Gewinnung und Stimulation von primären bovinen

Zur Gewinnung von primären bovinen Milchdrüsenepithelzellen (pbMEC) wurde im Schlachthaus des Forschungsinstituts für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere in Dum-merstorf von einer Kuh nach dem Schlachten das Euter abgetrennt. Unverzüglich wurden die Gewebeproben aus der Milchdrüse entnommen. Nach dem Reinigen des Euters mit 96% E-thanol wurde in dem Bereich der Zitze mit einem sauberen Schlachtermesser ein tiefer Saggi-talschnitt gesetzt. Ca. 200 g wurden herausgelöst und in ein Becherglas mit vorgelegtem HBSS⁺ gegeben (3.2.8.1). Das Becherglas wurde mit steriler Aluminiumfolie verschlossen und auf Eis gestellt. Im Labor wurden alle weiteren Schritte unter einer Sterilbank der Klasse 2 getätigt. Vorbereitend wurden 12 L HBSS⁺ für die Aufarbeitung von vier Eutervier-teln auf 37°C erwärmt. Zunächst wurde das Gewebe in 500 mL Flaschen mit 300 mL HBSS⁺ überführt und einmalig gespült. Das Stützgewebe und Blutgefäße wurden vom sekretorischen Gewebe mit einem Skalpell und Schere entfernt. Die Eutergewebestücke wurden auf ca.

2 cm³ große Stücke zugeschnitten. Diese wurden in einer Petrischale mit frisch vorgelegter HBSS⁺-Lösung in Scheiben geschnitten und zweimalig mit HBSS⁺ in einer 500 mL Flasche gewaschen. Anschließend wurden die Gewebestücke auf ein grobes Sieb gegeben und mit einem Trichter zurück in eine 500 mL Flasche mit jeweils 150-200 mL vorgelegter Colla-genaselösung (3.2.8.1) gegeben. Für 30-40 Min. wurde die Flasche in ein auf 37°C

vorge-wärmtes Wasserbad gelegt und alle 5 Min. geschüttelt. Die Collagenaselösung wurde mit Hil-fe eines Siebes über ein Becherglas abgegossen. Dieser erste Überstand wurde verworHil-fen. Das Gewebe wurde in 500 mL-Flaschen mittels Trichter überführt und mit 200 mL HBSS (ohne Zusatz von Antibiotika) in einer 500 mL Flasche gewaschen. Anschließend wurde der Ver-dauungsvorgang drei Mal wiederholt. Die Überstände wurden nach jedem Schritt geerntet.

Das verbleibende Gewebe wurde verworfen. Die Überstände wurden zuerst durch ein „feines Haushalts-Sieb“ passiert und in einem 50 mL Zentrifugen-Röhrchen aufgefangen. Es schloss sich ein Zentrifugationsschritt an (300 x g ohne Bremse, 5 Min., 20°C) Mit einer Pumpe wur-de wur-der Überstand abgesaugt, mit frischem R10F^+-Medium aufgefüllt und erneut bei 250 x g ohne Bremse 5 Min. lang zentrifugiert. Beim Absaugen des Überstandes wurde darauf geach-tet auch lose Bestandteile (mit rötlicher Farbe) mit abzusaugen oder durch leichtes Schwen-ken zu lösen. Das nun entstandene Pellet wurde in 40 mL HBSS resuspendiert, abermals ge-siebt (Porengröße ~ 0,5 mm²) und erneut für 5 Min. bei 250 x g zentrifugiert. Das Pellet wur-de resuspendiert und durch ein Zellsieb (Porengröße 100 µm) (3.2.1) passiert. Ziel war es, einen klaren Überstand ohne Lyse-Produkte zu erhalten. Ein letztes Mal wurde für 5 Min. bei 250 x g zentrifugiert und das Zellpellet in R10F⁺ (3.2.3) aufgenommen. Alle drei Suspensio-nen wurden gepoolt und die Gesamtzellsuspension bei 250 x g für 5 Min. zentrifugiert. Die Zellen wurden auf eine Dichte von 5-10 x10⁵ Zellen/mL in FCS eingestellt.

Einfrieren und Auftauen von pbMEC

Um die Behandlung der pbMECs zu standardisieren, wurden alle Aliquots zunächst bei -90°C in einer Gefrierlösung (3.2.8.1) eingefroren. Die pbMECs wurden hierfür auf eine Dichte von 1 x10⁶ Zellen/mL in vorgekühltem fetalen Kälberserum (FCS) eingestellt und mit einem glei-chen Volumen Gefrierlösung (3.2.8.1) zu Aliquots à 1 mL in ein 1,5 mL Reaktionsgefäß ver-bracht. Die Aliquots wurden in einen Cryo-Freezing-Container (3.2.2) überführt und auf -90°C herunter gekühlt.

Zum Auftauen wurden die Zellen aus dem flüssigen Stickstoff herausgenommen und sofort in einem 37°C warmen Wasserbad aufgetaut und anschließend auf Eis gestellt. Danach wurden die Zellen in 9 mL auf 4°C gekühltem R10F⁺-Medium aufgenommen. Die Zellsuspension wurde bei 150 x g für 5 Min. bei 15°C zentrifugiert. Das Pellet wurde wiederum in Kulturme-dium mit 10% FCS und 50 µg/mL Penicillin-Streptomycin-Lösung resuspendiert. Die Zell-suspension wurde auf 9 cm-Durchmesser-Zellkulturschalen ausgebracht, die, wie im folgen-den Absatz beschrieben, vorbereitet wurfolgen-den.

Beschichtung der Kulturgefäße mit Collagen-Lösung

Die Beschichtung der Kulturschalen dient der verbesserten Adhärenz der Zellen auf den Plat-ten. Hierfür wurden die gamma-bestrahlten Zellkulturschalen mit Collagenlösung (4 mg/mL Aqua dest.) befüllt und unter der Laminair über Nacht getrocknet. Es folgte eine 15-minütige UV-Bestrahlung der Platte. Die Platten konnten maximal 2 Wochen gelagert werden.

Reinigen und Passagieren der pbMEC

Auf einer 9 cm-Durchmesser-Zellkulturschale wurde die Zellsuspension in einer Dichte von ca. 5 x10⁵ Zellen ausgesät. Nach 24 h wurde das Medium ausgetauscht, um abgestorbene Zel-len zu entfernen. Anschließend wurde alle 48 h das Medium erneuert.

Nach 6-7 Tagen wurden die Zellen gereinigt. Im Durchlichtmikroskop wurden drei pbMEC-Kolonien (fleckenartige Anordnung, pflastersteinartig, Abb. 9B) markiert. Das Kulturmedium wurde abgenommen und der Zellrasen zwei Mal mit 5 mL PBS gewaschen. Dann wurde 1 mL Trypsin-EDTA 0,025% zugesetzt und bei 37°C 3 Min. inkubiert. Anschließend wurde unter Sichtkontrolle der Zeitpunkt abgewartet an dem Fibroblasten sich gelöst haben, die pbMEC aber noch an der Platte hafteten. Die Trypsin-EDTA-Lösung mit den Fibroblasten und nicht haftenden pbMEC wurde abgesaugt und der Zellrasen drei Mal mit 5 mL PBS ge-waschen. Die pbMEC-Kolonien erreichten nach zwei weiteren Tagen im Brutschrank eine Konfluenz von 60-80%. Zum Passagieren der pbMEC wurde den Zellen 1 mL Trypsin-EDTA 0,25% zugefügt. Die Zellen wurden für etwa 20 Min. unter Sichtkontrolle inkubiert. Wenn unter Sichtkontrolle im Durchlichtmikroskop eine Loslösung beobachtet werden konnte, wur-den die Zellen in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen überführt, mit 30 mL Medium versetzt und mit 150 x g 5 Min. bei 15°C zentrifugiert. Anschließend wurden pbMEC auf eine Dichte von ca. 3 x10⁵ Zellen/mL eingestellt und in 1 mL auf 6-well-Zellkulturplatten ausgesät.

Abb. 9 pbMEC-Kulturen in verschiedenen Wachstumsstadien.

A) Primäre bovine MEC-Kulturen in 10-facher Vergrößerung drei Tage nach dem Aussäen. Im Kreis liegen pbMEC-Kolonien und im Quadrat sind Fibroblastenkolonien anhand ihrer fischzugartigen Ko-lonie-Morphologie zu erkennen. B) Einige pbMEC-Kolonien wurden markiert, um diese bei der Rei-nigung mit Trypsin-EDTA-Verdünnungen zu erhalten (4-fache Vergrößerung). C) pbMEC kurz nach der Reinigung mit Trypsin-EDTA-Lösung (10-fache Vergrößerung). Nur noch vereinzelt finden sich Fibroblasten (Quadrat). D) Pflastersteinartige Morphologie der pbMEC 4 Tage nach der Reinigung (20-fache Vergrößerung).

3.3.17.1 Stimulation von pbMEC mit Bakterien und PAMPs

Primäre bovine MEC (pbMEC) wurden, wie unter 3.3.17 beschrieben, bis zur Konfluenz kul-tiviert. Die Zellkulturen wurden zwei Mal mit PBS gewaschen und ein Mediumwechsel durchführt. Zu parallelen Ansätzen wurden folgende Stimuli gegeben: a) 1 x10⁷/mL E.-coli-Bakterien (Stamm 1303), b) 1 x10⁷/mL S.-aureus-Bakterien (Stamm 1027), c) 1 µg/mL LPS vom E.-coli-Stamm 1303 (3.2.8.1), d) 10 µ g/mL LTA vom S.-aureus-Stamm 1027 (3.2.8.1).

Die Kulturen wurden entweder 6 h oder 18 h in vitro stimuliert. Danach wurden zellfreie

A

C D

B

Überstände gewonnen, in 15 mL Zentrifugenröhrchen überführt und umgehend bei -20°C eingefroren. Die Zellen wurden zwei Mal mit PBS gewaschen und anschließend deren mRNA präpariert.

Präparation der mRNA

Nach zweimaligem Waschen der pbMEC-Kulturen wurde in jede Vertiefung der 6-well-Zellkulturschalen 1 mL Trizol (3.2.3) gegeben. Die Platten wurden 5 Min. auf einem Platten-schüttler bei 500 rpm inkubiert. Die Zellen wurden mit Hilfe eines Zellschabers von den Bö-den der Kulturschalen gelöst und in 1,5 mL Reaktionsgefäße (3.2.2) überführt. Durch die Zu-gabe von 200 µ L Chloroform wurden die Proteine und Salze des Zelllysates gefällt, indem das Gemisch 3 Min. auf Eis stehen gelassen wurde. Es folgte ein Zentrifugationsschritt (15 Min., 14.000 x g, 4°C). Der klare RNA enthaltende Überstand wurde abgenommen und in ein neues 1,5 mL Reaktionsgefäß überführt. Durch die Zugabe von 500 µ L Isopropanol und nach der Inkubation auf Eis für 10 Min. wurde die RNA gefällt und anschließend zentrifugiert (10 Min., 14.000 x g, 4°C). Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde resuspendiert und mit 1 mL Ethanol gewaschen (Zentrifugation 5 Min., 14.000 x g, 4°C). Der Überstand wurde wiederum verworfen. Das Pellet wurde unter der Sterilbank getrocknet und darauf folgend in 50 µ L RNAse-freiem H2O (DEPC- behandelt, 3.2.3) aufgenommen. Von dieser Lösung wur-de 1 µ L in ein NanoDrop®-Gerät (3.1) gegeben, das durch die Messung wur-der OD die Konzent-ration der RNA ermittelte. Die Reinheits- und Integritätsbestimmung wurde mit 1 µg RNA nach dem Protokoll von YANG et al. (2008) durchgeführt.

3.3.17.2 Quantitative reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion

Um zu prüfen, ob die Stimulation der pbMEC-Kulturen erfolgreich war, wurde die Kopien-zahl der kodierenden mRNA für TNF-α, TGF-β, CXCL8 und LAP gemessen. Die quantitati-ve requantitati-verse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) erfolgte mit dem Sybr Green Fast Start Kit (3.2.3) in einem LightCycler (3.1) durch Abteilung für Molekularbiologie der FBN Dummerstorf unter Leitung von Hans-Martin Seyfert. Die Daten wurden für die Aus-wertung zur Verfügung gestellt.