Expression immunrelevanter Gene in infizierten und nicht-infizierten

4.2 Infizierte Tiere

4.2.3 Expression immunrelevanter Gene in infizierten und nicht-infizierten

Die Infektion eines Euterviertels induziert Prozesse, die sich auf benachbarte Euterviertel (hier Kontroll-Euterviertel, Placebo-inokuliertes Euterviertel) erstrecken können. Im Folgen-den wurde dies anhand der mRNA-Expression ausgewählter, immunrelevanter Gene (Abb.

27) untersucht. Als Basis diente die Expressionsstärke im Milchdrüsengewebe nicht-infizierter Goldstandardkühe. Die mRNA-Kopienzahl/75 ng RNA ist in Tab. 14 dargestellt.

24 h nach Inokulation mit E. coli konnte für die Mehrzahl der untersuchten Gene eine bis zu 1285-fache Expressionssteigerung festgestellt werden. Einzelne Gene (CCL5, 5-fach) wurden nur schwach hochreguliert. Als einziges nicht reguliertes Gen erwies sich TGF-β.

Tab. 14 Expressionsstärke der mRNA immunrelevanter Gene in Milchdrüsengewebe nicht-infizierter Goldstandardtiere und im Gewebe E.-coli-infizierter

Euterviertel 24 h p.i.

Gen Goldstandardtiere

E.-coli-infizierte Euterviertel 24 h p.i.

Vielfaches der Expression¹

CXCL8 53 ± 9 68641 ± 34572 1285

CCL20 78 ± 7 43155 ± 18257 554

CCL5 11005 ± 1112 55979 ± 11763 5 TNF-αααα 264 ± 28 4750 ± 1935 18

TGF-ββββ 1178 ± 133 1317 ± 202 1

iNOS 276 ± 76 8205 ± 3995 30

SAA3 31022 ± 6563 23x10⁶ ± 6x10⁶ 762

LAP 1334 ± 198 148244 ± 63815 111

Mittelwerte ± SEM der mRNA-Kopienzahl/75 ng RNA aus Milchdrüsengewebe. 1) Der Mittelwert in den E.-coli-infizierten Eutervierteln (n=5 Viertel) wurde zum Mittelwert in den Goldstandardtier-Proben (n=20 Viertel) in Bezug gesetzt. Verwendete Abkürzungen: CXCL8 = Interleukin 8, CCL20 = CC-Chemokin 20, CCL5 = CC-Chemokin 5, TNF-α = Tumor Nekrose Faktor alpha, TGF-β = Trans-forming Growth Factor-beta, iNOS = induzierbare Stickoxid Synthetase, SAA3 = Serum Amyloid A3, LAP = Lingual Antimicrobial Peptide.

CXCL8 Kontrollviertel E. coli-infizierter Tiere (6 h) Kontrollviertel E. coli-infizierter Tiere (24 h)

*

Abb. 27 Expressionsmodulation ausgewählter Gene in Kontroll-Eutervierteln zu un-terschiedlichen Zeiten nach Inokulation eines Viertels mit 500 KbE E. coli.

Mittelwerte ± SEM der mRNA-Kopienzahl/75 ng RNA aus Milchdrüsengewebe nicht infizierter Goldstandardtiere (n=20), und Kontroll-Eutervierteln E.-coli-infizierter Tiere (6 h und 24 h p.i., jeweils n=5). *** = p<0,001, **= p<0,01; * =p<0,05.

Nach Vergleich der Kontroll-Euterviertel E.-coli-infizierter Tiere mit den Eutervierteln der Goldstandardtiere ergab sich 6 h p.i. eine signifikant verminderte mRNA-Expression des Chemokins CCL5 und eine um die 3-fach höhere Expressionsstärke des Defensins linguales

antimikrobielle Peptid (LAP). Alle anderen Zytokine, Chemokine und Effektormoleküle wie-sen keine Änderung der Expressionsstärke auf. 24 h p.i. konnten in den Kontroll-Eutervierteln E.-coli-infizierter Tiere signifikant 3-5-fach höhere mRNA-Expressionsstärken für CXCL8, CCL20, TNF-α, SAA3 und LAP im Vergleich zu Goldstandardtier-Eutervierteln gemessen werden (Abb. 27).

Damit konnte gezeigt werden, dass die Infektion eines Euterviertels die Genexpression be-nachbarter Euterviertel beeinflusst.

4.2.4 Zytokingehalte des Milchserums

Erfasst wurden die Zytokine IL1-β, IFN-γ und TNF-α. Die Etablierung eines ELISA-Verfahrens, das eine quantitative Bestimmung dieser Zytokine ermöglichen sollte, war nicht erfolgreich. An einem Beispiel (Abb. 28) wird für TNF-α gezeigt, dass die erreichbaren opti-schen Dichten nach Zugabe definierter Mengen an TNF-α in unterschiedlichen Milchserum-Verdünnungen unterschiedlich ausfielen. Damit war die Erfassung der TNF-α-Konzentration anhand einer Standardkurve nicht möglich.

0,5 1,0 1,5

0 1 2 3

log TNF-αααα(ng/mL)

log (mOD)

in ELISA-Verdünnungspuffer in Milchserum (1:2 verd.) in Milchserum (1:8 verd.) in Milchserum (1:32 verd.)

Abb. 28 Vergleich von Standardkurven der Zytokine in Testpuffer und Milchseren in unterschiedlichen Verdünnungsstufen.

Dargestellt sind die Werte der Standardkurve in log (OD) nach Subtraktion der Werte in den Kontroll-ansätzen zur Prüfung unspezifischer Bindungen. Zu ELISA-Verdünnungspuffer (3.2.8.6) und unter-schiedlichen Verdünnungen des Milchserums einer Goldstandardkuh wurde TNF-α in Konzentratio-nen von 0,3 ng/mL bis 30 ng/mL zugesetzt.

Aus diesen Gründen, die vergleichbar für IL-1β und IFN-γ zutrafen, wurde für diese Zytokine eine semiquantitative Auswertung gewählt. Es wurde geprüft, ob die optischen Dichten des ELISAs mit Milchseren infizierter Tiere signifikant über denen nicht-infizierter Goldstan-dardtiere lagen. Hierfür wurden aus den Mittelwerten und den Standardfehlern (SEM) der optischen Dichten (OD) in den Milchseren der Goldstandardtiere die Grenze des oberen 95%-Konfidenzintervalls berechnet. Dieser Wert besagt, dass mit einer Wahrschein-lichkeit von 0,95 (bzw. 95%) und einer IrrtumswahrscheinWahrschein-lichkeit von p=0,05 in der Milch eutergesunder Goldstandardtiere die obere Konfidenzintervall-Grenze nicht überschritten wird. Somit können OD-Werte von Milchseren infizierter Kühe, die die obere Konfidenzin-tervall-Grenze (Tab. 15)überschreiten, eine Erhöhung der Zytokin-Gehalte aufweisen.

Tab. 15 Bestimmung der oberen 95%-Konfidenzintervall-Grenzen für optische Dich-ten (OD) im IL-1ββββ- und IFN-γ−γ−γ−Milchserum-ELISA nach Untersuchung von γ−

Goldstandard-Milchseren.

Mittelwert der OD

SEM Oberes

95%-Konfidenz-intervall

Stichproben-größe n

0 h 0,206 0,012 0,230 5

12 h 0,229 0,013 0,254 5

IL1-ββββ

24 h 0,225 0,009 0,243 5

0 h 0,046 0,001 0,049 5

12 h 0,046 0,001 0,048 5

IFN-γγγγ

24 h 0,049 0,003 0,053 5

Zur Festlegung der oberen Konfidenzintervall-Grenze wurde das Milchserum eines Viertels von je fünf Kühen untersucht.

Tab. 16 Optische Dichten im IL-1ββββ- und IFN-γ−γ−γ−Milchserum-ELISA der infizierten γ−

Euterviertel nach Inokulation mit E. coli oder S. aureus.

E. coli S. aureus

M-08 M-12 M-15 M-16 M-19 M-20 M-23 M-28 M-29 M-30 0 h 0,150 0,167 0,091 0,108 0,233 0,217 0,176 0,286 0,177 0,226 12 h 0,598 0,772 0,105 0,135 0,246 0,194 0,200 0,280 0,226 0,223 IL1-ββββ

24 h 1,440 0,286 0,599 0,311 0,482 0,286 0,207 0,277 0,193 0,331 0 h 0,044 0,034 0,025 0,031 0,050 0,038 0,026 0,033 0,046 0,034 12 h 0,046 0,088 0,025 0,035 0,040 0,042 0,028 0,034 0,047 0,034 IFN-γγγγ

24 h 0,169 0,038 0,045 0,050 0,057 0,057 0,026 0,036 0,053 0,042

Es wurden jeweils die Milchseren von Goldstandard-Kühen und infizierten Kühen, die zu identischen Untersuchungszeitpunkten gewonnen wurden, miteinander verglichen. Die grau unterlegten Felder kennzeichnen die Werte, welche die obere Grenze des 95%-Konfidenzintervalls überschreiten und folglich als erhöhte OD-Werte bzw. Zytokin-Gehalte interpretiert wurden.

In zwei von fünf Milchseren E.-coli-infizierter Tiere konnten 12 h p.i. erhöhte IL-1β-Gehalte gemessen werden. Der Anteil an Tieren mit erhöhten Werten stieg 24 h p.i. auf vier von fünf.

Eines der fünf mit S. aureus infizierten Tiere wies leicht erhöhte IL-1β-Werte auf, die sich jedoch im Infektionsverlauf nicht änderten. 24 h p.i. konnten bei drei von fünf Tieren margi-nal erhöhte optische Dichten im IL-1β-ELISA nachgewiesen werden.

Die IFN-γ-Gehalte lagen bei nahezu allen untersuchten Milchseren auf dem Ausgangsniveau.

Das Milchserum eines E.-coli-infizierten Tieres (M-08) wies deutlich erhöhte Werte 24 h p.i.

auf.

TNF-α-Gehalte wurden mittels eines Radioimmunoassays ermittelt. Die Daten wurden freundlicherweise von Prof. Bruckmaier Abteilung Veterinär-Physiologie der Vetsuisse Fa-kultät, (Universität Bern) für die Auswertung zur Verfügung gestellt. Dieses Verfahren wurde von KENISON et al. (1990) validiert. Das Prinzip dieses Verfahrens gleicht der Histamin-Bestimmung durch den RIA (3.3.14). Der Nachweis wurde mit einem Kaninchen-Antikörper gegen rekombinantes TNF-α (F314) durchgeführt. Für die Erstellung der Standardkurve wur-de rekombinantes TNF-α an Iod gekoppelt und eine Verdünnungsreihe hergestellt. Die Nachweisgrenze lag bei 0,1 ng/mL. In Abb. 29 sind die Werte der Einzeltiere dargestellt.

Nach Inokulation mit E. coli zeigte ein Tier (Abb. 29, A, Tier M-08) einen starken Anstieg des TNF-α-Gehaltes von basal 0,9 ± 0,2 ng/mL auf 32 ng/mL. Ein im Mittel signifikanter

Anstieg auf 10,9 ± 6,9 ng/mL konnte bei erheblichen individuellen Schwankungen 24 h p.i.

festgestellt werden.

In der Milch S. aureus-infizierter Tiere konnte zu keinem Zeitpunkt p.i. ein signifikant höhe-rer TNF-α-Gehalt nachgewiesen werden. Einzelne Tier zeigten gleichwohl deutlich erhöhte Gehalte 24 h p.i. und 60 h p.i. (Abb. 29, B).

Abb. 29 Gehalte an TNF-α in Milchseren E.-coli- oder S.-aureus- infizierter Euterviertel.

Dargestellt sind die TNF-α-Gehalte einzelner Tiere in den infizierten Eutervierteln nach Inokulation von 500 KbE E. coli (A) und 10.000 KbE S. aureus (B), die mittels Radioimmunoassay ermittelt wur-den.

4.2.5 Histamingehalte der Milchseren

Der Histamingehalt der Milchseren wurde mit einem Radioimmunoassay (3.3.14) bestimmt.

Der Basisspiegel an Histamin in den Milchseren betrug 20 ± 2 ng/mL. Ein signifikanter An-stieg auf 47 ± 9 ng/mL (p>0,05) konnte 24 p.i. beobachtet werden (Abb. 30, A). In den Kon-troll- und Placebo-Euterviertel lagen die Gehalte bei 17 ± 3 ng/mL und 23 ± 2 ng/mL. Eine signifikante Korrelation zwischen dem Histamingehalt und dem SCC bestand nicht (r=0,41, Daten nicht gezeigt). Eine Erhöhung des Histamingehaltes nach experimenteller E.-coli-Infektion erfolgte 12 h nach dem Zelleinstrom (Abb. 30, B). Interessanterweise stieg der His-tamingehalt nicht in den Kontroll-Eutervierteln, in denen eine Zunahme des Zellgehaltes fest-gestellt werden konnte (Kontrolle 1, Abb. 30, B).

A B

Abb. 30 Histamingehalte im Milchserum und Gehalte an neutrophilen Granulozyten nach Inokulation mit E.-coli.

(A) Histamingehalte der Milchseren vor (0 h) und nach experimenteller Infektion mit E. coli in einem Euterviertel (infiziert) wurden mittels Radioimmunoassay bestimmt. Die Histamin-Konzentration ist 24 h p.i. in der Milch des infizierten Euterviertels signifikant gegenüber allen anderen Werten erhöht (p<0,05). (B) Zellzahlen neutrophiler Granulozyten (PMN) in der Milch infizierter Euterviertel sowie der Kontroll-Euterviertel und der Placebo-Euterviertel.

Nach intrazisternaler Applikation von S. aureus stieg der Histamingehalt in den infizierten Eutervierteln von initial 25 ± 6 ng/mL auf 41 ± 15 ng/mL (nicht signifikant) an und lag im Folgenden zwischen 36 ± 11 und 47 ± 18 ng/mL (Abb. 31, A). Die Gehalte der infizierten Euterviertel unterschieden sich nicht von denen der Kontroll-Euterviertel und der Placebo-Euterviertel. Somit bestand keine Beziehung zwischen dem Histamingehalt und dem Anstieg der Zahlen neutrophiler Granulozyten in den infizierten Eutervierteln (Abb. 31, A, B).

Zeit p.i. (h)

1 10 100 1000 10000

0 12 24 36 48 60 72

Histamin (ng/mL)

0 12 24 36 48 60 72

0 20 40 60

80 ^infiziert

Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo

Histamin (ng/ml)PMN (x10³/mL)

* * * *

Abb. 31 Histamingehalte in der Milch und Gehalte an neutrophilen Granulozyten nach Inokulation mit S. aureus.

(A) Histamingehalte der Milchseren wurden vor (0 h) und zu verschiedenen Zeiten nach experimentel-ler Infektion mit S. aureus in einem Euterviertel (infiziert) mittels Radioimmunoassay bestimmt. (B) Gehalte an neutrophilen Granulozyten (PMN) in der Milch infizierter Euterviertel sowie Kontroll-Eutervierteln und einem Placebo-Euterviertel.

4.3 Funktionelle Beeinflussung der Überlebenszeit neutrophiler Granulo-zyten

Zunächst wurden Voruntersuchungen zur durchflusszytometrischen Darstellung verschiede-ner Stadien des Zelltodes über den Nachweis des Mitochondrienmembranpotentials durchge-führt. Danach wurde geprüft, ob Milchinhaltsstoffe Einfluss auf die Apoptose von neutrophi-len Granulozyten nehmen.

4.3.1 Etablierung des Apoptosenachweises

Im gewählten Verfahren wurden depolarisierte Mitochondrienmembranen nachgewiesen (3.3.8). Um dies auszulösen, wurden PMN von 7 Tieren mit FCCP in Konzentrationen von 0 bis 10 µmol/L (3.3.16.1) inkubiert. In Abb. 32 ist beispielhaft abgebildet, wie sich die Popula-tion der PMN nach StimulaPopula-tion mit verschiedenen KonzentraPopula-tionen FCCP und Färbung mit JC-1 darstellt. Je nach FCCP-Konzentration ist ein unterschiedlich hoher Anteil der PMN–

Mitochondrienmembranen depolarisiert.

FCCP 5 µmol/L FCCP 10 µmol/L

FCCP 0 µmol/L

JC-1-Floureszenz

Abb. 32 Unterschiedliche Grade der Mitochondrien-Depolarisation von neutrophilen Granulozyten.

Dargestellt sind Granulozyten in der Rot-Fluoreszenz (Propidiumjodid, FL-3) gegen die Grün-Fluoreszenz (JC-1, FL-1) nach der Erfassung von 20.000 Ereignissen und nach dem Setzen eines Ga-tes auf vitale Zellen kombiniert mit einem Gate auf Granulozyten. Im oberen linken Quadranten wer-den die apoptotischen Granulozyten erfasst und als Anteil der Propidiumjodid-negativen (nicht-nekrotischen) Zellen quantifiziert. In diesen drei Abbildungen werden die Anteile der Granulozyten nach einem FCCP-Stimulus (15 Min. in vitro) von A) 0µmol/L, B) 1µmol/L und C) 5µmol/L gezeigt.

Der Anteil an PMN mit depolarisierten Mitochondrien war abhängig von der eingesetzten 1-Konzentration. Er stieg bei nicht-stimulierten PMN signifikant von 3 ± 1% (3,5 µmol/L JC-1) auf 6 ±1% (7 µmol/L JC-JC-1). Die Beziehung zwischen der eingesetzten JC-1-Konzentration und den Anteilen an Zellen mit depolarisierten Mitochondrien nach FCCP-Stimulation sind in Abb. 33, A dargestellt. Nach Stimulation mit der höchsten eingesetzten FCCP-Konzentration (10 µmol/L) war kein Unterschied zwischen den JC-1-Konzentrationnen zu erkennen, wohl aber nach Stimulation mit den Konzentrationen 1 und 5 µmol/L FCCP. Hier konnten mit 3,5 µmol/L JC-1 signifikant weniger apoptotische Zellen nachgewiesen werden. Ein Unter-schied zwischen 7 µmol/L und 10 µmol/L JC-1 bestand nicht. Um zu prüfen, ob unterUnter-schied- unterschied-liche JC-1-Konzentrationen selbst Einfluss auf die Zellvitalität nehmen, wurde der Anteil vi-taler PMN bestimmt (Abb. 33, B). Hier zeigte sich, dass unstimulierte Zellen (0 µmol/L FCCP) nicht von JC-1 beeinflusst wurden, dies jedoch mit zunehmender FCCP-Konzentration in signifikanter Weise besonders bei hohen JC-1-Konzentrationen zu Tage trat.

Um möglichst sensitiv die Apoptose neutrophiler Granulozyten nach Stimulation in vitro zu erfassen, ohne Nachweis-bedingt den Anteil apoptotische Zellen zu verfälschen, wurden für die nachfolgenden Versuche die Zellen mit 7 µmol/L JC-1 markiert.

0µM 1µM 5µM 10µM 0

25 50 75 100

Vitale PMN %

0 25 50 75

100 *

* *

apoptotische PMN (%)vitale PMN (%)

FCCP (µmol/L)

FCCP (µmol/L) A

3,5 µmol/L JC-1 7 µmol/L JC-1 10 µmol/L JC-1

0 1 5 10

** *

Abb. 33 Anteil der PMN mit depolarisiertem Mitochondrienmembranpotential und Anteile vitaler PMN nach Stimulation mit FCCP und Markierung mit dem Fluorochrom JC-1.

Bovine PMN (n=7 Tiere) wurden in vitro 15 Min. mit FCCP stimuliert und das Mitochondrien-Potential mit JC-1 durchflusszytometrisch erfasst (*=p<0,05, **=p< 0,01).

4.3.2 Modulierender Einfluss von Zytokinen

In diesem Versuchsabschnitt sollte der Einfluss dreier Zytokine auf die Vitalität von neutro-philen Granulozyten untersucht werden. Der Zusatz von Milchserum hatte in der Abwesenheit der Zytokine keinen signifikanten Einfluss auf die Vitalität der Zellen (Abb. 34, Kontrollen).

TNF-α: α: α: Im Kulturmedium führte TNF-α nicht zu einer Reduktion der Zahl vitaler Zellen. In α:

den Ansätzen mit Milchserum wurde die Zahl vitaler PMN durch 30 ng/mL TNF-α signifi-kant reduziert.

IL-1β: β: β: Niedrige IL-1β Konzentrationen nahmen keinen Einfluss auf die Vitalität der PMN. β:

Der Einsatz von 30 ng/mL IL-1β hingegen bewirkte eine signifikante Reduktion der Zellzahl (p<0,01) sowohl im Kulturmedium als auch in 1:7 verdünntem Milchserum.

IFN-γγγγ: Auch dieses Zytokin zeigte erst in hohen Konzentrationen einen Vitalitäts-mindernden Effekt in den Kulturmedium-Ansätzen und den Ansätzen in 1:70 verdünntem Milchserum.

Interessanterweise erwies es sich als deutlich Vitalitäts-mindernder, wenn die Ansätze in 1:7 verdünntem Milchserum durchgeführt wurden. Hier führten bereits 0,8 ng/mL IFN-γ zu einer signifikanten Reduktion der Zahl vitaler PMN.

Um zu klären, ob die Reduktion der Zahl vitaler Zellen auf Nekrose und/oder Apoptose-Induktion beruht, wurde der Anteil Mitochondrienmembran depolarisierter PMN in Ansätzen bestimmt, denen neben den Zytokinen Milchserum in der Verdünnung 1:7 zugesetzt war. Es zeigte sich, dass keines der Zytokine den Anteil an PMN mit depolarisierten Mitochondrien zu erhöhen vermochte (Abb. 35, A). Die auffällige Reduktion dieses Anteils durch 30 ng/mL IL-1β und IFN-γ erwies sich als nicht signifikant. Die hohe Konzentration an IFN-γ steigerte jedoch signifikant den Anteil nekrotischer PMN von 4 ± 0,5% in der Mediumkontrolle auf 9 ± 1% (p<0,05) (Abb. 35, B).

Abb. 34 Anzahl vitaler PMN nach Inkubation in Medium mit verschiedenen Milchserum-Anteilen und Zusatz von Zytokinen.

Vitale PMN (n = 7 Tiere) wurden nach Inkubation in Kulturmedium sowie Medium mit einem Zusatz von Milchserum (1:7) bzw. Milchserum (1:70) nach 24 h in vitro durchflusszytometrisch quantifiziert.

Durch die Referenzzellmethode wurde die Anzahl der Kulturzellen ermittelt und mit den Anteilen vitaler Zellen (JC-1-negativ, PJ-negativ) verrechnet. Parallele Ansätze enthielten TNF-α, IL-1β oder IFN-γ in den angegebenen Konzentrationen. Die PMN wurden aus dem Blut von 8 Tieren separiert. Es wurden 2 x10⁵PMN/well eingesetzt.

a p o p to ti s c h e P M N ( % ) n e k ro ti s c h e P M N ( % )

zugesetzt war. A) Die Anteile von apoptotischen PMN mit depolarisiertem MMP sind in den Ansätzen mit 30 ng/mL IL-1β und IFN-γ reduziert (p>0,05). B) Hier ist der Anteil nekrotischer (PJ-positiver Zellen) PMN von der Gesamtheit der Kultur-PMN dargestellt. In den Ansätzen mit einem Zusatz von 30 ng/mL IFN-γ ist der Anteil nekrotischer Zellen signifikant erhöht (* = p<0,05).

4.3.3 Modulierender Einfluss von Milchseren und deren Inhaltsstoffen

Hier sollte untersucht werden, ob Milchseren verschiedener Infektionsstadien der E.-coli-Mastitis die Vitalität und die Apoptose von Leukozyten beeinflussen (3.3.16.4).

Einfluss von Milchseren nicht-infizierter Tiere auf die Vitalität neutrophiler Granulozy-ten

Im Kulturmedium stieg der Anteil apoptotischer PMN nach 24 h in vitro deutlich an (Abb. 36, A). In den Ansätzen mit Milchserum nicht (Goldstandard-Milchserum) bzw. noch nicht in-fizierter Euterviertel (Milchserum vor Infektion) lag der Anteil apoptotischer Zellen schon nach 2h Inkubationszeit höher, um über 12 h und 24 h in vitro signifikant gegenüber der Me-diumkontrolle zu steigen (Abb. 36, A).

Das Kulturmedium hatte keinen Zeiteinfluss auf den Anteil nekrotischer PMN (Abb. 36, B), während die Milchseren nicht bzw. noch nicht infizierter Euterviertel nach 12 h zu einem sig-nifikanten Anstieg des Anteils nekrotischer PMN führten, der sich nach 24 h in vitro nicht oder nur marginal änderte (Abb. 36, B).

0 12 24

Medium Goldstandard-Milchserum Milchserum vor Infektion

apoptotische PMN (%) nekrotische PMN (%)

Inkubationszeit (h) Inkubationszeit (h)

Medium Goldstandard-Milchserum

2 12 24

Abb. 36 Einfluss von unverdünntem Milchserum auf die Vitalität von neutrophilen Granulozyten im Vergleich zum Medium.

Legende siehe folgende Seite.

Dargestellt sind die Anteile apoptotischer PMN (A) und nekrotischer PMN (B) zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach Inkubation in drei unterschiedlichen Medien: I10F⁺-Medium, Milchserum einer Goldstandard-Kuh und Milchserum der M-08 vor Inokulation von E. coli. Die Unterschiede zwischen den Medium-Ansätzen und den Milchserum-Ansätzen stellten sich nach 12 h und 24 h Inkubation signifikant dar. a Der Anteil apoptotischer PMN war signifikant höher (p<0,05). b Nach 24 h Inkuba-tion war der Unterschied der Anteile apoptotischer Zellen zum Mediumansatz in den Goldstandard-Milchserum signifikant (p<0,01) und in den Goldstandard-Milchserum vor Infektion hochsignifikant (p<0,0001). c und d. Der Anteil nekrotischer Zellen in den Ansätzen mit Goldstandard-Milchserum war schwach signifikant (p<0,05) und in den Ansätzen mit Milchserum vor der Infektion signifikant höher (p<0,01).

Die PMN wurden aus dem Blut von 8 Tieren gewonnen.

Einfluss von Milchseren verschiedener E.-coli-Infektionsstadien auf die Vitalität neut-rophiler Granulozyten

Hierfür wurden Milchseren der Kuh M-08 verwendet, die vor der Inokulation von E. coli (E.c 0 h) und die 12 h und 24 h nach intrazisternaler Applikation des Erregers (E.c 12 h und E.c 24 h) gewonnen wurden (3.3.16.4).

Zusammengefasst in Abb. 37 ergab sich folgendes Bild. Der pro-apoptotische Effekt eines Milchserums vor Infektion verlor sich signifikant, wenn die Ansätze mit Milchseren durchge-führt wurden, die 12 h oder 24 h nach der Infektion gewonnen wurden (Abb. 37, A). Ein ver-gleichbares Bild ergab sich nach Betrachtung der nekrotischen Zellen. Auch hier reduzierte der Einsatz von Milchseren den Anteil signifikant gegenüber Ansätzen mit Milchseren, die vor der Infektion gewonnen wurden (Abb. 37, B).

0 12 24

apoptotische PMN (%) nekrotische PMN (%)

Inkubationszeit (h) Inkubationszeit (h) a

c d

Milchserum vor Inokulation (E.c 0 h)

Milchserum 12 h nach Inokulation (E.c 12 h) Milchserum 24 h nach Inokulation (E.c 24 h) Milchserum vor Inokulation (E.c 0 h)

Milchserum 12 h nach Inokulation (E.c 12 h) Milchserum 24 h nach Inokulation (E.c 24 h)

2 12 24

Abb. 37 Einfluss von Milchseren E.-coli-infizierter Euterviertel auf die Vitalität neut-rophiler Granulozyten.

Dargestellt sind die Anteile apoptotischer PMN (A) und nekrotischer PMN(B) zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach Inkubation in 3 verschiedenen unverdünnten Milchseren: Milchserum der M-08 vor Inokulation (E.c 0 h) sowie 12 h (E.c 12 h) und 24 h (E.c 24 h) nach Inokulation von 500 KbE E. coli.

a In dem Milchserum E.c 0 h war der Anteil apoptotischer PMN schwach signifikant höher (p<0,05).

b Nach 24 h Inkubation war der Unterschied der Anteile apoptotischer Zellen zum Milchserum E.c 0 h in den Milchseren E.c 12 h signifikant (p<0,01) und in den Milchseren E.c 24 h hochsignifikant (p<0,0001) höher. c und d Der Anteil nekrotischer Zellen war in den Ansätzen mit dem Milchserum E.c 12 h signifikant (p<0,01) und in den Ansätzen mit Milchserum E.c 24 h hoch signifikant erhöht (p<0,0001). Die PMN wurden aus dem Blut von 8 Tieren gewonnen.

Die oben dargestellten Analysen wurden mit in vitro Kulturen reiner PMN durchgeführt. Um zu prüfen, ob mononukleäre Zellen auf die Absterbe-/Apoptoserate einen Einfluss nehmen, wurden identische Ansätze mit PMN/MNC-Mischkulturen durchgeführt. Dabei wurden ver-gleichbare Ergebnisse ermittelt (Daten nicht dargestellt). Daraus wurde geschlossen, dass der gezeigte Einfluss der Milchseren auf die PMN direkt und nicht indirekt über die Aktivie-rung/Modulation anderer leukozytärer Zellpopulationen erfolgt.

Einfluss des pH-Wertes

Da die geprüften Milchseren einen unterschiedlichen pH-Wert aufwiesen, wurde das Kultur-medium auf entsprechende pH-Werte eingestellt, um den Einfluss des pH-Wertes beurteilen zu können. In der Tat stieg pH-Wert-abhängig der Anteil apoptotischer Zellen mit depolari-sierten Mitochondrienmembranen signifikant an. Nach 24 h in vitro unterschieden sich alle Medien signifikant voneinander (Abb. 38).

Inkubationszeit (h)

**

*

**

apoptotische PMN (%)

0 12 24

0 10 20 30

pH 6,5 pH 7 pH 7,5

*

2 12 24

Abb. 38 Einfluss des pH-Wertes auf die Vitalität der PMN.

Dargestellt ist der Anteil apoptotischer Zellen nach Inkubation in Kulturmedium mit verschiedenem pH für unterschiedliche Zeiten in vitro. Die PMN wurden aus dem Blut von 8 Tieren gewonnen.

(*=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,0001)

Überprüfung der Milchseren aus Infektionsversuchen mit E. coli und S. aureus

Für das Milchserum des Tieres M-08 wurde ein protektiver Effekt auf die Vitalität neutrophi-ler Granulozyten festgestellt. Im Folgenden wurde geprüft, ob dies ebenfalls für die Milchse-ren der andeMilchse-ren E.-coli-infizierten Tiere und diejenigen der S. aureus-infizierten Tiere zutraf.

Alle Milchseren, die vor (0 h) und 24 h p.i. gewonnen wurden, kamen in einer Endverdün-nung von 1:2 in vitro zum Einsatz und wurden mit den PMN zweier gesunder Tiere inkubiert.

Der Einfluss der 0 h-Kontroll-Milchseren der Kühe aus den E.-coli- und aus den S.-aureus-Infektionsversuchen auf die Zellvitalität war unterschiedlich stark. Während nach der Inkuba-tion mit E.-coli–0 h-Milchserum 100 ± 5 x10³ vitale Zellen erfasst werden konnten, lag die Zahl vitaler PMN nach der Inkubation mit S.-aureus–0 h-Milchseren mit 85 ± 7 x10³ vitalen Zellen deutlich, aber nicht signifikant niedriger (Abb. 39).

vitale PMN (x10³/mL)

Abb. 39 Der Einfluss der Milchseren aus den Infektionsversuchen auf die Vitalität der neutrophilen Granulozyten.

A) Anzahl vitaler neutrophiler Granulozyten (Mittelwerte ± SEM) nach Inkubation in verschieden Milchseren (1:2 im Kulturmedium). B) Anteile apoptotischer PMN (Mittelwerte ± SEM). Je Ansatz wurden n=5 Milchseren aus den Infektionsversuchen mit E. coli und S. aureus mit PMN aus dem Blut von 2 Tieren geprüft, deren Werte gemittelt wurden.

Milchseren der Kontroll-Euterviertel 24 h p.i. zeigten weder nach E.-coli- noch nach S.-aureus-Infektion signifikante Unterschiede zu den jeweiligen 0 h-Milchseren (Abb. 39, A).

Die nach der Infektion gewonnenen Milchseren aus den E.-coli-infizierten Eutervierteln be-wirkten eine signifikante Reduktion der vitalen PMN auf 61 ± 11 x10³ PMN (p<0,05) wäh-rend die nach Infektion gewonnenen Milchseren aus den S.-aureus-infizierten Eutervierteln

keinen Vitalitäts-mindernden Effekt für die PMN aufwiesen (Abb. 39, A). Im Gegensatz zu den vitalen Zellen, führten die 0 h-Milchseren der S.-aureus-infizierten Tiere zu signifikant höheren Anteilen apoptotischer PMN als die 0 h-Milchseren der E.-coli-infizierten Tiere (Abb. 39, B). Auf die Anteile der apoptotischen Zellen in vitro hatte das Stadium der Infekti-on keinen signifikanten Einfluss (Abb. 39, B).

4.3.4 Regulation der Zellvitalität durch Histamin in vitro

In Sekreten von gesunden Milchdrüsen war ein Gehalt von 20-25 ng/mL Histamin messbar (4.1.3.1 und 4.2.5). Individuell konnten in mit E.-coli-infizierten Eutervierteln Histamingehal-te von bis zu 115 ng/mL und in S.-aureus-infizierHistamingehal-ten EuHistamingehal-tervierHistamingehal-teln bis zu 130 ng/mL erreicht werden (Einzeldaten nicht gezeigt). Im Folgenden galt es zu prüfen, ob Histamin einen Ein-fluss auf die Vitalität von neutrophilen Granulozyten nimmt.

Histamin, welches bis zu 100 ng/mL dem Kulturmedium zugesetzt wurde, beeinflusste nicht

Im Dokument Untersuchungen zur Beeinflussung funktioneller Eigenschaften von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten in der initialen Phase der bovinen Mastitis (Seite 118-0)