Methoden zur Untersuchung der Modulation der Apoptose durch

3.3.16.1 Etablierung des Apoptosenachweises in bovinen neutrophilen Granulozyten Bovine neutrophile Granulozyten von 7 Tieren wurden wie unter 3.3.3 beschrieben separiert und in I10F⁺aufgenommen. Es wurden ca. 3 x10⁵ Zellen in je eine Vertiefung einer 96-well-Platte überführt. Nach dem Protokoll von FOSSATI et al. (2003) wurden die PMN zuerst mit JC-1 in den Endkonzentrationen 3,5 µmol/L, 7 µ mol/L und 10 µmol/L bei 37°C für 15 Min.

inkubiert. Die Zellen wurden in der Plattenzentrifuge bei 250 x g, 5 Min. und Raumtempera-tur zentrifugiert und in I10F⁺ aufgenommen. Anschließend wurde der Stimulus FCCP in den finalen Endkonzentrationen von 0, 1, 5 und 10 µmol/l hinzu gegeben und die Zellen für 15 Min. bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.

FCCP ist ein Protonophor (H⁺ Ionophore) und inhibiert die oxidative Phosphorylierung in Mitochondrien. FCCP vermag somit gezielt eine Depolarisierung der Mitochondrienmembran in vitro hervorzurufen (COLLINS et al. 2000; KEIJ et al. 2000). Abhängig von der Konzen-tration löst es in humanen Zellpopulationen eine partielle (100 mmol/L FCCP) oder eine voll-ständige (10 µmol/L FCCP) Depolarisierung aus (GAUTIER et al. 2000).

Zusätzlich wurden Kontrollen mitgeführt, um eine Beeinflussung durch die Lösungsmittel für JC-1 (DMSO) und für FCCP (Ethanol) ausschließen zu können. Alle Ansätze erfolgten in Triplikaten. Die Zellen wurden in der Plattenzentrifuge bei 250 x g, 5 Min. und Raumtempe-ratur zentrifugiert, der Überstand verworfen und mit 100 µL PBS resuspendiert. Dies wurde zwei Mal wiederholt. Abschließend wurden die Zellen in 100 µ L PBS aufgenommen und in ein FCM-Röhrchen überführt in dem 100 µ L steril filtriertes PBS (2µ g/mL PJ) vorgelegt war.

Es folgte eine Analyse von 20.000 Ereignissen im Durchflusszytometer.

3.3.16.2 Beeinflussung der Apoptose durch Histamin

In diesem Versuchsteil sollte untersucht werden, ob Histamin allein oder im Kontext mit Milchseruminhaltsstoffen einen Einfluss auf die Vitalität von neutrophilen Granulozyten hat.

Aus dem Blut von acht Tieren wurden PMN (3.3.3) und MNC (3.3.2) separiert und in I10F⁺ -Medium aufgenommen. Ein Versuchsansatz wurde mit PMN Reinkulturen durchgeführt; ein weiterer mit PMN/MNC-Mischkulturen, in denen der Anteil beider Populationen jeweils 50%

betrug. Es wurde Milch einer Kuh aus der Rinderklinik nach der Methode in 3.3.13.1 vorbe-reitet. Dieses Milchserum und das I10F⁺-Medium wurden mit 10, 50 und 100 ng/mL Histamin versetzt. Je 3 x10⁵ Zellen beider Zellsuspensionen wurden in eine Vertiefung einer 96-well-Platte pipettiert.

Die prinzipiellen Zellkulturansätze (Triplikate) sind in Tab. 10 aufgeführt. Parallelen Ansät-zen wurde zusätzlich 1 µg/mL LPS zugesetzt. Jeweils wurden Ansätze 1 h, 3 h und 24 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Anschließend folgte eine Bestimmung des Anteils apoptotischer Zellen mittels JC-1-Färbung. Nach 24 h wurde zusätzlich die Anzahl vitaler Zellen parallelen Ansätzen mit der Referenzzellmethode durchflusszytometrisch quantifiziert.

Tab. 10 Zellkulturansätze zur Untersuchung des Einflusses von Histamin auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten.

Histamin-Zusatz

3.3.16.3 Beeinflussung der Apoptose durch Zytokine

Diese Untersuchung sollte die Frage klären, ob die Zytokine TNF-α, IL-1β und IFN-γ einen Effekt auf die Vitalität der neutrophilen Granulozyten haben. Außerdem sollte der modulie-rende Einfluss von Milchserum in verschiedenen Konzentrationen untersucht werden.

Aus bovinem Blut wurden PMN mit einer Reinheit von 95% nach der in 3.3.3 aufgeführten Methode zuerst mit Lymphozyten-Separationsmedium^® und 70%-iger Percoll-Lösung sepa-riert und anschließend in I10F⁺ aufgenommen. Jeweils 3 x10⁵ Zellen wurden in eine Vertie-fung einer 96-well-Platte pipettiert. Die Ansätze mit den Zytokinen wurden in Medium I10F⁺, in I10F⁺ (mit Milchserum 1:7 verdünnt) und in I10F⁺ (mit Milchserum 1:70 verdünnt) durch-geführt. In Tab. 11 sind die finalen Zytokinkonzentrationen aufdurch-geführt. Alle Ansätze erfolgten in Triplikaten. Inkubiert wurde für 24 h bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank. Es schloss

sich eine durchflusszytometrische Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mittels Referenz-zellmethode (3.3.6) sowie eine Bestimmung des Anteils apoptotischer Zellen mittels JC-1-Färbung (3.3.8.2) an.

Tab. 11 Zytokin-Milieus zur Kultivierung von bovinen PMN in vitro.

Konzentration (ng/mL)

TNF-αααα - 3 30

IL-1ββββ 0,1 0,8 30

IFN-g 0,1 0,8 30

Kontrolle (0)

3.3.16.4 Beeinflussung der Apoptose durch Milchseren verschiedener Infektionsstadien Hier wurde untersucht, wie Milchseren verschiedener Infektionsstadien der E.-coli–Mastitis die Vitalität von Leukozyten beeinflussen.

Bovine PMN wurden wie unter 3.3.3 und MNCs wie unter 3.3.2 beschrieben separiert und in I10F⁺-Medium aufgenommen. Ein Versuchsansatz wurde mit PMN-Reinkulturen durchge-führt und ein anderer mit PMN/MNC-Mischkulturen, in denen der Anteil beider Populationen jeweils 50% betrug.

Für einen Teil des Versuchs wurden Milchseren aus Milchproben des Versuchstieres M-08 gewonnen, dem im Rahmen des Infektionsversuches 500 KbE E. coli in das hintere rechte Euterviertel intrazisternal appliziert wurden. Die Milchproben wurden aus dem infizierten Euterviertel zum Zeitpunkt 0 h, 12 h und 24 h p.i. und von einem Kontroll-Euterviertel zum Zeitpunkt 0 h ermolken. Die Milchseren wurden wie in 3.3.13 beschrieben vorbereitet. Der pH-Wert der Milchproben wurde mittels Neutralit^® pH-Indikatorstäbchen bestimmt (Tab. 12).

Um den Einfluss des pH-Wertes beurteilen zu können wurden auch die Kontrollmedien auf die pH-Werte 6,5, 7 und 7,5 eingestellt

Tab. 12 Übersicht über die pH-Werte der Milchseren von Versuchskuh M-08.

Euterviertel M-08 Zeit p.i. pH-Wert HL (Kontroll-Euterviertel) 0 h pH 6,5 HR (infiziertes Euterviertel) 0 h pH 6,5 12 h pH 7,0 24 h pH 7,5

Es wurden je drei 96-well-Platten mit PMN-Reinkulturen und PMN/MNC-Mischkulturen bestückt. In die Vertiefungen einer Rundboden-Mikrotiterplatte wurden 3 x10⁵ PMN oder ein Gemisch aus PMN (1,5 x10⁵) und MNC (1,5 x10⁵) pipettiert und anschließend bei 250 x g, 5 Min., bei RT zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Zellpellets wurden re-suspendiert und in 100 µ L der Milchseren oder der Mediumkontrollen aufgenommen. Alle Ansätze erfolgten in Triplikaten. Parallele Ansätze wurden 2 h, 12 h und 24 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Es schloss sich eine durchflusszytometrische Bestimmung des Anteils apoptotischer Zellen mittels JC-1-Färbung (3.3.8) an.

In einem weiteren Teil des Versuchs wurden die Milchseren der infizierten Euterviertel und eines Kontroll-Euterviertels aller Versuchstiere eingesetzt (Milchseren vor Infektion, 0 h;

Milchseren 24 h p.i.). Die Zellkulturansätze erfolgten prinzipiell wie oben beschrieben. Die Milchseren wurden mit Kulturmedium 1:2 verdünnt. Die Ansätze wurden 24 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Abschließend wurden die vitalen Zellen mit der Referenzzell-methode quantifiziert (3.3.6) und der Anteil apoptotischer Zellen durch die JC-1 Färbung be-stimmt.

3.3.17 Gewinnung und Stimulation von primären bovinen