Modulierender Einfluss von Milchseren und deren Inhaltsstoffen

Hier sollte untersucht werden, ob Milchseren verschiedener Infektionsstadien der E.-coli-Mastitis die Vitalität und die Apoptose von Leukozyten beeinflussen (3.3.16.4).

Einfluss von Milchseren nicht-infizierter Tiere auf die Vitalität neutrophiler Granulozy-ten

Im Kulturmedium stieg der Anteil apoptotischer PMN nach 24 h in vitro deutlich an (Abb. 36, A). In den Ansätzen mit Milchserum nicht (Goldstandard-Milchserum) bzw. noch nicht in-fizierter Euterviertel (Milchserum vor Infektion) lag der Anteil apoptotischer Zellen schon nach 2h Inkubationszeit höher, um über 12 h und 24 h in vitro signifikant gegenüber der Me-diumkontrolle zu steigen (Abb. 36, A).

Das Kulturmedium hatte keinen Zeiteinfluss auf den Anteil nekrotischer PMN (Abb. 36, B), während die Milchseren nicht bzw. noch nicht infizierter Euterviertel nach 12 h zu einem sig-nifikanten Anstieg des Anteils nekrotischer PMN führten, der sich nach 24 h in vitro nicht oder nur marginal änderte (Abb. 36, B).

0 12 24

Medium Goldstandard-Milchserum Milchserum vor Infektion

apoptotische PMN (%) nekrotische PMN (%)

Inkubationszeit (h) Inkubationszeit (h)

Medium Goldstandard-Milchserum

2 12 24

2 12 24

Abb. 36 Einfluss von unverdünntem Milchserum auf die Vitalität von neutrophilen Granulozyten im Vergleich zum Medium.

Legende siehe folgende Seite.

Dargestellt sind die Anteile apoptotischer PMN (A) und nekrotischer PMN (B) zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach Inkubation in drei unterschiedlichen Medien: I10F⁺-Medium, Milchserum einer Goldstandard-Kuh und Milchserum der M-08 vor Inokulation von E. coli. Die Unterschiede zwischen den Medium-Ansätzen und den Milchserum-Ansätzen stellten sich nach 12 h und 24 h Inkubation signifikant dar. a Der Anteil apoptotischer PMN war signifikant höher (p<0,05). b Nach 24 h Inkuba-tion war der Unterschied der Anteile apoptotischer Zellen zum Mediumansatz in den Goldstandard-Milchserum signifikant (p<0,01) und in den Goldstandard-Milchserum vor Infektion hochsignifikant (p<0,0001). c und d. Der Anteil nekrotischer Zellen in den Ansätzen mit Goldstandard-Milchserum war schwach signifikant (p<0,05) und in den Ansätzen mit Milchserum vor der Infektion signifikant höher (p<0,01).

Die PMN wurden aus dem Blut von 8 Tieren gewonnen.

Einfluss von Milchseren verschiedener E.-coli-Infektionsstadien auf die Vitalität neut-rophiler Granulozyten

Hierfür wurden Milchseren der Kuh M-08 verwendet, die vor der Inokulation von E. coli (E.c 0 h) und die 12 h und 24 h nach intrazisternaler Applikation des Erregers (E.c 12 h und E.c 24 h) gewonnen wurden (3.3.16.4).

Zusammengefasst in Abb. 37 ergab sich folgendes Bild. Der pro-apoptotische Effekt eines Milchserums vor Infektion verlor sich signifikant, wenn die Ansätze mit Milchseren durchge-führt wurden, die 12 h oder 24 h nach der Infektion gewonnen wurden (Abb. 37, A). Ein ver-gleichbares Bild ergab sich nach Betrachtung der nekrotischen Zellen. Auch hier reduzierte der Einsatz von Milchseren den Anteil signifikant gegenüber Ansätzen mit Milchseren, die vor der Infektion gewonnen wurden (Abb. 37, B).

0 12 24

apoptotische PMN (%) nekrotische PMN (%)

Inkubationszeit (h) Inkubationszeit (h) a

b

c d

Milchserum vor Inokulation (E.c 0 h)

Milchserum 12 h nach Inokulation (E.c 12 h) Milchserum 24 h nach Inokulation (E.c 24 h) Milchserum vor Inokulation (E.c 0 h)

Milchserum 12 h nach Inokulation (E.c 12 h) Milchserum 24 h nach Inokulation (E.c 24 h)

2 12 24

Abb. 37 Einfluss von Milchseren E.-coli-infizierter Euterviertel auf die Vitalität neut-rophiler Granulozyten.

Dargestellt sind die Anteile apoptotischer PMN (A) und nekrotischer PMN(B) zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach Inkubation in 3 verschiedenen unverdünnten Milchseren: Milchserum der M-08 vor Inokulation (E.c 0 h) sowie 12 h (E.c 12 h) und 24 h (E.c 24 h) nach Inokulation von 500 KbE E. coli.

a In dem Milchserum E.c 0 h war der Anteil apoptotischer PMN schwach signifikant höher (p<0,05).

b Nach 24 h Inkubation war der Unterschied der Anteile apoptotischer Zellen zum Milchserum E.c 0 h in den Milchseren E.c 12 h signifikant (p<0,01) und in den Milchseren E.c 24 h hochsignifikant (p<0,0001) höher. c und d Der Anteil nekrotischer Zellen war in den Ansätzen mit dem Milchserum E.c 12 h signifikant (p<0,01) und in den Ansätzen mit Milchserum E.c 24 h hoch signifikant erhöht (p<0,0001). Die PMN wurden aus dem Blut von 8 Tieren gewonnen.

Die oben dargestellten Analysen wurden mit in vitro Kulturen reiner PMN durchgeführt. Um zu prüfen, ob mononukleäre Zellen auf die Absterbe-/Apoptoserate einen Einfluss nehmen, wurden identische Ansätze mit PMN/MNC-Mischkulturen durchgeführt. Dabei wurden ver-gleichbare Ergebnisse ermittelt (Daten nicht dargestellt). Daraus wurde geschlossen, dass der gezeigte Einfluss der Milchseren auf die PMN direkt und nicht indirekt über die Aktivie-rung/Modulation anderer leukozytärer Zellpopulationen erfolgt.

Einfluss des pH-Wertes

Da die geprüften Milchseren einen unterschiedlichen pH-Wert aufwiesen, wurde das Kultur-medium auf entsprechende pH-Werte eingestellt, um den Einfluss des pH-Wertes beurteilen zu können. In der Tat stieg pH-Wert-abhängig der Anteil apoptotischer Zellen mit depolari-sierten Mitochondrienmembranen signifikant an. Nach 24 h in vitro unterschieden sich alle Medien signifikant voneinander (Abb. 38).

Inkubationszeit (h)

**

*

**

apoptotische PMN (%)

0 12 24

0 10 20 30

pH 6,5 pH 7 pH 7,5

*

2 12 24

Abb. 38 Einfluss des pH-Wertes auf die Vitalität der PMN.

Dargestellt ist der Anteil apoptotischer Zellen nach Inkubation in Kulturmedium mit verschiedenem pH für unterschiedliche Zeiten in vitro. Die PMN wurden aus dem Blut von 8 Tieren gewonnen.

(*=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,0001)

Überprüfung der Milchseren aus Infektionsversuchen mit E. coli und S. aureus

Für das Milchserum des Tieres M-08 wurde ein protektiver Effekt auf die Vitalität neutrophi-ler Granulozyten festgestellt. Im Folgenden wurde geprüft, ob dies ebenfalls für die Milchse-ren der andeMilchse-ren E.-coli-infizierten Tiere und diejenigen der S. aureus-infizierten Tiere zutraf.

Alle Milchseren, die vor (0 h) und 24 h p.i. gewonnen wurden, kamen in einer Endverdün-nung von 1:2 in vitro zum Einsatz und wurden mit den PMN zweier gesunder Tiere inkubiert.

Der Einfluss der 0 h-Kontroll-Milchseren der Kühe aus den E.-coli- und aus den S.-aureus-Infektionsversuchen auf die Zellvitalität war unterschiedlich stark. Während nach der Inkuba-tion mit E.-coli–0 h-Milchserum 100 ± 5 x10³ vitale Zellen erfasst werden konnten, lag die Zahl vitaler PMN nach der Inkubation mit S.-aureus–0 h-Milchseren mit 85 ± 7 x10³ vitalen Zellen deutlich, aber nicht signifikant niedriger (Abb. 39).

vitale PMN (x10³/mL)

Abb. 39 Der Einfluss der Milchseren aus den Infektionsversuchen auf die Vitalität der neutrophilen Granulozyten.

A) Anzahl vitaler neutrophiler Granulozyten (Mittelwerte ± SEM) nach Inkubation in verschieden Milchseren (1:2 im Kulturmedium). B) Anteile apoptotischer PMN (Mittelwerte ± SEM). Je Ansatz wurden n=5 Milchseren aus den Infektionsversuchen mit E. coli und S. aureus mit PMN aus dem Blut von 2 Tieren geprüft, deren Werte gemittelt wurden.

Milchseren der Kontroll-Euterviertel 24 h p.i. zeigten weder nach E.-coli- noch nach S.-aureus-Infektion signifikante Unterschiede zu den jeweiligen 0 h-Milchseren (Abb. 39, A).

Die nach der Infektion gewonnenen Milchseren aus den E.-coli-infizierten Eutervierteln be-wirkten eine signifikante Reduktion der vitalen PMN auf 61 ± 11 x10³ PMN (p<0,05) wäh-rend die nach Infektion gewonnenen Milchseren aus den S.-aureus-infizierten Eutervierteln

keinen Vitalitäts-mindernden Effekt für die PMN aufwiesen (Abb. 39, A). Im Gegensatz zu den vitalen Zellen, führten die 0 h-Milchseren der S.-aureus-infizierten Tiere zu signifikant höheren Anteilen apoptotischer PMN als die 0 h-Milchseren der E.-coli-infizierten Tiere (Abb. 39, B). Auf die Anteile der apoptotischen Zellen in vitro hatte das Stadium der Infekti-on keinen signifikanten Einfluss (Abb. 39, B).