3.2 Material
3.2.8 Kulturmedien, Puffer und Lösungen
Alle Kulturmedien, Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua tri-dest. angesetzt. Die Einzelreagenzien sind unter 3.2.3 aufgeführt.
3.2.8.1 Zellkulturmedien und Zusätze
Für die Kultivierung von Leukozyten wurden die Medien RPMI und Iscove (3.2.3) verwen-det. Um Komplementaktivität auszuschließen und eventuell vorhandene Mykoplasmen abzu-töten, wurde das eingesetzte fetale Kälberserum (FCS, 3.2.3) bei 56°C für eine Stunde inku-biert. Ein mit Penicillin-Streptomycin-Lösung (3.2.3) versetztes Medium wurde mit einem hochgestellten ‚+‘-Zeichen gekennzeichnet
Iscove®-Medium mit 10% (v/v) fetalem Kälberserum (I10F+) (3.2.3):
Iscove® DMEM mit L-Glutamin 500 mL Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 10 % (v/v) Penicillin-Streptomycin-Lösung 10 mg
RPMI-Medium mit 10% (v/v) fetalem Kälberserum (R10F+) (3.2.3):
RPMI liquid mit Hepes u. L-Glutamin 500 mL Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 10 % (v/v) Penicillin-Streptomycin-Lösung 10 mg
RPMI-Kulturmedium für die pbMEC-Kulturen
Für die Kultivierung von pbMEC-Kulturen wurde das Medium RPMI (3.2.3) nach (HENSEN et al. 2000b) modifiziert.
RPMI 1640 450 mL
L-Methionin (200mM) 0,1 mmol/L
L-Lysine (1M) 0,4 mmol/L
Natriumpyruvat (100mM) 0,01 mmol/L
Prolaktin (Sigma) (5mg/mL) 1 µg/mL
Hydrocortison (1mg/mL) 1 µg/mL
Insulin (5mg/mL) 1 µg/mL
Glutamin (200mM) 1 µmol/L
Penicillin-Streptomycin-Lösung 1 % (v/v) Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 10 % (v/v)
Collagenaselösung für den Verdau von Milchdrüsengewebe
Für die Aufarbeitung von 200 g Milchdrüsengewebe wurden 2,5 L der Collagenaselösung kurz vor der Verwendung vorbereitet.
HBSS 2500 mL
HEPES 1 mol/L
Collagenase-Lösung (20000 U/mL) 50 mL
HBSS+ (Hanks Balanced Salt Solution mit Antibiotikumzusatz)
HBSS 500 mL
HEPES 1 mol/L
Penicillin-Streptomycin-Lösung 10 mL
Gefrierlösung zum Einfrieren der pbMEC
Die Zellen wurden nach der Gewinnung und Aufreinigung in FCS aufgenommen und zum Einfrieren mit einem gleichen Volumen Gefrierlösung versetzt (3.3.17).
Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 8 mL
20% DMSO 2 mL
Trypsinlösung
Das wie im Folgenden beschriebene vorbereitete Trypsin wurde in Aliquots zu 2 mL bei -20°C gelagert. Zum Reinigen der pbMEC-Kulturen wurde diese Lösung 1:2 mit PBS ver-dünnt.
Trypsin-EDTA (Ausgangskonz. 0,5%) 1 mL
Aqua dest. 9 mL
LPS-Stammlösung
Stocklösungen von LPS wurden in I10F+ auf die siebenfache Finalverdünnung (7 µg/mL) eingestellt. Diese Stocklösungen wurden in aliquoten Mengen von 100-500 µ L bei -20°C ge-lagert.
PAMP-Stammlösung für pbMEC-Stimulationsansätze
Die LTA vom Stamm S. aureus 1027 und das LPS vom Stamm E. coli 1303 wurde von Sonja von Aulock (Biochemische Pharmakologie, Universität Konstanz, Fach M665) hochrein her-gestellt und zur Verfügung her-gestellt. LTA-Stocklösungen lagen in einer Konzentration von 5 mg/mL und LPS Stocklösungen in einer Konzentration von 1 mg/mL in RPMI 1640 (3.2.3) vor. Diese Stocklösungen wurden in aliquoten Mengen von 500 µ L bei -20°C gelagert.
Hitzegetötete Erreger-Stammsuspensionen für pbMEC-Stimulationsansätze
Die Stocksuspensionen von E.-coli-Stamm 1303 (3.2.5), hitzegetötet und S.-aureus-Stamm 1027 (3.2.5), hitzegetötet, lagen in einer Konzentration von 5 x 108/mL in RPMI 1640 vor.
Diese Stocksuspensionen wurden in aliquoten Mengen von 500 µ L bei -20°C gelagert.
3.2.8.2 Material für die Separation von Zellen
Lymphozytenseparationsmedium
Das Lymphozytenseparationsmedium (3.2.3) ist eine isotone, wässrige Lösung aus Natrium-diatrizoat und einem hochmolekularen Zucker mit einem Zusatz des Röntgenkontrastmittels Isopaque. Bei 10°C besitzt das Separationsmedium eine Dichte von 1,077 g/mL. In dieser Arbeit wurde das Lymphozytenseparationsmedium unverdünnt verwendet.
Percoll
Bei Percoll (3.2.3) handelt es sich um ein synthetisches Sol aus Polyvinyl-Pyrolidon-beschichteten Silikatpartikeln mit einem spezifischen Gewicht von 1,130 g/mL bei 20°C.
Durch Zugabe von 0,9 g NaCl pro Liter Percoll wurde die Isotonie erreicht (100%-iges, iso-tones Percoll). Für die Separation reiner PMN (3.3.3) wurde die 100%ige Stammlösung mit PBS (0,9%-ig) zu einer 70%-igen Lösung verdünnt.
Natriumchloridlösung, 0,9%
NaCl 8,77 g
Aqua tridest. ad 1000 mL
Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ohne EDTA
Die PBS-Trockensubstanz (3.2.3) wurde in Aqua tridest. gelöst. Es wurden folgende Bestand-teile eingewogen:
NaCl 8,0 g
KCl 1,24 g
Na2HPO4 0,2 g
KH2PO4 0,2 g
Aqua tridest. ad 1000 mL
Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Phosphatpuffer, doppelt konzentriert (2 x PBS)
Zur Herstellung wurde die doppelte Menge an PBS-Trockensubstanz eingesetzt (3.2.3) und mit Aqua tridest. auf 1000 mL ergänzt.
Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer)
bovines Serumalbumin 5,0 g
Natriumazid (NaN3) 0,1 g
PBS ad 1000 mL
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
3.2.8.3 Lösungen zum Fixieren und Quantifizieren von bovinen Zellen
Paraformaldehydlösung zum Fixieren von Referenzzellen
Paraformaldehyd 40 mg
PBS ad 1000 mL
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Acridin-Orange-Ethidiumbromid-Lösung für die lichtmikroskopische Zellzählung
Acridin-Orange 250 mg
Ethidiumbromid 250 mg
PBS ad 100 mL
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
3.2.8.4 Lösungen für die Durchflusszytometrie
Zur Reinigung des Gerätes wurde das Messkanalsystem nach den Messungen mit steril fil-triertem Aqua tridest. und 1%-iger Natriumhypochlorit-Lösung (3.2.3) gespült.
Trägerflüssigkeit
Als Trägerflüssigkeit für die durchflusszytometrische Messung wurde steril filtriertes (0,2 µm) PBS mit 0,1 mg/mL NaN3 (Natriumazid) verwendet (3.2.3).
Propidiumjodid-Stammlösung
Die Stammlösung von 100 µg/mL Propidiumjodid (3.2.3) gelöst in Trägerflüssigkeit wurde in aliquoten Teilen bei -20°C gelagert. Zum Anfärben toter Zellen wurden der Trägerflüssigkeit entsprechende Teile der Stammlösung zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2 µg/mL zu erreichen.
JC-1-Stammlösung
Der für die Apoptosebestimmung verwendete Farbstoff 5, 5´, 6, 6´-Tetrachloro-1, 1´, 3, 3´-Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid (JC-1) (3.2.3) wurde in einer Stockkonzentration von 2 mol/L in DMSO (3.2.3) aufgenommen und in Aliquoten von 20 µ L bei -20°C eingefro-ren. JC-1 wurde mit PBS verdünnt und in einer Konzentration von 7 µmol/L eingesetzt.
3.2.8.5 Materialien für die Histaminbestimmung
Kontroll-Puffer (Pipes B)
Es handelt sich um eine gepufferte Lösung die nach einem Grundrezept von MAASCH et al.
(1984) modifiziert wurde.
Aqua tridest 100 mL
NaCl 13,7 mmol/L
KCl 0,27 mmol/L
Na2HPO4 0,81 mmol/L
KH2PO4 0,112 mmol/L
CaCl2 2 mmol/L
MgCl2 2 mmol/L
Vor der Verwendung wurde diese Lösung auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt.
Tris-Puffer
Der Tris-Puffer (0,5 mol/L, (3.2.3) dient der Pufferung der Acylierungsreaktion. Zur besseren Verteilung der Lösung im RIA-Röhrchen wurde Tween 20 (3.2.3) in einer Konzentration von 0,02% zugesetzt.
Histamin-Standards
Die Histamin-Standard-Reihe wurde mit Lösungen der Endkonzentrationen 0,3 ng/mL, 1 ng/mL, 3 ng/mL, 10 ng/mL in 0,1 N Salzsäure (HCl) angesetzt. Zur Herstellung des Stan-dards wurde das als freie Base in kristalliner Form vorliegende Histamin auf der Laborwaage abgewogen und in 0,1 N HCl gelöst. Pro Standard wurden 10 mL hergestellt und in Aliquots zu 1 mL bei einer Temperatur von 20°C gelagert. Die jeweils in Gebrauch befindlichen Ali-quots wurden bei einer Temperatur von 4°C aufbewahrt.
Acylierungsreagenz
NHS-Biotin (3.2.3) wurde in einer Konzentration von 50 mg/mL in DMSO (3.2.3) angesetzt und in Aliquots zu 1 mL bei -20°C gelagert. Für das Acylierungsreagenz wird es 1:25 mit
Pipes-A (3.2.3) verdünnt. Dieses Acylierungsreagenz dient der chemischen Umwandlung des nativen Histamins in N-Acyl-Histamin. Das native Ziege-anti-Acylhistamin-Serum wurde in einer Verdünnung von 1:200 in PBS bei einer Temperatur von -20°C gelagert. Im RIA wurde das Serum in einer Endverdünnung von 1:10.000 im folgenden Reaktionsansatz eingesetzt:
PBS 96 mL
Ziege-anti-Acylhistamin-Nativserum 1:100 2 mL
Ziegenserum, normal 1 mL
Natriumazid, 10% 0,2 mL
Präzipitationslösung
Die im RIA gebildeten Immunkomplexe aus N-Acyl-Histamin bzw. 125Jod markiertem Tra-cer-Histamin und Anti-Histamin-Antikörpern des Ziegenserums wurden mit Hilfe eines Zie-gen-IgG-spezifischen, polyklonalen Eselserums (donkey-anti-goat IgG (3.2.3) präzipitiert.
Die Präzipitationslösung war wie folgt zusammengesetzt:
PBS 500 mL
Donkey-anti-goat-Serum 2,5 mL
Polyethylenglycol (PEG) 8000 25 g
Triton X 100, 25% 1 mL
Natriumazid, 10% 1 mL
Die genannten Reagenzien wurden, wenn nicht anders angegeben, bei einer Temperatur von 4°C gelagert.
3.2.8.6 Materialien für die Zytokinbestimmung
Beschichtungspuffer (A-Puffer), pH 9,6
Na2CO3 5 mmol/L
NaHCO3 35 mmol/L
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Wasch- und Verdünnungspuffer (B-Puffer), pH 7,2
NaH2PO4 x H2O 2,5 mmol/L
Na2 HPO4 7,5 mmol/L
NaCl 145 mmol/L
Tween 20 0,1 % (v/v)
Der Puffer wurde als 10-fach konzentrierte Stocklösung angesetzt und vor der Verwendung auf die Gebrauchskonzentration eingestellt. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Substratpuffer (C-Puffer), pH 5,0
Citrat 33,3 mmol/L
Na2 HPO4 66,7 mmol/L
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Alle Puffer wurden in Aqua dest. angesetzt und mit 1 mmol/L HCL bzw. 3 mmol/L NaOH (3.2.3) auf den jeweiligen pH-Wert eingestellt.
Substratlösung
TMB in DMSO 15 mmol/L
H2O2 5 mmol/L
Die Lagerung von TMB erfolgte bei einer Temperatur von -20°C. Die Substanzen wurden unmittelbar vor der Verwendung in C-Puffer gelöst.