ten, von denen neben Makrophagen (differenziert aus angelockten Monozyten) die neutrophi- len Granulozyten die wichtigste Population darstellen.
2.2.1.1 Neutrophile Granulozyten
Neutrophile Granulozyten (PMN, polymorphonuclear cells) sind hoch spezialisierte, kurzle- bige Phagozyten, deren Hauptaufgabe darin besteht, mikrobielle Erreger zu phagozytieren und abzutöten. Sie gelten als Haupteffektorzellen des angeborenen Immunsystems bei bak- teriellen Infektionen der Milchdrüse (PAAPE et al. 2003).
Bovine neutrophile Granulozyten sind sowohl funktionell als auch morphologisch denen an- derer Spezies zwar ähnlich, aber nicht identisch. Sie bilden neben den Lymphozyten die zweithäufigste Fraktion (25-45%) des Differentialblutbildes (TIZARD 2004). Sie sind 9- 16 µm groß und sind durch ihren gelappten Zellkern aus zwei bis fünf untereinander verbun- denen Segmenten gekennzeichnet. Durch diese Lappung ist es Granulozyten möglich, schnell durch die endotheliale Barriere zu migrieren (PAAPE et al. 2003). Der Nukleus ist entweder zentral oder exzentrisch in einem mit Granula beladenen Zytoplasma gelegen. Ausgereifte PMN besitzen drei unterschiedliche Typen von Granula, die Proteine enthalten, welche der Tötung der Mikroorganismen dienen. Die primären Granula, auch azurophile Granula be- zeichnet, enthalten Myeloperoxidase, α-Defensine, Bactericidal permeability inducing Protein (BPI), Lysozym und Serinproteasen wie Kathepsin G. Allen diesen Molekülen ist eigen, dass
sie eine ausgeprägte mikrobizide Wirkung besitzen (RAUSCH u. MOORE 1975). Die sekun- dären Granula werden auch spezifische Granula genannt und entstehen in der myelozytären Phase (JAIN 1967; BAINTON et al. 1971). Diese Granula sind charakteristischerweise mit Wright-Giemsa-Färbung anzufärben und sind Peroxidase-negativ. Sie enthalten die Enzyme Lysozym, Histaminase, Gelatinase und Kollagenase. Mit Hilfe dieser Enzyme können neutro- phile Granulozyten durch das Gewebe an den Ort der Entzündung gelangen. Zusätzliche Gra- nulainhaltsstoffe stellen Indolicin und β-Defensin dar (SELSTED et al. 1992a; SELSTED et al. 1992b). In neutrophilen Granulozyten von Schaf, Ziege und Rind kommt eine dritte Grup- pe von Granula vor (GENNARO et al. 1983). Diese Granula sind größer als die beiden ande- ren Granulatypen und sind beim Rind der dominierende Granulatyp (BAGGIOLINI et al.
1985). Sie enthalten den Großteil an anti-mikrobiellen Proteinen, wie zum Beispiel Lactofer- rin und eine Gruppe von kationischen Polypeptiden, die Baktenecine genannt werden (RO- MEO et al. 1988). Ausschließlich in diesen Granula sind sauerstoffunabhängige bakterizide Substanzen wie β-Defensine enthalten, die gegen gram-positive, gram-negative und anaerobe Bakterien sowie Pilze und Viren wirken (SAVOINI et al. 1984). Dieser Mechanismus ist in der Milchdrüse besonders wichtig, da im Euter der Sauerstoffgehalt gering ist. Drei verschie- dene β-Defensine konnten in diesen Granula nachgewiesen und charakterisiert werden (YOUNT et al. 1999). Diese kationischen und bakteriziden Granula-Proteine unterscheiden sich von denen, die für andere Spezies beschrieben werden. Für sie wird eine anti-mikrobielle Wirkung gegenüber S. aureus und E. coli beschrieben (SELSTED et al. 1992a; SELSTED et al. 1992b).
Neutrophile Granulozyten entwickeln sich im Knochenmark aus Stammzellen unter der koor- dinierenden Wirkung hämatopoetischer Wachstumsfaktoren wie Granulozyten-Makrophagen- Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Interleukin-3 und Granulozyten-Kolonie- stimulierender Faktor (G-CSF) über mehrere Entwicklungsstufen (Myeloblasten, Promyelo- zyten, Myelozyten und Metamyelozyten). Sie liegen zunächst als jugendliche Zellform als stabkernige neutrophile Granulozyten vor, deren länglicher Kern noch nicht segmentiert ist.
Erst mit zunehmender Alterung der Zelle zerfällt er in mehrere über Chromatinstege verbun- dene Segmente (LIEBICH 1993).
Nach der Freisetzung aus dem Knochenmark zirkulieren die PMN im Blutstrom, wobei sie besonders im Kapillargebiet engen Kontakt zum Endothel haben. Dieser Kontakt zu Endo- thelzellen wird über Adhäsionsmoleküle vermittelt.
Granulozyten gehören mit zu den Immunzellen, die als erste am Ort eines Infek- tionsgeschehens erscheinen. Entzündungsmediatoren (u.a. CXCL8, LTB4, C5a) wirken
chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten und induzieren auf Endothelzellen die Expression von Adhäsionsmolekülen. Innerhalb weniger Minuten wird das adhäsive P-Selektin exprimiert. Ein weiteres Selektin (E-Selektin) erscheint erst einige Stunden nach Aktivierung. Diese Selektine erkennen Kohlenhydratepitope verschiedener Glykoproteine auf Leukozyten. Das auf der Seite der Leukozyten exprimierte L-Selektin unterstützt das „Rollen“
der Zellen entlang der Gefäßwand. Diese Wechselwirkungen führen zu einer reversiblen Anheftung der Neutrophilen an die Gefäßwand. Im Wirkungsgebiet von Entzündungsmediatoren wird somit die Geschwindigkeit der PMN im Blutstrom bei der Annäherung an aktiviertes Endothel abgebremst (Margination). Diese Form der Adhäsion ermöglicht die folgenden, stärkeren Interaktionen, welche letztlich zur Extravasation der Granulozyten führen. Der Prozess der Extravasation setzt eine hochkoordinierte und dynamische Interaktion zwischen verschiedenen Adhäsionsmolekülen von PMN und den Zellen des Gefäßendothels voraus (SMITH u. ANDERSON 1991). Dieser Schritt ist abhängig von Wechselwirkungen zwischen den Leukozyten-Integrinen LFA-1 (Leukozyten-Funktions- assoziiertes-Antigen-1, CD11a/CD18) und CR3 (Complementrezeptor-3, CD11b/CD18, auch MAC-1 genannt) und interzellulären Zelladhäsionsmolekülen (intercellular cell adhesion molecule, ICAM-1) auf Endothelzellen. Die Verbindung von LFA-1 und CR3 mit ihren Liganden ist physiologischerweise nur schwach. Das von Endothelzellen und Immunzellen im Entzündungsbereich sezernierte CXCL8 bewirkt jedoch auf Leukozyten eine Konformationsänderung des LFA-1 und des CR3, wodurch die Affinität dieser Moleküle für ihre Liganden deutlich erhöht wird. Als Folge davon werden die Zellen an dieser Stelle des Endothels immobilisiert. Weitere adhäsive Wechselwirkungen werden über das Immunglobulin-ähnliche Molekül CD31 (auch PECAM: platelet endothelial cell adhesion molecule) vermittelt, das sowohl auf Leukozyten als auch an den Verbindungsstellen zwischen den Endothelzellen exprimiert wird (JANEWAY u. MEDZHITOV 2002). Die folgende Transmigration findet bevorzugt zwischen den Kontaktstellen von drei Endothelzellen („tricellular corners“) statt. Die PMN durchstoßen die Basalmembran mit Hilfe proteolytischer Enzyme, transmigrieren und gelangen entlang eines Konzentrations- gradienten von Entzündungsmediatoren in das betroffene Gewebe.
Die Erkennung von Pathogenen durch neutrophile Granulozyten erfolgt in erster Linie über Toll-like-Receptors (TLR). TLR sind so genannte Mustererkennungsmoleküle (PRR) des na- türlichen Immunsystems, welche das Vorhandensein einer Infektion signalisieren. Diese Re- zeptoren sind entweder auf der Oberfläche oder im Zytoplasma exprimiert und stimulieren bei entsprechender Liganden-Bindung die Zelle zur anti-mikrobiellen Abwehr. Neutrophile ex- primieren konstitutiv alle TLR außer TLR3 (O'MAHONY et al. 2008). In Folge einer Bin-
dung von Antigen an TLR werden Gene exprimiert, die direkt bei der Entzündungsreaktion beteiligt sind. Hierzu gehören TNF-α, IL-1, CXCL8, IL-12, E-Selektin (CD62E) und unter- schiedlicher Proteine, die beim Abtöten von intrazellulär gelegenen Mikroorganismen eine wesentliche Rolle spielen. Dies führt zur Phagozytose und ROS-Bildung. Des Weiteren wird Antigen über Rezeptoren für Immunglobuline (CD16 und CD32) erkannt.
Die Produktion und Freisetzung von Zytokinen werden durch IL-1, IL-2, TNF oder GM-CSF stimuliert (LLOYD u. OPPENHEIM 1992). Außerdem können Granulozyten am Ort der Ent- zündung sowohl die für die Phagozytoseleistung nötigen Moleküle wie zum Beispiel Aktin, Fcγ-Rezeptoren und Komplementrezeptoren synthetisieren als auch wichtige Mediatoren für die Entzündungsreaktion (Interferon α, Platelet activating factor (PAF) und LTB4) bilden und freisetzen. Über diese Fähigkeit, aktivierungsabhängig Zytokine und Chemokine zu sezernie- ren, beeinflussen PMN unmittelbar Mechanismen der adaptiven Immunantwort (CASSA- TELLA 1999).
Ein aktivierter Granulozyt des Blutes vermag bis zu zwanzig Bakterien zu phagozytieren und zu töten. In der Milch ist diese Leistung allerdings herabgesetzt, da die Zellen 38% weniger Glykogenreserven haben als Blut-PMN (NEWBOULD 1973). Außerdem benötigen sie für die Phagozytose eine große Membranfläche, die zur Bildung von Pseudopodien dient, die die Bakterien fangen und umschließen sollen. Durch die Aufnahme von Milchfettglobuli und Kasein wird Membran internalisiert und somit die Phagozytoseleistung reduziert (PAAPE et al. 1975; PAAPE u. GUIDRY 1977). Pathogene werden mit Hilfe reaktiver Sauerstoffmeta- bolite und bakterizider lysosomaler Enzyme nach Verschmelzung der Phagosomen mit den Lysosomen zu Phagolysosomen inaktiviert (KARNOVSKY u. BADWEY 1986; BELAAO- UAJ et al. 1998). Ein namhafter Teil der von bovinen Granulozyten gebildeten Metaboliten gelangt durch Exozytose auch in das umliegende Gewebe (LEINO u. PAAPE 1993). Eine längere Exposition durch Neutrophile resultiert in erheblichen Schäden am sekretorischen Epithel, welche zur dauerhaften Reduktion der Milchproduktion führen (SORDILLO u. BA- BIUK 1991). Deswegen ist eine schnelle Elimination der PMN nach erfolgter Neutralisation der Bakterien durch die Makrophagen sehr wichtig, um die Schäden in der Milchdrüse zu minimieren.
Für Granulozyten ist in Kälbern eine Halbwertzeit von 8,9 Stunden beschrieben (CARLSON u. KANEKO 1975). Durch die Wirkung lokal produzierter Zytokine im Entzündungsgebiet verlängert sich die Lebenszeit dieser relativ kurzlebigen Zellen (BLISS et al. 1999). Die spontane Apoptose bei Neutrophilen verzögert sich (WATSON et al. 1997). In Untersuchungen von VAN OOSTVELDT et al. (2002) war die Apoptose nach Migration
durch Kalbhautmembranen erhöht und konnte durch einen Epithelzellmonolayer aufgehoben werden.
2.2.1.2 Makrophagen
Makrophagen werden in der Literatur als der dominierende Zelltyp in der gesunden involuten und laktierenden Milchdrüse beschrieben (JENSEN u. EBERHART 1981; SORDILLO et al.
1987). Sie sind in der Regel organständige Effektorzellen, welche in vielen Geweben ange- siedelt sind und sich dort durch ihre Fähigkeit zur Phagozytose auszeichnen. Die Vorläufer- zellen der Makrophagen sind Monozyten, die sich im Knochenmark entwickeln. Anschlie- ßend wandern sie in die Blutgefäße, in denen sie im Blutstrom durch den Körper zirkulieren.
Kommen sie während dessen in Kontakt mit Infektionen, sind sie wie neutrophile Granulozy- ten in der Lage, verstärkt in das betroffene Gewebe einzuwandern. Dort differenzieren sie unter Einfluss von Zytokinen und Erreger-Substanzen in Makrophagen (TIZARD 2004).
Makrophagen enthalten eine Vielzahl hydrolytischer Enzyme. Lysozym, β-Glucuronidase, saure Phosphatase, Kathepsin, Hydrolasen, Esteroproteasen, neutrale Proteasen, Ribonuclea- sen und Lipasen können zum Teil als Antwort auf aktivierende Signale durch Fc- und Kom- plement-Rezeptoren, sowie nach Zytokinstimulation sezerniert werden. Makrophagen besit- zen spezifische Rezeptoren für IFN-γ, IL-4, GM-CSF und TNF-α. Durch rezeptorvermittelte Erkennung von IL-10 können sie suprimiert werden. Sie selbst sezernieren pro- inflammatorische Zytokine (z.B. IL-1, IL-6, CXCL8, GM-CSF und TNF-α) und fördern somit die Mobilisation von Neutrophilen aus dem Knochenmark und deren Anlockung. Außerdem bewirken diese Zytokine die Produktion von Akut-Phase-Proteinen in der Leber, die am In- fektionsort die Opsonisierung und die Elimination der Erreger fördern.
Makrophagen sind aktiv phagozytierende Zellen der Milchdrüse (SORDILLO u. STREI- CHER 2002). Makrophagen erkennen PAMPs unter anderem über Mannose-Rezeptoren, Scavenger-Rezeptoren, CD14 und Toll-like-Rezeptoren. Die Expressionsstärke der TLRs kann über Zytokine (z.B. IFN-γ, GM-CSF) deutlich gesteigert werden (O'MAHONY et al.
2008). Für die indirekte Erkennung von Erregern verfügen Makrophagen über Komplement- und Fc-Rezeptoren. Durch opsonisierende Antikörper und nach Komplementaktivierung kann die Phagozytoseleistung der Makrophagen bedeutend erhöht werden (SORDILLO u. STREI- CHER 2002).
Zusätzlich zu Pathogenen können Makrophagen auch Zelldebris und Milchkomponenten ver- dauen (SORDILLO et al. 1987). Allerdings verringert sich durch die Aufnahme von Fett, Ka- sein und anderen Milchkomponenten die Erreger-Phagozytose (PAAPE et al. 1975; PAAPE u. GUIDRY 1977). Besonders in der peripartalen Zeit sind die phagozytotische und die bakte-
rizide Leistung herabgesetzt (WEBER et al. 1983). Dies könnte damit zusammenhängen, dass die opsonisierende Aktivität dieses Milchserums herabgesetzt ist (WALLER 2000). Da ihre Anzahl im Infektionsgeschehen gering ist, wird vermutet, dass die Phagozytosefunktion der Makrophagen in der Milchdrüse weniger wichtig ist als die der Neutrophilen. Wahrscheinlich hat die Fähigkeit, die Migration und bakterizide Aktivität der neutrophilen Granulozyten zu fördern, eine größere Bedeutung (VAN KAMPEN u. MALLARD 1997; KEHRLI et al.
1999).
Als weitere wichtige Funktionen der Makrophagen sind die Elimination von gealterten, zer- störten sowie apoptotischen körpereigenen Zellen und die Gewebeheilung durch Narbenbil- dung (Granulationsgewebe) und Angiogenese zu nennen.
2.2.1.3 Lymphozyten
In der Literatur findet man zahlreiche Studien über zelluläre Reaktionen nach intramammärer Infektion. Viele dieser Arbeiten fokussieren auf die unspezifische Immunabwehr in der Milchdrüse, namentlich die Funktion von Neutrophilen und Makrophagen. Seltener wurde die Rolle der Lymphozyten zum Schutz der Milchdrüse gegen Infektionen untersucht. Lympho- zyten kommen in signifikanter Anzahl in der Milchdrüse und Milch sowie in den Sekreten von trockenstehenden Milchdrüsen von Wiederkäuern vor (SORDILLO u. NICKERSON 1988; PARK et al. 2004). Es konnte gezeigt werden, dass die Größe dieser Zellpopulationen entscheidend für die Entwicklung einer effektiven Immunantwort nach intramammärer Infu- sion von Bakterien war (LEE u. LASCELLES 1970).
αβ αβαβ
αβ-T-Lymphozyten
Diese T-Zellen exprimieren einen T-Zellrezeptor der aus einer α- und einer β-Kette besteht.
Beim Rind exprimieren reife T-Zellen entweder den Co-Rezeptor CD4 oder CD8 (CD4+-T- Zellen, CD8+-T-Zellen). CD4+-T-Zellen gelten funktionell in der Regel als T-Helferzellen und besitzen einen Rezeptor, welcher Antigene im Kontext von MHC-Klasse-II-Molekülen von speziellen Antigen-präsentierenden Zellen (dendritische Zellen, Makrophagen, B- Lymphozyten) erkennt. Aktivierte CD8+-T-Zellen fungieren als zytotoxische T-Zellen und erkennen ihr antigenes Peptid MHC-Klasse-I-restringiert. Obwohl diese funktionelle Unter- scheidung weitestgehend zutrifft, kennt man ebenso zytotoxische CD4+-T-Zellen und CD8+T-Helferzellen (HOLLÄNDER 2006).
T-Helferzellen zeigen eine funktionelle Dichotomie, indem sie nach Aktivierung eher pro- oder eher anti-inflammatorische Zytokine sezernieren (BROWN et al. 1998).
TH1-Zellen sezernieren IFN-γ und IL-2. Dadurch werden Makrophagen aktiviert, und die MHC-Klasse-II-Expression wird gesteigert. Diese Zytokine fördern die Bildung zytotoxischer T-Zellen und die Produktion von Antikörper-Isotypen, die besonders gut Komplement fixie- ren können. Gleichzeitig hemmen diese Zytokine eine TH2-Antwort. Zur Bildung von TH1- Zellen kommt es im Rahmen der Antigenpräsentation dann, wenn dendritische Zellen bei der Antigenpräsentation IL-12 sezernieren. Darüber hinaus sind TH1-Zellen in der Lage Infektio- nen zu bekämpfen, die durch Bakterien hervorgerufen werden, welche sich in den Vesikeln von Makrophagen vermehren.
TH2-Zellen sezernieren vorwiegend TNF-β, IL-4 und IL-10. Diese Zytokine hemmen die Bil- dung von TH1-Zellen. Sie fördern besonders den Isotypwechsel bei Antigen-aktivierten B-Zellen und führen zur Bildung vorwiegend neutralisierender Antikörper. Überdies hemmt IL-10 die Aktivierung von Makrophagen.
Die Aktivität CD8+ zytotoxischer T-Zellen (CTL) richtet sich im Allgemeinen gegen infi- zierte Zellen, Tumorzellen und histoinkompatible Transplantate. Werden zytotoxische CD8+- T-Zellen durch Bindung an eine MHC-I-tragende Zelle, welche ein fremdes Antigen präsen- tiert, aktiviert, so schütten sie Perforine und Granzyme aus. Diese induzieren in den MHC-I- tragenden Zellen die Apoptose. Zudem produzieren und sezernieren aktivierte CTL auch IFN-γ, welches in vielen anderen Zellen vor allem anti-virale Wirkungen entfaltet und sowohl Makrophagen als auch neutrophile Granulozyten aktiviert.
Die relativen Verhältnisse von CD4+-zu CD8+-T-Zellen können je nach Lokalisation und Laktationsstadium sehr unterschiedlich sein. Im Blut überwiegen die CD4+-T-Zellen, das Verhältnis von CD4+-zu CD8+-T-Zellen liegt laut Literatur zwischen 1,52 und 3,35 (PARK et al. 1992; TAYLOR et al. 1997; ASAI et al. 1998; ASAI et al. 2000). Auf die Bedeutung im Gewebe und in der Milch gesunder Milchdrüsen wird in 2.2.2 näher eingegangen.
γδ γδγδ
γδ−−−−T-Zellen
Eine kleine Population von T-Zellen zeichnet sich dadurch aus, dass sie einen Antigenrezep- tor exprimieren, der sich aus schwach polymorphen γ- und δ-Ketten zusammensetzt. Diese so genannten γδ-T-Zellen bilden neben αβ-T-Zellen und den B-Zellen die dritte Lymphozyten- fraktion, die bei Vertebraten nachgewiesen werden konnte. Morphologisch können einige der γδ-T-Zellen als „Large Granular Leukocytes“ (LGL) ausgewiesen werden, da in ihrem Zyto- plasma viele Granula vorkommen. Ungeachtet dieser morphologischen Eigenheiten ist der größte Teil der γδ-T-Lymphozyten durch ihre Zellform und Größe von konventionellen Lym- phozyten nicht zu unterscheiden. Obwohl γδ-T-Zellen viele zellständige Moleküle und Effek- torfunktionen einschließlich der Zytokinproduktion und der zytotoxischen Aktivität mit den
αβ-T-Zellen gemeinsam haben, gibt es bezüglich der biologischen Eigenschaften etliche be- merkenswerte Unterschiede zwischen diesen beiden Zellgruppen.
γδ-T-Lymphozyten dienen generell der Überwachung epithelialer Oberflächen (HOLLÄNDER 2006). Rinder weisen im Vergleich zu anderen Spezies einen sehr hohen Ge- halt an γδ-T-Lymphozyten auf, der im juvenilen Organismus bei 60% der T-Zellen liegt.
Außerdem ist die γδ-T-Zell-Rezeptordiversität in Rind und Schaf sehr hoch (TIZARD 2004).
Dieser Zelltyp migriert zu epithelialen Geweben wie Haut, Darmmukosa, Reproduktionstrak- tes und Milchdrüse und wird dort in hoher Frequenz (bis zu 50% der Leukozyten) gefunden (ALLISON u. HAVRAN 1991; MACKAY u. HEIN 1991). Besonders bei Wiederkäuern fin- det man γδ-T-Zellen in Milchdrüsensekreten und Milchdrüsengeweben in höheren Anteilen als im Blut (SHAFER-WEAVER et al. 1996).
γδ-T-Zellen erkennen Antigen in einer Weise, die sich grundlegend von der Antigendetektion bei αβ-T-Zellen unterscheidet. Sie können an eine große Vielfalt von unterschiedlichen Anti- genen unverzüglich binden, da diese weder prozessiert noch von konventionellen MHC- Molekülen präsentiert werden müssen. Sie sind in der Lage einerseits konstitutiv exprimierte Antigene auf körpereigenen Zellen und auf mikrobiellen Erregern zu erkennen. Andererseits detektieren sie induzierte Antigene, die von transformierten, geschädigten und/oder gestress- ten körpereigenen Zellen exprimiert werden. Hierzu gehören die ubiquitären und phylogene- tisch stark konservierten Heat-shock-Proteine (hsp), welche bei Zellstress infolge von Infekti- onen, Entzündungen und/oder Transformation freigesetzt werden (HOLLÄNDER 2006). Sie können zum einen durch ihr zytotoxisches Potential veränderte epitheliale Zellen zerstören (MACKAY u. HEIN 1991; YAMAGUCHI et al. 1999). Zum Beispiel waren unter IL-2 Ein- fluss kultivierte γδ-T-Zellen in der Lage, humane maligne Mammakarzinomzelllinien zu er- kennen und zu lysieren (MIESCHER et al. 1990). Zum anderen spielen γδ-T-Zellen in der Abwehr von bakteriellen Infektionen eine wichtige Rolle. Sie vermögen Zytokine zu sezernie- ren, sowie γδ-T- und B-Lymphozyten zu regulieren. Die von den αβ-T-Zellen bekannte funk- tionelle Dichotomie in TH1- und TH2-polarisierten Zellen gilt auch für die Population der γδ-T-Zellen (HOLLÄNDER 2006).
Durch ihre bevorzugte Lage in unmittelbarer Nähe zu Epithelien sind γδ-T-Zellen befähigt, vor allem in der Mukosa eine schnelle Immunantwort gegen Erreger zu leisten. Es konnte gezeigt werden, dass in Phasen erhöhter Mastitisempfänglichkeit der Anteil der γδ-T-Zellen im mammären Parenchym signifikant reduziert war (SHAFER-WEAVER et al. 1996). Dies lässt vermuten, dass γδ-T-Zellen eine wichtige Rolle in der mammären Infektionsabwehr spie- len.
B-Lymphozyten
B-Lymphozyten sind als einzige Zellen in der Lage Antikörper zu bilden. Im Gegensatz zu den T-Lymphozyten ist der Anteil B-Zellen während der verschiedenen Laktationsstadien relativ konstant (SHAFER-WEAVER et al. 1996). Werden B-Zellen durch Antigene aktiviert, können sie sich, entsprechende T-Zell-Hilfe vorausgesetzt, zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen und Gedächtniszellen differenzieren. Lösliche Antikörper fungieren als Opsoni- ne und neutralisieren sowohl bakterielle Toxine als auch die Adhäsionsfähigkeit von Bakteri- en (TARGOWSKI 1983; CONCHA 1986; SORDILLO et al. 1997). Eine Antikörperproduk- tion konnte für Plasmazellen aus der Milch nachgewiesen werden (CONCHA 1986).
2.2.1.4 Mastzellen
Mastzellen sind gewebeständige Sensor- und Effektorzellen des angeborenen Immunsystems.
In elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnten Mastzellen in der Milchdrüse nahe den Epithelzellen nachgewiesen werden (LUDEWIG 1996). Durch ihre Fähigkeit präformier- te Mediatoren nach Aktivierung freizusetzen und Entzündungsmediatoren neu zu bilden, nehmen sie an initialen Abwehrmechanismen nach Erregerkontakt teil, steigern die Effektor- zell-Rekrutierung und steuern Induktionsprozesse adaptiver Immunantworten.
Der Mastzell-Phänotyp hängt von der Gewebelokalisation ab. Die Zellen lassen sich in zwei Subtypen unterteilen: Mastzellen, welche Tryptase (MZt) und solche, die Tryptase und Chy- mase (MZtc) in ihren Granula aufweisen. Chymase-positive Mastzellen befinden sich in der duodenalen Lamina propria, um Bronchioli herum und in den alveolären Septen sowie in der Haut. MZt sind generalisiert zu finden und haben beim Rind einen besonders hohen Gehalt an Tryptase (JOLLY et al. 2000). Die beiden Hauptproteasen sind in der Lage neben Gewebs- umbildungen auch die Immigration von Leukozyten zu fördern (HUANG et al. 1998). Auf das in den Granula vorhandene Histamin wird weiter unten gesondert eingegangen.
Aktivierte Mastzellen setzten zusätzlich zum Inhalt ihrer Granula auch noch andere biologisch aktive Moleküle frei, die sowohl auf die Früh- als auch auf die Spätphase der Entzündungsre- aktion Einfluss nehmen. Durch die Freisetzung der Lipidmediatoren Leukotrien C4 (LTC4) und Leukotrien B4 (LTB4) wird die Vasopermeabilität gesteigert und die Immigration von Granulozyten gefördert. Mukosale MZ bilden mehr LTC4 wodurch verstärkt Eosinophile Granulozyten angezogen werden und Bindegewebs-Mastzellen bilden LTB2, wodurch Neutrophile angelockt werden (MARSHALL 2004).
Mastzellen produzieren zahlreiche Zytokine und Chemokine. Zu ihnen gehören die klassi- schen pro-inflammatorischen Zytokine wie TNF-α oder IL-1β und anti-inflammatorische
bzw. immunmodulatorische Zytokine wie IL-10 und TGF-β. Obwohl Mastzellen hauptsäch- lich als Quelle für T-Helfer 2 (TH2)-Typ Zytokine, wie IL-4, IL-5, IL-13, beschrieben werden, können sie auch Zytokine des TH1-Typs, wie IFN-γ, IL-12 oder IL-18 produzieren. Auch CXCL8 und CXCL10 als Chemokine des TH1-Typs werden von Mastzellen gebildet (DI NARDO et al. 2003). Wie differenziert diese Zytokine freigesetzt werden können, zeigt ein Nagermodell. Auf einen LPS-Stimulus hin, wurde selektiv TNF-α, IL-1β, GM-CSF und IL-6 freigesetzt. Eine Degranulation blieb aus. Eine Stimulation mit Peptidoglykan, einem Zell- wandbestandteil der gram-positiven Bakterien, führte hingegen zur Freisetzung von anderen Zytokinen (IL-4, IL-, IL-6 und GM-CSF) bei gleichzeitiger Degranulation (SUPAJATURA et al. 2001).
Die Mastzellen tragen zahlreiche Rezeptoren auf ihrer Oberfläche (Abb. 1, A und B). Unter anderem exprimieren sie den für die Erkennung von LPS, dem PAMP gram-negativer Bakte- rien, den TLR4 (MCCURDY et al. 2001; SUPAJATURA et al. 2001) (Abb. 1, A). In huma- nen und murinen Mastzellen konnte ebenfalls eine Expression von TLR2 nachgewiesen wer- den und man vermutet das dieser Rezeptor für die Erkennung von Peptidoglykan (PGN) ver- antwortlich ist (SUPAJATURA et al. 2002). Mastzellen exprimieren zudem einen hoch affi- nen Rezeptor für IgE und einen mäßig affinen Rezeptor für IgG. Nach IFN-γ-Stimulation ex- primieren sie zudem hoch affine Rezeptoren für IgG (WOOLHISER et al. 2001). Mit diesen Antikörperrezeptoren sind sie ebenfalls in der Lage, indirekt die Gegenwart von Bakterien zu erkennen und darauf zu reagieren (Abb. 1, B). Ein weiterer Weg die Effektorfunktion von Mastzellen zu stimulieren, ist die Bindung von Anaphylatoxinen wie C3a und C5a und dem Nerve Growth-factor (NGF) (Abb. 1, C). Dabei entscheiden sowohl deren Konzentrationen als auch das Muster der freigesetzten Entzündungsmediatoren über die Stärke des Signals und die Wirkung auf Mastzellen (HOLLÄNDER 2006). Eine Übersicht der Zellen in der Milch- drüse wird in Tab. 2 aufgeführt.
A: Direkte Interaktionen B: Fc-Rezeptor vermittlelte Aktivierung
C: Komplement-Rezeptor vermittelte Aktivierung
A: Direkte Interaktionen B: Fc-Rezeptor vermittlelte Aktivierung
C: Komplement-Rezeptor vermittelte Aktivierung
Abb. 1 Die wichtigsten Aktivierungspfade von Mastzellen in Folge von Interaktionen mit Pathogenen nach MARSHALL (2004).
Mastzellen können sowohl direkt als auch indirekt nach Pathogen-Exposition aktiviert werden. A:
Über TLRs können Mastzellen direkt mit dem Erreger interagieren. Dies führt zur Zytokinproduktion, aber nicht zur Degranulation. B: Die Fc-Rezeptor vermittelte Aktivierung (indirekte Erkennung) führt zur Degranulation von Mastzellen und der Produktion neuer Mediatoren. C: Die Komplement- Rezeptor vermittelte Aktivierung (indirekte Erkennung) wird über mehrere Komplementrezeptoren vermittelt, wie z.B. CR3 (Rezeptor für C3b). Dies führt vornehmlich zur Zytokinproduktion oder Re- zeptorenexpression für die Komplement-Spaltungsprodukte, wie z.B. CR5a (Rezeptor für C5a), die in den meisten Fällen zur Degranulation führen.
Tab. 2 Übersicht der Zellen in der Milchdrüse modifiziert nach SORDILLO und STREICHER (2002).
Zellart Biologische Funktion Neutrophile
Granulozyten
Phagozytose und intrazelluläres Töten von Bakterien, Sekretion anti-bakterieller Faktoren
Makrophagen Phagozytose und intrazelluläres Töten von Bakterien, Antigen-Präsentation über MHC-Klasse-II-Moleküle;
Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine T-Lymphozyten
CD4+ Produktion von Zytokinen nach Erkennung von Antigen über MHC-Klasse-II
CD8+ Lyse von veränderten oder beschädigten körpereigenen Zellen- nach Erkennung von Fremd-Antigen über MHC-Klasse-I; Pro- duktion von Zytokinen mit direkten bzw. indirekten zytolyti- schen Effekten (TNF-α und IFN-γ) oder zur Unterstützung der humoralen Antwort (IL-4)
γδ-T-Zellen Biologische Rolle ist in der Milchdrüse noch nicht hinreichend geklärt
B-Lymphozyten
Reife B-Zellen Antigen-Präsentation durch membrangebundene Antikörper Ausbildung von Gedächtniszellen
Plasmazellen Terminal differenzierte B-Lymphozyten, die Antigen- spezifische Antiköper synthetisieren und sezernieren Mastzellen Induktion angeborener Immunantworten und Steigerung der
Effektorzell-Rekrutierungen. Biologische Rolle in der Milch- drüse noch nicht hinreichend geklärt
2.2.2 Zellpopulationen in der Milch einer gesunden Milchdrüse
Ein somatischer Zellgehalt (SSC) zwischen 20.000 und 100.000 Zellen pro mL Milch wird als physiologischer Zellgehalt angesehen (HAMANN u. FEHLINGS 2002).
Die Angaben über die Anteile der Zellpopulationen variieren in der Literatur. Für Makropha- gen werden Anteile von 13% bis 95% der Gesamtleukozytenzahl beschrieben. Für Granulozy- ten variieren die Werte zwischen 0% und 37% sowie für lymphoide Zellen zwischen 5% und 28% (PAAPE et al. 1981; CONCHA 1986; WEVER u. EMANUELSON 1989; LEITNER et
al. 2000b). Auch für die lymphozytären Subpopulationen in der Milch findet man sehr unter- schiedliche Angaben (PAAPE et al. 2000; PARK et al. 2004), die darüber hinaus in der peri- partalen Zeit stark schwanken (SHAFER-WEAVER et al. 1996). Die B-Lymphozyten sind in der peripartalen Phase zu 25% vertreten. Ihr Anteil fällt zum Ende der Laktation auf 7% der lymphoiden Zellen ab. Der Anteil der T-Lymphozyten liegt in der peripartalen Phase bei nur 16% der Gesamtlymphozyten und steigt zum Ende der Laktation auf 62% an. Davon reprä- sentieren γδ-T-Lymphozyten nur einen kleinen Anteil der Lymphozytenfraktion (TAYLOR et al. 1997).
αβ-T-Lymphozyten sind überwiegend CD8+-T-Zellen (TAYLOR et al. 1997; PARK et al.
2004). Die funktionelle Relevanz der erhöhten Zahl von CD8+-T-Zellen in der Milch gesun- der Tiere ist noch nicht hinreichend geklärt. Es wird vermutet, dass zytotoxische T-Zellen eine das Epithel schützende Funktion inne haben, indem sie MHC-Klasse-I-vermittelt alte oder beschädigte sekretorische Zellen beseitigen (TARGOWSKI 1983). Bisher wurde im Eu- ter jedoch noch keine Aktivität zytotoxischer T-Zellen beobachtet (BURVENICH et al.
1999). Das Verhältnis CD4+/CD8+-T-Zellen in der Milch gesunder Milchdrüsen liegt bei 0,8
± 0,6. Es konnte allerdings gezeigt werden, dass die immunregulatorischen Eigenschaften von dem Laktationsstadium abhängen. In der Mitte der Laktation befindliche Kühe wiesen CD8+- T-Zellen mit hoher zytotoxischer Aktivität auf. In der postpartalen Phase war die zytotoxische Aktivität reduziert, während die Expression von IL-4 mRNA (als Anzeichen einer TH2- Antwort) hochreguliert war (SHAFER-WEAVER u. SORDILLO 1997). PARK et al. (1992) und TAYLOR et al. (1997) vermuten einen Zusammenhang zwischen dem erhöhten Mastitis- risiko der peripartalen Phase und dem herabgesetzten CD4+/CD8+-Verhältnis. Obwohl diese Ergebnisse vermuten lassen, dass die Anteile dieser Lymphozytensubpopulationen die Im- munabwehr der Milchdrüse beeinflussen, konnte ihre funktionelle Relevanz noch nicht hin- reichend geklärt werden.
Des weiteren befinden sich in der Milch noch Epithelzellen (2%), eosinophile Granulozyten, Monozyten und Plasmazellen, deren zahlenmäßiger Anteil jedoch so gering ist, dass er bei einer quantitativen Betrachtung außer Acht gelassen werden kann (HAMANN 1992). Der Zellgehalt der Milch ist von verschiedenen Faktoren abhängig. Mit steigender Anzahl an Lak- tationen steigt im Mittel auch die Zellzahl, was v.a. durch einen Anstieg an PMN verursacht wird (BURVENICH et al. 1994). Auch mit fortschreitendem Laktationsstadium nimmt die Zellzahl zu, wobei hier jedoch eine Zunahme aller Zellarten festgestellt wurde (DOGGWEI- LER u. HESS 1983). Auch das Melkintervall hat einen Einfluss auf die Zellzahl. Ein Melkin- tervall von 4 Stunden verursacht einen signifikant höheren Zellgehalt im Viertel- anfangsgemelk als ein Melkintervall von 12 Stunden (HAMANN et al. 1997). Unterschied- liche Rassen wie Braunvieh, Simmentaler, Fleckvieh und Schwarzfleckvieh zeigen zwar di-
