Einfluss aktivierter Milchdrüsenepithelzellen

Die physiologische Rolle der Milchdrüsenepithelzellen (MEC) bei der Immunantwort auf die verschiedenen Erreger ist noch immer nicht vollständig geklärt. Sie stellen für eindringende Pathogene nach der Überwindung des Strichkanals, der Milchgänge und nach den Makropha-gen in der Milch, die erste Barriere direkt in den Organismus dar. In bisheriMakropha-gen In-vitro-Studien wurde hauptsächlich der Einfluss von Mastitiserregern und ihrer PAMPs auf die Ex-pression der mRNA untersucht (STRANDBERG et al. 2005, YANG et al. 2008, WELLNITZ und KERR 2004). Auch in den eigenen Untersuchungen wurden aus bovinen Milchdrüsen generierte primäre Milchdrüsenepithelzellen mit den im Infektionsversuch eingesetzten Erre-gern (E. coli Stamm 1303 und S. aureus Stamm 1027) und deren PAMPs LPS und LTA sti-muliert und die Expression verschiedener Zytokin-mRNA-Spezies erfasst. In Übereinstim-mung mit STRANDBERG et al. (2005) und YANG et al. (2008) wurde die RNA-Expression von TNF-α und CXCL8 durch die Stimulation mit E.-coli-Bakterien und deren LPS gestei-gert. Des Weiteren konnte der Erfolg der Stimulation mit einer Aufregulation von TGF-β und dem β-Defensin LAB nachgewiesen werden. Die Stimulation mit S. aureus und seinem PAMP LTA war bezüglich der Erhöhung der RNA-Expression von TNF-α und CXCL8 we-niger deutlich, aber es konnte bewiesen werden, dass der komplette Erreger oder LTA eine Modulation der mRNA-Expression bewirkt. Eine Erhöhung der Expression von CXCL8 wur-de bereits von WELLNITZ und KERR (2004) beobachtet.

Im Folgenden stellte sich die Frage, ob im Überstand aktivierter pbMEC Produkte erscheinen, welche die Apoptose und Nekrose von bovinen PMN modulieren. Ohne die Produkte näher identifiziert zu haben, reduzierten die Überstände sowohl E. coli/LPS- wie auch LTA-stimulierter pbMEC signifikant den Anteil apoptotischer PMN, ohne jedoch die Zahl vitaler PMN zu beeinflussen. Die Faktoren erschienen relativ rasch, bereits 6 h nach Beginn der Sti-mulation, im Kulturüberstand; eine länger andauernde Stimulation konnte die Konzentration oder die Wirksamkeit nicht signifikant erhöhen. Die Reduktion der Zahl apoptotischer PMN, bei gleichzeitiger Beibehaltung der Zahl vitaler Zellen in vitro, lässt sich als echte Hemmung der Apoptose unter Vermeidung der Nekrose begreifen. Insofern können Milchdrüsenepithel-zellen nach Erregerkontakt in der Tat Einfluss auf die Lebensspanne dieser Zellen beim Durchtritt in das alveoläre Lumen nehmen.

Die Regulation der Apoptose und Nekrose boviner neutrophiler Granulozyten erwies sich in der Summe als äußerst komplex. Neben Faktoren in der Milch gesunder wie auch infizierter Euterviertel, welche die Lebensspanne verlängern konnten auch solche identifiziert werden, die das exakte Gegenteil bewirken. Die Klärung der Frage, welche relative Bedeutung die einzelnen Faktoren auf der Zeitachse vom Eindringen des Erregers bis zur Ausbildung einer entzündlichen Reaktion haben, bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten. Entscheidend für die Regulation scheint nicht der isoliert betrachtete Faktor sondern vielmehr sein Zusam-menspiel mit anderen Faktoren und residenten Zellen zu sein.

6 Zusammenfassung

Sonja Meyer Untersuchungen zur Beeinflussung funktioneller Eigenschaften von poly-morphkernigen neutrophilen Granulozyten in der initialen Phase der bovinen Mastitis

Die Mastitis ist die wirtschaftlich bedeutendste Einzeltiererkrankung in der Milchproduktion.

Bisher konnten frühe Erreger-Wirts-Interaktionen nicht hinreichend geklärt werden, um zu-frieden stellende Prophylaxe- und Therapiekonzepte zu entwickeln. Im Rahmen eines wissen-schaftlichen Gesamtkonzeptes sollte diese Arbeit dazu beitragen, die Interaktion zwischen Erregern, Milchdrüsenepithelzellen und somatischen Zellen der Milch in der frühen Ent-zündungsphase vergleichend zu untersuchen. Dazu wurde ein experimentelles In-vivo-Infektionsmodell für Staphylococcus aureus und Escherichia coli, den häufigsten Erregern klinischer Mastitiden beim Rind, etabliert. Begleitend wurden im Rahmen von In-vitro-Studien frühe Erreger-Wirts-Interaktionen auf ihre Bedeutung für die Regulation der Vitalität von neutrophilen Granulozyten untersucht.

Es wurde ein Mastitis-Modellsystem verwendet, in dem Tiere definierten Alters, Lakta-tionsstadiums und Milchzellzahl eingesetzt wurden. Die Qualität des entwickelten Mastitis-Modells begründete sich auf den strengen Auswahlkriterien (Rasse: Holstein Friesian, 1. Lak-tation, 3.-5. Laktationsmonat, Freiheit von Mastitiserregern sowie somatische Zellzahl in der Milch [SCC] <50.000 Zellen/mL über mindestens drei Wochen vor Versuchsbeginn). Damit sollten mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit initiale Signal- und Abwehrmechanis-men in der frühen Phase (24 bzw. 72 h) einer akuten klinischen (E. coli) und einer subklini-schen bis chronisubklini-schen (S. aureus) Mastitis erfasst werden. Das Modell umfasste darüber hinaus die Analyse von nicht-infizierten Tieren (‚Goldstandardtiere‘), welche den Modell-grenzen entsprachen, um zu prüfen inwieweit sich Zellzusammensetzungen während einer 24- und 72-stündigen Beobachtungszeit verändern. Im Zuge aller Untersuchungen wurden die immigrierenden Zellen hinsichtlich ihres Phänotyps charakterisiert sowie Änderungen der Konzentration löslicher Milchinhaltsstoffe (Zytokine und Histamin) bestimmt.

Die Evaluierung der nicht-infizierten Tiere ergab für den gesamten Beobachtungszeitraum einen konstanten Gehalt somatischer Zellen in der Milch. Dagegen zeigten sich auf der Ebene der Zellpopulationen der neutrophilen Granulozyten, Monozyten und Makrophagen sowie der Subpopulationen der T-Lymphozyten (γδ-T-Zellen, CD4+- und CD8+-T-Zellen) trotz enger Modellgrenzen erhebliche Unterschiede. Im Mittel lag der Anteil an Granulozyten bei 30% - 40%. Unter den T-Zellen wurde ein mittleres konstantes CD4+/CD8+-Verhältnis von 0,4

er-mittelt. Die Tier- und Viertel-spezifischen Unterschiede legen nahe, in Zukunft die Auswahl-grenzen noch enger zu fassen und die Zellzusammensetzung in die Auswahl mit einzubezie-hen.

Nach erfolgreicher experimenteller Inokulation von E. coli (500 KbE) oder S. aureus (10.000 KbE) in ein Euterviertel wurde in den infizierten Eutervierteln 12 h p.i. (E. coli) oder 24 h p.i.

(S. aureus) ein individuell sehr unterschiedlicher Zellanstieg beobachtet. Allerdings erwies sich der Anstieg des Anteils neutrophiler Granulozyten unter den Leukozyten der Milch als signifikanter, invarianter Parameter nach Inokulation mit E. coli oder S. aureus. Er stieg in-nerhalb von 12 h p.i. von 30% - 40% auf >90% an und blieb über den gesamten Beobach-tungszeitraum auf diesem hohen Niveau. Gleichzeitig konnte eine stetige Zunahme des CD4+/CD8+-Verhältnisses unter den T-Zellen der Milch in den S.-aureus-inokulierten und den Kontroll-Eutervierteln beobachtet werden. 72 h p.i. nahm dieses Verhältnis in den Kon-troll-Eutervierteln wieder ab, während es in den inokulierten Eutervierteln weiter anstieg.

Die Milch E.-coli-infizierter Euterviertel enthielt individuell höchst unterschiedliche Gehalte der Zytokine TNF-α, IL-1β und IFN-γ. In der Milch S.-aureus-inokulierter Viertel waren sie kaum nachweisbar. Die Histamingehalte der Milch zeigten einen signifikanten Anstieg 24 h p.i. nach Inokulation mit E. coli, während sie in der Milch S.-aureus-infizierter Tiere nur leicht und nicht signifikant anstiegen. Der Anstieg der Histaminkonzentration erfolgte erst nach dem Anstieg der Milchzellzahl und konnte demnach nicht für den Zelleinstrom mit-verantwortlich gemacht werden.

Genexpressionsanalysen mittels quantitativer RT-PCR für immunrelevante Gene in Milchdrü-sengewebe von Goldstandardtieren und Kontroll-Eutervierteln der Infektionsversuchstiere zeigten, dass Kontroll-Euterviertel durch die Inokulation von Mastitis-Erregern auf der Ebene der mRNA-Expression signifikant moduliert wurden. Expressionssteigerungen waren für das linguale anti-mikrobielle Peptid (LAP, ß-Defensin) 6 h p.i. zu beobachten. 24 h p.i. zeigten sich signifikante Expressionssteigerungen für TNF-α, die Chemokine CXCL8 und CCL20 sowie für das Akut-Phase-Protein Serum Amyloid A (SAA3).

Im zweiten Teil der Arbeit wurde in vitro die Modulation der Apoptose und der Nekrose von neutrophilen Granulozyten geprüft. Von der Regulation der Lebensspanne dieser Effektorzel-len hängt entscheidend ihre funktionelle Kapazität in der Milchdrüse ab. Durch die Etablie-rung eines durchflusszytometrischen Verfahrens zum Nachweis depolarisierter Mitochon-drienmembranen konnte die Beurteilung der Vitalität differenziert betrachtet werden.

Die Inkubation von neutrophilen Granulozyten aus dem peripheren Blut mit Milchseren von eutergesunden Tieren zeigte einen deutlichen Anstieg der Apoptose- und Nekrose-Rate.

Milchseren von E.-coli-infizierten Kühen führten ebenfalls zu einer Reduktion der Anzahl vitaler PMN und einem Anstieg der Apoptoserate. Demgegenüber führten Milchseren von S.-aureus-inokulierten Kühen zu einem Anstieg des Anteils apoptotischer PMN, ohne dass ein Einfluss auf die Anzahl der vitalen (Mitochondrienmembran-intakten) Zellen zu erkennen war. Die individuell z.T. sehr unterschiedlichen Effekte der Milchseren spiegelten sich in der Beeinflussung der PMN-Apoptose und -Nekrose durch Zytokine, Histamin und den Kultur-überständen Erreger-stimulierter Milchdrüsenepithelzellen wider. In hohen Konzentrationen förderten die Zytokine TNF-α, IL-1β und IFN-γ die Nekrose von PMN, während nur IFN-γ gleichzeitig den Anteil apoptotischer PMN erhöhte.

Histamin allein zeigte selbst in sehr hohen Konzentrationen keinen Einfluss auf die PMN-Apoptose und -Nekrose, konnte aber in Anwesenheit von Milchserum die LPS-induzierte PMN-Nekrose signifikant hemmen. Der Überstand E.-coli-, LPS-, und LTA-stimulierter Milchdrüsenepithelzellen enthielt Faktoren, die ausschließlich die Apoptoserate der PMN senkten, ohne die Zahl membran-intakter vitaler PMN zu beeinflussen. Die Regulation der Apoptose und Nekrose boviner neutrophiler Granulozyten erwies sich damit in der Summe als äußerst komplex. Neben Faktoren in der Milch gesunder wie auch infizierter Euterviertel, welche die Lebenspanne verlängern, konnten auch solche identifiziert werden, die das exakte Gegenteil bewirken. Die Klärung der Frage, welche relative Bedeutung die einzelnen Fakto-ren und Mechanismen auf der Zeitachse vom Eindringen des Erregers bis zur Ausbildung einer entzündlichen Reaktion haben, bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten.

Zusammenfassend konnten anhand des im Rahmen dieser Studie etablierten In-vivo-Infektionsmodells verschiedene Effektorzellen, insbesondere neutrophile Granulozyten, iden-tifiziert werden, die eine Schlüsselrolle in der Frühphase E.-coli- und S.-aureus-induzierter Mastitiden einnehmen. In der Milch gesunder und infizierter Euterviertel konnte zudem eine Vielzahl von Faktoren ermittelt werden, die im In-vitro-Modell die Lebenspanne dieser Effek-torzellen und damit ihre potentielle Reagibilität im Euter beeinflussen. Diese Erkenntnisse stellen eine wertvolle Grundlage für weitere Studien im Hinblick auf die Entwicklung effi-zienter Prophylaxe- und Therapiekonzepte der bovinen Mastitis dar.

7 Summary

Sonja Meyer Studies on influencing functional properties of polymorphonuclear neutro-philic granulocytes during the initial phase of bovine mastitis.

Mastitis is the economically most important illness afflicting single animals in dairy farming.

The current knowledge about early stage pathogen-host interactions has been insufficient to develop successful concepts for prophylaxis and therapy so far. Forming part of a cumulative research project on mastitis the present study was designed to examine in a comparative man-ner interactions of pathogens, mammary gland epithelial cells and somatic cells during the early stages of inflammation. For that purpose an experimental in vivo infection model was established for Staphylococcus aureus and Escherichia coli, two of the most common patho-gens causing clinical mastitis in cattle. Parallel in vitro studies were conducted to determine the impact of early pathogen-host-interactions on the regulation of PMN-viability.

For the in vivo experiments only cows of a defined age, stage of lactation and somatic cell count (SCC) were used. The quality of the developed model system for mastitis was based on strict exclusion of any animals not meeting the demands (Breed: Holstein Friesian, 1. lacta-tion, 3.-5. month of lactalacta-tion, no evidence of mastitis related pathogens in the milk and a SCC

<50.000 cells/ml at least three weeks before commencement of the trials). Thus it was possi-ble to observe initial signal and defence mechanisms (24 respectively 72 h) of an acute clini-cal mastitis (E. coli) and a subcliniclini-cal to chronic mastitis (S. aureus) with great accuracy and reproducibility. As controls the cell composition in the milk of non infected animals selected by the same strict exclusion criteria were analysed using the same time frame (‚gold standard animals’). The cells which migrated into the milk of infected and non infected animals were phenotyped and the concentration of histamine as well as a subset of cytokines was examined.

Evaluation of non infected animals showed for the entire time span a constant over all con-centration of somatic cells. However, even within the control group considerable differences occurred in the relative distribution of immune cell types such as neutrophilic granulocytes, monocytes und macrophages and a subpopulations of T-lymphocytes (γδ-T-cells, CD4+- and CD8+-T-cells). The milk leukocyte population of a healthy animal consisted on average of 30-40% neutrophilic granulocytes. The mean T-cell CD4+/CD8+-ratio amounted to 0.4. With regard to the large differences in composition of leukocyte subpopulations between clinically healthy animals and even single quarters it seems recommendable to include this criterion when choosing animals for future trials.

The experimental inoculation of E. coli (500 CFU) or S. aureus (10.000 CFU) was followed 12 h p.i. (E. coli) or 24 h p.i. (S. aureus) by a rise in leukocyte numbers in the infected quar-ter. Interestingly, the magnitude of the rise differed individually to a great extend. A very con-stant parameter however proved to be the upregulation of the granulocyte fraction within the leukocyte population 12 h p.i. from 30-40% up to 90%. The situation remained unchanged for the rest of observed time span. The S. aureus inoculated quarters as well the control quarters of the same cows showed additionally a turn in T-cell CD4+/CD8+-ratio in favour of the CD4+ cells. The ratio kept rising in the infected quarters, whereas it fell back to initial values in the control quarters 72 h p.i.

Concerning cytokine production, the animals reacted very different to the two pathogens.

E. coli elicited a significant rise in TNF-α, IL-1β and IFN-γ concentrations, even though the individual differences between animals remained considerable. In contrast, S. aureus inocu-lated quarters showed hardly any cytokine production at all. Similarly, the histamine content of the milk rose significantly after inoculation with E. coli. Such a reaction was not observed after confrontation with S. aureus. Since histamine levels started to raise after the influx of leukocytes it is unlikely that histamine acts as a trigger for leukocyte immigration.

Gene expression analysis was performed by quantitative RT-PCR for immune-related genes using udder tissue of gold standard animals and infected animals as well as of control quarters of infected cows. It revealed that in infected animals the mRNA expression even of the con-trol quarters was significantly modulated. A rise in mRNA-concentration was noted 6 h p.i.

for the lingual anti-microbial peptide (LAP, a ß-Defensin). 24 h after inoculation the expres-sion of TNF-α, CXCL8, CCL20 and the acute phase protein serum amyloid A (SAA3) was significantly up-regulated.

The second part of the study consisted of in vitro trials examining the modulation of apoptosis and necrosis of neutrophilic granulocytes. The functional capacity of these classical phago-cytes depends to a great extend on the regulation of their life span within the mammary gland.

A method for flow cytometric evaluation of mitochondrial membrane potentials was estab-lished facilitating a differentiated assessment of PMN viability.

Incubation of peripheral blood neutrophilic granulocytes with milk sera of healthy cows showed significant higher numbers of apoptotic as well as necrotic cells compared with con-trols. Similar results were noted after incubation of PMN with milk sera of E. coli inoculated quarters. Milk sera of S. aureus inoculated cows on the other hand only led to a rise in totic cells, without a change in the number of membrane intact cells. The necrotic and apop-totic effect of milk sera on PMN, which differed considerably between individuals, was

mir-rored if neutrophilic granulocytes were incubated with cytokines, histamine or supernatants of pathogen-stimulated mammary gland epithelial cell cultures. The cytokines TNF-α, IL-1β and IFN-γ caused in high concentrations PMN necrosis. Only IFN-γ led to a parallel rise in num-bers of apoptotic cells. Histamine alone showed even in high concentrations no influence on PMN necrosis or apoptosis. However, added to milk sera histamine significantly inhibited LPS-induced PMN necrosis. Supernatant of E. coli-, LPS- or LTA-stimulated mammary gland epithelial cell cultures contained factors which exclusively down-regulated PMN apop-tosis without influencing the numbers of membrane intact cells. The described results suggest that the regulation of apoptosis and necrosis of bovine neutrophilic granulocytes is a rather complex process. Milk of healthy as well as infected udder quarters contained factors which lengthened the life span of PMN, but also some which appeared to cause the complete oppo-site. Further studies will be necessary to establish the importance of single factors and mecha-nisms on the timeline between initial pathogen contact and the development of an inflamma-tory reaction.

In summary the in vivo infection model developed in the present study identified several ef-fector cells which play a key role in the initial phase of E. coli- und S. aureus-induced masti-tis. Neutrophilic granulocytes as the dominating leukocyte fraction seem to be of special im-portance. In the milk of healthy and infected quarters an abundance of factors were found which were able to influence in vitro the PMN viability and reactivity. The results represent a valuable basis for further studies with the aim of developing an efficient prophylaxis and ther-apy of bovine mastitis.

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