Funktionelle Aktivierung von eosinophilen Granulozyten durch Interleukin-31

Aus der Klinik für Dermatologie, Allergologie und Venerologie der Medizinischen Hochschule Hannover

Funktionelle Aktivierung von eosinophilen Granulozyten durch Interleukin-31

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Nikola Kunsleben

aus Coesfeld

Hannover

2021

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am11.11.2021

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns

Betreuerin der Arbeit: Prof. Dr. med. Ulrike Raap

1. Referent/in: Prof.´in Dr. med. Britta Eiz-Vesper

2. Referent/in:PD Dr. med. Andreas Jokuszies

Tag der mündlichen Prüfung: 11.11.2021

Prüfungsausschuss:

Vorsitz: Prof. Dr. med. Constantin von Kaisenberg 1. Prüfer/in: Prof.´in Dr. med. Anette Melk

2. Prüfer/in: Prof. Dr. med. Hossein Tezval

I

I

Abbildungsverzeichnis ... III Tabellenverzeichnis ... III Abkürzungsverzeichnis ... IV

1 Einleitung ... 1

1.1 Der eosinophile Granulozyt ... 1

1.1.1 Lebenszyklus und Morphologie ... 1

1.1.2 Chemotaxis ... 2

1.1.3 Effektorfunktionen ... 3

1.1.4 Apoptose ... 4

1.2 Atopische Erkrankungen und eosinophile Granulozyten ... 5

1.2.1 Atopische Dermatitis ... 7

1.3 Das Zytokin Interleukin-31 ... 9

1.4 Fragestellung ... 10

2 Material und Methoden ... 11

2.1 Humane Untersuchungspopulation ... 11

2.2 Methoden ... 11

2.2.1 Isolation von humanen Eosinophilen aus heparinisiertem Vollblut ... 11

2.2.2 Zellkultur ... 13

2.2.3 Durchflusszytometrie ... 14

2.2.4 Apoptose ... 16

2.2.5 Zytospin-Dünnschicht-Zellpräparation ... 17

2.2.6 PCR ... 19

2.2.7 Western Blot ... 21

2.2.8 ELISA ... 23

2.2.9 Calcium-Mobilisation ... 25

2.2.10 Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies ... 25

2.2.11 Chemotaxis ... 26

2.2.12 Statistische Analyse ... 28

2.3 Materialien... 29

2.3.1 Allgemein: ... 29

2.3.2 Speziell ... 30

2.3.3 Chemikalien ... 32

2.3.4 Antikörper ... 34

2.3.5 Stimuli ... 35

II

2.3.6 Puffer, Medien und Lösungen ... 35

3 Ergebnisse ... 39

3.1 Nachweis der Rezeptoren IL-31 RA und OSMR ... 39

3.2 Eosinophile exprimieren IL-31 ... 41

3.3 Freisetzung von IL-31 durch Eosinophile bei atopischer Dermatitis ... 45

3.4 Expression von IL-31 durch Eosinophile im Vergleich zu anderen Zellen ... 46

3.5 IL-31 inhibiert die Apoptose ... 47

3.6 IL-31 induziert Chemotaxis ... 48

3.7 Calciumeinstrom unter Einfluss von IL-31 ... 50

3.8 IL-31 induziert reaktive Sauerstoffspezies (ROS) ... 52

4 Diskussion ... 53

4.1 Eosinophile als Quelle von IL-31 ... 53

4.2 Überleben und Zelltod ... 54

4.3 IL-31-induzierte Chemotaxis... 54

4.4 Calciummobilisation durch IL-31 ... 55

4.5 Freisetzung zytotoxischer Eosinophilenprodukte ... 56

4.6 Limitationen der Arbeit ... 56

5 Zusammenfassung und Schlussfolgerung ... 58 Danksagung ... A Lebenslauf ... B Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 6 und 7 PromO ... C

III

A

Abbildung 1: Darstellung der eosinophilen Granulozyten in der FACS-Analyse. ... 15

Abbildung 2: Darstellung der Schmelzkurve der Real-Time PCR für die Rezeptoren ... 39

Abbildung 3: Beispielhafte Darstellung der Rezeptoren unter dem Fluoreszenzmikroskop nach Färbung in der Dünnschicht-Zellpräparation ... 40

Abbildung 4: Intrazellulärer Nachweis von IL-31 bei nicht atopischen Probanden ... 41

Abbildung 5: Eosinophile Granulozyten nach intrazellulärer Färbung mit IL-31 in der Fluoreszenzmikroskopie. ... 41

Abbildung 6: Proteinnachweis von IL-31 in der WB-Technik ... 42

Abbildung 7: Nachweis von IL-31 auf mRNA-Ebene in der Real-Time PCR. ... 43

Abbildung 8: Nachweis von IL-31 in Zellüberständen nach 24 und 48 h in Kultur mittels ELISA ... 44

Abbildung 9: Freisetzung von IL-31 bei Patienten mit AD ... 45

Abbildung 10: Expression von IL-31 durch Eosinophile im Vergleich zu anderen Zellen. ... 46

Abbildung 11: Einfluss von IL-31 auf die Apoptose eosinophiler Granulozyten ... 47

Abbildung 12: Darstellung der Chemotaxis von Eosinophilen innerhalb von 3 Stunden in der modifizierten Boyden-Kammer. ... 48

Abbildung 13: CCL26 Konzentration nach Stimulation mit IL-31. ... 49

Abbildung 14: Exemplarische Darstellung der Mobilisation von intrazellulärem Calcium in Eosinophilen unter der Stimulation mit IL-31. ... 50

Abbildung 15: Reduzierung der Calciummobilisierung durch Blockierung der IL-31- spezifischen Rezeptoren. ... 51

Abbildung 16: Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) nach Stimulation mit IL-31. ... 52

T

Tabelle 1: Pipettierschema der Standardreihe 1. 27

IV

A

°C Grad Celsius

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µmol Mikromol

Abb Abbildung, Abbildung

AD Atopische Dermatitis

AM Acetoxyacetylester

atopic march atopischer Marsch

Bcl2l11 Apoptosefaktor Bim

BSA Bovines Serum Albumin

Ca Calcium

Capture antibody engl. Fänger-Antikörper

CCL engl. c chemokin ligand

cDNA engl. complementary DNA

CO2 Kohlendioxid

Cu Kupfer

detection antibody engl. erkennender Antikörper

DNA engl. deoxyribonucleic acid

ECP eosinophil cationic protein

EDN eosinophil-derived neurotoxin

EDTA Ethylendiamintetraessigsaure

ELISA engl. enzyme-linked immunosorbent assay

Endkonz Endkonzentration

engl. englisch für

EoSVs engl. Eosinophil sombrero vesicles

EPO engl. eosinophil peroxidases

FACS engl. fluorescent-activated cell sorting

Fc engl. fragment crystallizable

FITC Fluoresceinisothiocyanat

g Gramm

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

GM-CSF engl. granulocyte macrophage colony-stimulating factor

HBSS engl. Hanks Balance Salt Solution

housekeeping gene engl. Referenzgen

ICAM engl. intercelluar adhesion molecule

IgG1 Immunglobulin Typ G1

IL Interleukin

IL-31 RA Interleukin-31 Rezeptor Alpha

isotype switching Isotyp Klassenwechsel

JAK engl. just another kinase

LIF engl. leukemia inhibitor factor

lncRNA engl. long non-codig RNA

MACS engl. magnetic-activated cell sorting

MBP engl. major basic protein

Mg Magnesium

MicroBeads engl. Mikrokügelchen

min Minute

ml Milliliter

Morrbid engl. myeloid RNA regulator of BIM-induced death

mRNA engl. messenger ribonucleic acid

n Anzahl der Probanden

V

NaCl Natriumchlorid

ng Nanogramm

nm Nanometer

OLIG2 engl. Oligodendrocyte transcription factor

OSM oncostatin M

OSMR oncostatin M Rezeptor

PAF engl. platelet activating factor

PBMC engl. Peripheral Blood Mononuclear Cell

PCR engl. Polymerase chain reaction

pg Pikogramm

PI Propiumiodid

PMN polymorphnukleare Zellen

PSGL engl. P-selectin-glycoprotein Ligand

RANTES engl. regulated and normal T cell expressed and secreted

RhoH engl. Ras homolog gene family member

Rolling engl. Rollen

ROS engl. reactive oxygen species

rpm engl. revolutions per minute

RPMI engl. ROSWELL PARK Memorial Institute medium

STAT engl. signal transducer and activator of transcription

TBS engl. Tris-buffered saline, engl. Tris-buffered saline

TNF Tumor Nekrosefaktor

VCAM engl. vascular adhesion molecule

VEGF engl. vascular endothelial growth factor

VLA engl. very late antigen

x g Vielfache der Erdbeschleunigung

XBP1 engl. X-box binding protein

1

1 E

1.1 Der eosinophile Granulozyt

Seinen Namen verdankt der eosinophile Granulozyt (auch der Eosinophile genannt) der Anfärbbarkeit der basischen Granula mit dem sauren Farbstoff Eosin, erstmals entdeckt von Paul Ehrlich1879[1].

1.1.1 Lebenszyklus und Morphologie

Eosinophile Granulozyten gehören zur Gruppe der polymorphkernigen Leukozyten, deren Entstehung aus einer CD34+ pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle größtenteils im Knochenmark, aber auch in Milz, Thymus und Lymphknoten abläuft[2]. Während der etwa viertägigen Eosinophilopoese bildet sich zunächst eine pluripotente myeloische Stammzelle, aus der sowohl eosinophile als auch basophile Granulozyten entstehen können. Es folgt die Differenzierung zum Promyelozyt, Myelozyt, Metamyelozyt bis abschließend zum terminal differenzierten Eosinophilen[3]. Transkriptionsfaktoren wie X-box binding protein 1 (XBP1) [4], Ras homolog gene family member H (RhoH) und Oligodendrocyte transcription factor (OLIG2) regulieren die Differenzierung der Zelle. Deren Expression wird von verschiedenen Zytokinen wie Interleukin-5 (IL-5), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM- CSF) und Interleukin-3 (IL-3) beeinflusst[5]. Bereits während dieser Entwicklung beginnt die Biogenese der Granulaproteine unter dem Einfluss des Transkriptionsfaktors XBP1 und dem Cysteine protease inhibitor cystatin F (Leukocystatin)[4, 6]. Um die Zelle vor der Toxizität der eigenen Granulaproteine zu schützen, liegen diese bis zur Degranulation in einer kristallisierten, inaktiven Form vor[6, 7]. Eine Störung in der Granulabiogenese führt zum Verlust der Zellviabilität und verhindert eine Ausdifferenzierung des Eosinophilen[6].

Nach Abschluss der Eosinophilopoese findet, wiederum unter Einfluss von Zytokinen, vor allem durch IL-5, die Migration der Zellen ins Blut statt, wo die Eosinophilen einen Anteil von etwa 2% bis über 10% der Gesamtleukozyten darstellen. Sie verweilen dort nur wenige Stunden. Eine wesentlich höhere Konzentration von eosinophilen Granulozyten findet sich im Gewebe, wo sie eine Überlebenszeit von bis zu mehreren Wochen aufzeigen[8].

2

Neben den mit Eosin anfärbbaren Granula, ist sein zweifach gelappter Zellkern typisch für den eosinophilen Granulozyten. Er hat mit 12-15 µm eine ähnliche Größe wie der neutrophile Granulozyt[9].

Die Granula weisen eine einzigartige Morphologie auf und sind spezifisch für eosinophile Granulozyten. Am prominentesten zeigen sich die spezifischen (früher: sekundären) Granula, die den Hauptanteil der Granula in ausdifferenzierten Eosinophilen ausmachen. Sie sind stark azidophil und weisen einen elektronendichten Kern mit umgebender, aufgelockerter Matrix auf.

Diese Granula enthalten zytotoxische Proteine, über die die Effektorfunktionen der Eosinophilen vermittelt werden. Man unterscheidet zwischen dem major basic protein (MBP) des kristalloiden Kerns und den, in der Matrix vorkommenden eosinophil cationic proteins (ECP), eosinophil-derived neurotoxins (EDN) und eosinophil peroxidases (EPO). Des Weiteren finden sich Zytokine, Rezeptoren, Chemokine, Wachstumsfaktoren und Enzyme in den spezifischen Granula[10]. In Abhängigkeit von verschiedenen Stimuli werden diese Produkte freigesetzt und entfalten ihre Wirkung.

Die unreifen, spezifischen (früher: primären) Granula finden sich hauptsächlich in den Promyelozyten und sind gleichmäßig elektronendicht. Sie sind als Quelle des lysophospholipasebindenden Charcot-Leyden-Kristall-Proteins bekannt und enthalten außerdem Vorläufer des MBPs und weitere Proteine. Aus diesen unreifen Granula entstehen die spezifischen Granula[10].

Die Eosinophil Sombrero Vesicles (EoSVs) (früher: kleinen Granula) sind vesikutubuläre Strukturen, die von den spezifischen Granula abgeleitet werden. Sie enthalten aktive Arylsulfatase B, saure Phosphatase sowie Katalase und spielen eine entscheidende Rolle bei der eosinophilen Sekretion. Sie kommen vornehmlich in gewebeständigen Eosinophilen vor[10].

Ferner gibt es noch Lipidkörperchen, die als membrangebundene Strukturen verschiedene Zytokine und Chemokine speichern.

Im Vergleich mit anderen Leukozyten weisen Eosinophile die höchste Dichte auf, sodass sie durch Dichtegradientenzentrifugation von anderen Leukozyten getrennt werden können.

Außerdem unterscheidet sich die Dichte der einzelnen Eosinophilen durch ihren Aktivierungsgrad. Ruhende Eosinophile sind normodens und Aktive hypodens[11].

1.1.2 Chemotaxis

Da der eosinophile Granulozyt seine Effektorfunktion hauptsächlich im Gewebe ausübt, muss er zunächst aus der Blutzirkulation auswandern. Diesen Vorgang nennt man Chemotaxis. Man

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unterteilt sie in vier Schritte: Während der Margination nähert sich die Zelle, nach Kontakt zu Mediatoren aus dem Gewebe wie z.B. IL-3 oder IL-5, an die Gefäßwand an. Es folgt die Interaktion des P-selectin-glycoprotein Liganden (PSGL)-1 der Eosinophilen mit dem P- Selektin der Endothelzelle, was zum sogenannten Rolling führt. Für die anschließende feste Bindung an das Endothel, die Adhäsion, sind das very late antigen (VLA)-4 und das Integrin αM-β2 (CD11b/CD18) auf Seiten des Eosinophilen und das aktivierte vascular adhesion molecule (VCAM)-1 und das intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 auf Seiten der Endothelzelle verantwortlich[12–14]. Als nächstes folgt die Transmigration, bei der der Eosinophile das Gefäßendothel mit Hilfe von Metallproteasen durchwandert. Nun können die Eosinophilen über die Bindung an Matrixproteine entlang eines Chemokingradienten in das Entzündungsgebiet wandern und dort ihre Wirkung zeigen[1, 15]. Die chemischen Verbindungen, die die Chemotaxis möglich machen, werden Chemokine genannt. Dazu gehören unter anderem der platelet activating factor (PAF), das Leukotrien (LT)D4, C5a und RANTES (Regulated And Normal T cell Expressed and Secreted) sowie spezifisch für den eosinophilen Granulozyten das Eotaxin[15, 16].

1.1.3 Effektorfunktionen

Der eosinophile Granulozyt übernimmt die wichtige Aufgabe der Wirtsabwehr gegen Pathogene und spielt eine große Rolle bei entzündlich-allergischen Erkrankungen. Dies geschieht über verschiedene, durch die zytotoxischen Proteine vermittelte Mechanismen.

Das MBP übernimmt die Hauptaufgabe in der Abwehr von Parasiten wie Protozoen und Würmern und wirkt außerdem zytotoxisch auf Tumorzellen und andere Körperzellen[17]. Bei Mastzellen und basophilen Granulozyten fördert es die Histaminfreisetzung sowie bei Neutrophilen die Freisetzung von Superoxiden und lysosomalen Enzymen[18, 19].

ECP und EDN weisen durch ihre Ribonukleaseaktivität neurotoxische und antivirale sowie parasitotoxische Eigenschaften auf[20, 21]. ECP hat ein großes gewebeschädigendes Potential und gilt als Marker der Krankheitsaktivität der atopischen Dermatitis[22]. EDN hemmt außerdem die T-Zellaktivität[23].

EPO führt in Kombination mit Wasserstoffperoxid und Pseudohalogeniden, Halogeniden oder Stickoxiden zur Zellzerstörung, indem es die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, Stickstoffverbindungen und peroxinitratähnlichen Oxidantien induziert. Es kommt zu oxidativem Stress, was zunächst zu Gewebeschädigung und dann zu Nekrose bzw. Apoptose führt[15]. Einen ähnlichen Effekt hat der sogenannte respiratory burst, durch den Eosinophile nach Aktivierung der Zellen durch Zytokine, Chemokine und Anaphylatoxine über die

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membranständige NADPH-Oxidase molekularen Sauerstoff zu Superoxidanionen reduzieren[24]. EPO inaktiviert außerdem Leukotriene und hemmt die Chemotaxis von Neutrophilen, was potentiell antiinflammatorisch wirkt[2, 25, 26].

Eosinophile sind außerdem in der Lage eine Vielzahl von Zytokinen und Chemokinen sowie Lipidmediatoren[26] und Wachstumsfaktoren wie vascular endothelial growth factor (VEGF)[27] zu bilden.

Eine gesteigerte Freisetzung all dieser Effektorsubstanzen spielt eine Rolle bei Erkrankungen, die mit einer Eosinophilie einhergehen, wie zum Beispiel die atopische Dermatitis[28]. Diese Stimulierung der Zellen zur gesteigerten Degranulation wird über Interleukine wie IL-3, IL-5 sowie über GM-CSF, tumor necrosis factor (TNF)-α und den Komplementfaktor C5a vermittelt[16, 29, 30].

1.1.4 Apoptose

Die Apoptose beschreibt den sogenannten programmierten Zelltod. Dies ist ein wichtiger biologischer Prozess, der nach einem bestimmten Muster abläuft und durch verschiedene Signale ausgelöst wird. Es gibt den extrinsischen Weg über rezeptorvermittelte Apoptose, z.B.

durch Kortison[31]. Daneben gibt es den zellspezifischen Weg. Bei Eosinophilen z.B. über die Ligation des spezifischen Oberflächenmoleküls CD69[32] und des Fas-Liganden CD95[33].

Die Anfälligkeit der Zelle für diese Form der Apoptose wird unter anderem durch INF-gamma und TNF-alpha mittels der Hochregulierung der CD95 Expression auf den Eosinophilen gesteigert[34]. Außerdem kann die Apoptose auf dem intrinsischen Weg über DNA- Schädigung, freie Radikale, Infektionen und andere Signale eingeleitet werden[35].

In der Initiationsphase erhält die Zelle das Signal zur Apoptose. In der Effektorphase wird dann der intrazelluläre Signalweg, der zum Zelltod führt, aktiviert. Hierbei handelt es sich um einen komplexen Mechanismus, der über verschiedene Kaskaden gesteuert wird. Bei eosinophilen Granulozyten z.B. über die Caspasen-Kaskade[36]. Es kommt zu Zellschrumpfung, Kernkondensation, Bildung von Apoptosekörperchen, DNA-Fragmentierung und dem Verlust der Nukleoli[15]. In der letzten Phase werden die apoptotischen Zellen von Makrophagen erkannt und phagozytiert[37].

Neben den Auslösern der Apoptose gibt es eine Reihe von apoptoseinhibierenden Stoffen. Für Eosinophile ist dies z.B. für IL-3, IL-5 und GM-CSF gut bekannt[38]. Des Weiteren konnte in den vergangenen Jahren eine long non-coding RNA (lncRNA) identifiziert werden, die die Transkription des Apoptosefaktors Bim (Bcl2l11) verhindert. Diese RNA wurde myeloid RNA regulator of BIM-induced death, kurz Morrbid genannt[39]. In ausdifferenzierten eosinophilen

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Granulozyten liegt Morrbid in hoher Konzentration vor, die durch Anwesenheit apoptoseinhibierender Stoffe sogar weiter gesteigert und die Überlebensdauer der Zellen dadurch verlängert werden kann[6]. Dies spielt bei Erkrankungen mit einer Eosinophilie eine große Rolle, da hier bereits in der Vergangenheit gezeigt werden konnte, dass die Apoptose von Eosinophilen atopischer Probanden¹ deutlich inhibiert ist im Vergleich zu nicht atopischen Probanden[38].

1.2 Atopische Erkrankungen und eosinophile Granulozyten

Die Atopie beschreibt die charakteristische Immunreaktion eines Menschen auf Antigene beziehungsweise Allergene. Durch CD4 positive TH2-Differenzierung und die Bildung von allergenspezifischem IgE kommt es zu einer allergischen Reaktion[40]. Generell weisen Menschen mit einer Atopie eine erhöhte Konzentration von Gesamt-IgE-Antikörpern im Blut auf[41]. Zu den Erkrankungen des atopischen Formenkreises zählen unter anderem die Rhinoconjunctivitis allergica, das Asthma bronchiale allergicum und die atopische Dermatitis (AD)[40, 42, 43]. Als Auslöser einer atopischen Reaktion sind viele verschiedene Allergene bekannt. Sowohl tierische als auch pflanzliche Produkte, Medikamente und Chemikalien können ursächlich sein[40]. In Industrienationen sind etwa 10-30% der Menschen betroffen[40].

Die Ätiologie der Atopie ist weitestgehend unbekannt. Verschiedene Studien konnten einen hohen Anteil einer genetischen Prädisposition nachweisen[44, 45]. Beispielsweise konnten spezifische Gene auf den Chromosomen 5q und 17 identifiziert werden, die eine entscheidende Rolle beim Asthma bronchiale des Kindes spielen[46]. Auf diesen Genen liegen unter anderem die Gencluster für IL-4 und IL-13, die wiederum für das IgE isotype switching mitverantwortlich sind. Weitere genetische Komplexe sind ADAM33, eine Metallprotease, die am Remodelling der Atemwege beteiligt ist, und DPP10, ein Protein, das die Aktivität von Cytokinen und Chemokinen reguliert[40, 45].

Neben der genetischen Prädisposition sind viele weitere Einflussfaktoren wie Rauchen, Luftverschmutzung, Übergewicht, Stress und Infektionen bekannt[47, 48]. Für die Rhinoconjunctivitis allergica beispielsweise konnten bei Kindern in den letzten 25 Jahren unter anderem das Leben in einer Industrienation mit erhöhtem Straßenverkehr, der Verzehr von Fast

1 In dieser Arbeit wird aus Gründen der Lesbarkeit im Folgenden das generische Maskulinum verwendet. Diese Formulierungen umfassen stets weibliche und männliche Personen gleichermaßen. Abweichungen von dieser Regel werden durch explizite Formen im Text deutlich gemacht.

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Food, das männliche Geschlecht sowie prä- und postnatale Ereignisse als Risikofaktoren ausgemacht werden[49]. Außerdem beeinflusst eine verringerte oder auch verstärkte Exposition mit Mikroorganismen das Auftreten einer Atopie[47, 50].

Pathophysiologisch zeigt sich eine Mastzellaktivierung durch Bindung von IgE. Diese führt über die Aktivierung mehrerer intrazellulärer Signalwege zur Freisetzung von Zytokinen, Lipidmediatoren und Histamin, was wiederum die inflammatorische Reaktion bewirkt[40].

Außerdem spielen humane Eosinophile eine wichtige Rolle in der Pathogenese von allergisch entzündlichen Erkrankungen inklusive der atopischen Dermatitis[2, 51, 52]. Typischerweise findet sich bei den Patienten eine deutlich erhöhte Anzahl von zirkulierenden und gewebsständigen Eosinophilen[53, 54]. Es wird angenommen, dass Eosinophile im Entzündungsprozess durch die Freisetzung von reaktiven Sauerstoffradikalen und toxischen Granula eine Rolle bei der Gewebsschädigung spielen[55]. Eosinophile sezernieren proinflammatorische Zytokine, Chemokine und Proteine wie das eosinophile kationische Protein (RNASE3), das bekanntermaßen mit dem Krankheitsgrad von Patienten mit AD korreliert[28]. Des Weiteren gibt es Hinweise auf eine fehlerhafte Regulation der T- Zellaktivität bei atopischen Erkrankungen wie der AD, die dazu führt, dass die T-Zellen den Anstieg der IgE Antikörper nicht bremsen können[40].

Die wirksamste Therapie einer atopischen Erkrankung ist das vollständige Fernhalten vom jeweiligen Allergen. Da dies kaum möglich ist, wurden verschiedene medikamentöse Therapien entwickelt.

Antihistaminika entfalten ihre Wirkung über eine Blockade der Histamin-Rezeptoren, von denen vier verschiedene bekannt sind[56]. Das Gewebshormon Histamin ist dafür bekannt, über Mastzellaktivierung und die Freisetzung von Interleukinen an akuten Abwehrreaktionen des Körpers beteiligt zu sein[56]. Bei atopischen Erkrankungen kommen hauptsächlich H1- und H2- Antihistaminika zum Einsatz. Sie vermindern Symptome wie Hautrötung, Juckreiz und Rhinitis. Gängige Präparate sind zum Beispiel Cetirizin und Loratadin.

Kortikosteroide besitzen eine immunsuppressive sowie entzündungshemmende und antiallergische Wirkung. Sie kommen bei der topischen und systemischen Therapie zum Einsatz. Verfügbare synthetische Kortikoide sind zum Beispiel Prednison und Prednisolon.

Immunsuppressiva wie Cyclosporin A oder Methotrexat werden zum Beispiel bei schweren Krankheitsverläufen der atopischen Dermatitis verabreicht[57].

Dupilumab (Dupixent^®) ist ein Medikament zur gezielten Therapie moderater, bis schwerer atopischer Dermatitis bei Erwachsenen. Seit 2018 ist der Einsatz bei Kindern ab 12 Jahren als Zusatztherapie bei Asthma bronchiale zugelassen. Weitere klinische Studien laufen aktuell[58].

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Dupilumab ist ein humaner monoclonaler IgG4 Antikörper, der sich gegen die Alphauntereinheit des Typ 2 IL-4 Rezeptors richtet. Dadurch wird der Signalweg von IL-4 und IL-13 blockiert, der maßgeblich an der Pathogenese atopischer Erkrankungen beteiligt ist[58–

60]. Die Freisetzung proinflammatorischer Cytokine und Chemokine wird verhindert. Der Anstieg von IgE bleibt aus, da das Istotype switching nicht stattfindet.

Zur gezielten Therapie des eosinophilen Asthma bronchiale allergikum ist Mepolizumab (Nucala^®) in Deutschland als ergänzende Therapie bei Erwachsenen zugelassen. In den USA wird es bereits ab einem Alter von 6 Jahren angewendet. Es handelt sich um einen humanen monoklonalen Antikörper, der zirkulierendes IL-5 bindet und somit die Bindung an der Alpha Untereinheit des IL-5 Rezeptors auf eosinophilen Granulozyten verhindert[61]. Dadurch findet keine Aktivierung der Eosinophilen statt, die eine inflammatorische Reaktion im Gewebe nach sich ziehen würde. Studien wiesen nach, dass unter der Therapie mit Mepolizumab die Dosis der eingesetzten Kortikosteroide reduziert werden kann und das Risiko von Exazerbationen insbesondere mit Hospitalisierung sinkt[61, 62].

1.2.1 Atopische Dermatitis

Da in der vorliegenden Promotionsarbeit beispielhaft für die Erkrankungen des atopischen Formenkreises Patienten mit atopischer Dermatitis untersucht wurden, erfolgt an dieser Stelle eine Charakterisierung der Erkrankung.

Die atopische Dermatitis ist eine weit verbreitete, chronisch entzündliche Erkrankung der Haut.

Weltweit sind etwa 20% der Kinder und 3% der Erwachsenen betroffen[63, 64]. Sie tritt in den meisten Fällen bereits im frühen Kindesalter auf[65]. Häufig ist die AD der erste Schritt im sogenannten atopic march, bei dem die Patienten im Verlauf ihres Lebens weitere atopische Erkrankungen wie Lebensmittelallergien, Asthma bronchiale allergikum und allergische Rhinitis entwickeln[66]. Die Erkrankung hat einen hohen Einfluss auf die Lebensqualität[67]

und ist außerdem mit verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziiert[65, 68]. Als exogene Triggerfaktoren sind zum Beispiel Umweltallergene wie Hausstaubmilbenkot und virale sowie bakterielle Erkrankungen bekannt.

Die Pathophysiologie der atopischen Dermatitis ist vielfältig. Es gibt eine starke genetische Prädisposition. Zum Beispiel konnten Mutationen des Gens für Filaggrin, einem epidermalen Protein, das für die normale Funktion der Haut zuständig ist, bei Patienten mit AD häufig nachgewiesen werden[69]. Weitere Genmutationen im Bereich der Proteine für eine intakte Haut, wie das HRNR oder SPINK5, und für eine gesunde Immunantwort, wie IL-4, IL-13 oder IL-31, wurden entdeckt[69].

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Bei der atopischen Dermatitis läuft typischerweise eine komplexe Kaskade an entzündlichen Reaktionsvorgängen ab[70]. Durch eine gestörte Barrierefunktion der Haut werden Entzündungszellen aktiviert, die eine Reihe von Zytokinen und Chemokinen freisetzen.

Dadurch wird ein Kreislauf angeregt, in dem zunehmend T-Zellen aktiviert werden und das Entzündungsgeschehen aufrechterhalten[66, 68]. Außerdem spielen dendritische Zellen, Mastzellen, basophile- und eosinophile Granulozyten eine wichtige Rolle[69]. Bei der AD wandern eosinophile Granulozyten im Verlauf in das Gewebe ein und führen durch Freisetzen ihrer zytotoxischen Proteine zur Intensivierung des inflammatorischen Prozesses[22]. Es ist bekannt, dass bei Patienten mit AD die Überlebenszeit der Eosinophilen signifikant höher ist als bei gesunden Personen[38]. Die Besiedelung der Haut mit Mikroorganismen wie Staphylococcus aureus und Candida albicans trägt ebenfalls maßgeblich zum Krankheitsgeschehen bei[70].

Die Diagnose der atopischen Dermatitis ist hauptsächlich eine klinische Diagnose[71]. Es liegen Diagnosekriterien nach Hanifin und Rajka aus dem Jahr 1980 vor, die in Haupt- und Nebenkriterien unterteilt werden[66]. Zu den Hauptkriterien gehört neben dem typischen Pruritus und dem chronisch-rezidivierenden Verlauf die charakteristische Lokalisation und Morphologie der Hautläsionen (bei Kindern vorwiegend im Gesicht und an den Streckseiten der Extremitäten, bei Erwachsenen eher an den Beugeseiten der Extremitäten) sowie eine genetische Disposition. Bei den Nebenkriterien findet man z.B. erhöhte Gesamt-IgE Antikörper, die Dennie-Morgan-Falte und das Herthoge-Zeichen. Diese Kriterien werden im klinischen Alltag genutzt und in verschiedenen Ländern unterschiedlich interpretiert und modifiziert[71].

Zur Therapie der atopischen Dermatitis gehören in erster Linie eine gute und konsequente Hautpflege sowie der Einsatz topischer Kortikosteroide[66]. Calcineurininhibitoren wie Tacrolimus oder der Phosphodiesterase-4-Inhibitor Crisaborole werden alternativ bei mildem bis mittelschwerem Krankheitsgeschehen angewendet. Bei schwerem Verlauf der atopischen Dermatitis werden systemische Immunsuppressiva wie Cyclosporin A oder Methotrexat verabreicht. Außerdem steht mit Dupilumab ein humaner Antikörper für die Therapie zur Verfügung, wenn die topische Therapie nicht ausreicht oder nicht umsetzbar ist. Des Weiteren wird bei stark ausgeprägter atopischer Dermatitis die Phototherapie angewendet[66]. Das Ziel der Therapie ist die Remission. Eine Heilung ist aktuell nicht möglich.

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1.3 Das Zytokin Interleukin-31

Das Wort Interleukin kommt aus dem Lateinischen inter = zwischen und dem griechischen leukos = weiß. Interleukine sind körpereigene Peptidhormone, die die Kommunikation zwischen den Leukozyten, aber auch anderen Immunzellen ermöglichen.

Interleukin-31 (IL-31) ist ein Zytokin der glycoprotein130/IL-6 Zytokin Familie[72]. Hierzu zählen ebenfalls IL-6, IL-11, IL-27, leukemia inhibitor factor (LIF) und oncostatin M (OSM)[73]. Ursprünglich wurde eine IL-31 Expression in aktivierten TH2-Helfer Zellen, Mastzellen, Makrophagen und dendritischen Zellen gezeigt[72, 74]. Auch basophile Granulozyten konnten als Quelle für IL-31 identifiziert werden[75].

IL-31 signalisiert über einen, auch von Eosinophilen exprimierten[76], heterodimeren Rezeptor zusammengesetzt aus IL-31 Rezeptor Alpha (IL-31 RA) und oncostatin M Rezeptor (OSMR)[72, 77]. Dieser Rezeptorkomplex ist außerdem nachweisbar auf T-Zellen, Keratinozyten[78], stimulierten Makrophagen[79], Hinterwurzelganglien[80] und basophilen Granulozyten[75].

IL-31 RA bindet IL-31 direkt, während OSMR die Bindungsaffinität erhöht. Über eine intrazelluläre Domain wird die JAK1/2 Kinase aktiviert, was zur Phosphorylisierung und Aktivierung von STAT1 (signal transducer and activator of transcription), STAT3 und STAT5 führt[72]. Zusätzlich wird der PI3K/AKT/mTor und ERK1/2 Kinase Signalweg aktiviert[72, 73].

IL-31 führt zu einer Steigerung der Expression von proinflammatorischen Genen in TH2-Zellen für z.B. CCL2 und GMCSF und in Keratinozyten für z.B. CCL17 und CCL22, die wiederum in ihrer Funktion als Zytokine weitere Entzündungszellen anlocken[81]. IL-31 beeinflusst außerdem die Filaggrinexpression in humanen Keratinozyten negativ, was unter anderem bei der atopischen Dermatitis eine wichtige Rolle in der Pathogenese spielt[82]. Im Mausmodell zeigte sich dadurch eine verstärkte Proliferation und Differenzierung der epidermalen Basalzellen, was zu einer dickeren Hautschicht führte, die einen erhöhten transepidermalen Wasserverlust aufwies [83].

Im Mausmodell wurde gezeigt, dass IL-31 durch die Induktion von starkem Juckreiz eine chronische Dermatitis auslöst[74]. Unterstützt wurde diese Erkenntnis durch ein weiteres murines Modell mit Eigenschaften der atopischen Dermatitis, das eine Korrelation zwischen dem Kratzverhalten der Tiere und der Serumkonzentration von IL-31 aufweist[84]. In diesem Versuch wurde der Juckreiz durch das Einbringen von Anti-IL31 Antikörper verbessert[85].

Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass ein durch ein sensorisches Neuron exprimierter IL- 31-Rezeptor den T-Helferzell-abhängigen Juckreiz vermittelt[86].

10

Das Interleukin 31 übernimmt eine entscheidende Rolle in der Pathogenese atopischer Erkrankungen[81]. Bei allergisch, entzündlichen Hauterkrankungen wie der chronischen Urticaria und der atopischen Dermatitis zeigen sich erhöhte IL-31-Serumkonzentrationen[87–

89]. IL-31 korreliert signifikant mit der Schwere der atopischen Dermatitis bei Erwachsenen und Kindern[88–90]. Ebenso ließ sich bei Patienten mit Mastozytose ein erhöhtes IL-31 im Serum nachweisen, das wiederum mit der Progression der Erkrankungen korrelierte[91]. Des Weiteren korrelieren die Expression der Haut IL-31 mRNA und die IL-31-Konzentration im Serum mit den TH2-Zytokinen inklusive IL-4 und IL-13 bei AD und akuter allergischer Kontaktdermatitis[88, 92]. Die Rolle von IL-31 in weiteren autoimmunen Hauterkrankungen wie dem bullösen Pemphigoid und der Psoriasis ist aktuell noch nicht eindeutig[81].

Derzeit laufen klinische Studien zu einem monoklonalen Anti-IL31 RA Antikörper namens Nemolizumab, der die Bindung von IL-31 unterbindet[93]. Es zeigte sich eine deutliche Reduktion des Pruritus und dadurch der kutanen Inflammation bei Patienten mit atopischer Dermatitis.

1.4 Fragestellung

Die Hautläsionen bei atopischer Dermatitis[94] und chronischer Urticaria[95] zeigen charakteristisch eine Infiltration mit eosinophilen Granulozyten. Das IL-31 wurde als neues Prurituszytokin erkannt und zeigt signifikante Korrelationen mit der Krankheitsaktivität der oben genannten Erkrankungen[88, 89].

Es wurde bislang nicht untersucht, ob Eosinophile selbst eine Quelle von IL-31 darstellen.

Daher ist dies eine zentrale Frage der vorliegenden Promotionsarbeit. Außerdem soll geklärt werden, ob IL-31 die funktionelle Aktivität von Eosinophilen im Sinne der Chemotaxis, Calcium Mobilisation, Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies oder Zytokinen modifiziert.

Die Unterschiede zwischen Eosinophilen atopischer und nicht atopischer Personen sollen beispielhaft untersucht werden, um gegebenenfalls einen Ausblick für die klinische Relevanz abzuschätzen.

11

2 M

M

2.1 Humane Untersuchungspopulation

Nach informierter Einwilligung, genehmigt durch das Ethikkommitee der medizinischen Hochschule Hannover, wurde das venöse Blut von Patienten mit atopischer Dermatitis sowie gesunder Kontrollpersonen untersucht. Alle Teilnehmer waren Nichtraucher und standen vor sowie während des Untersuchungszeitraums unter keinerlei immunsuppressiver oder immunmodulatorischer Therapie. Gesunde Kontrollpersonen wiesen keine persönliche oder familiäre Belastung für Allergien oder andere atopische Erkrankungen auf.

2.2 Methoden

2.2.1 Isolation von humanen Eosinophilen aus heparinisiertem Vollblut

2.2.1.1 Dichtegradientenzentrifugation

Die heparinisierten Vollblutproben (60 ml) wurden unter sterilen Bedingungen mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) im Verhältnis 1:2 verdünnt. Danach folgte die sorgfältige Überschichtung von 15 ml Ficoll mit 35 ml des Blut-Puffer-Gemisches in ein 50 ml Röhrchen. Zur Trennung der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) von den polymorphnukleären Zellen (PMNs) und den Erythrozyten, wurde der Gradient bei 409 × g für 40 Minuten bei 24°C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Plasmaphase und die sich in der Interphase befindlichen PBMCs sowie die Ficoll-Phase abgenommen und verworfen. Das am Boden verbliebene Pellet aus PMNs und Erythrozyten wurde, um eine Verunreinigung durch die an der Wand haftenden Lymphozyten zu vermeiden, vorsichtig mit Hilfe einer Transferpipette in ein neues 50 ml Röhrchen übertragen und mit den anderen Pellets des Spenders auf 4 Röhrchen gepoolt.

2.2.1.2 Erythrozytenlyse

Die Pellets wurden in Lyse-Puffer gelöst und anschließend für 8 Minuten bei 4°C inkubiert.

Nach der Zentrifugation (677 × g, 8 Minuten, 4°C) wurden die Überstände abgesaugt und der Lyseschritt wiederholt. Das nach der Zentrifugation im Röhrchen verbliebene Granulozyten- Pellet wurde zweifach mit PBS gewaschen (353 × g, 5 Minuten, 4°C).

12 2.2.1.3 Bestimmung der Zellzahl

Zur Bestimmung der Zellzahl wurde die Kimura-Färbung genutzt. Von der Zellsuspension wurden 10 µl mit 90 µl Kimuralösung verdünnt. Nach 60 Sekunden Inkubationszeit wurden 10 µl dieser Verdünnung in eine Neubauer-Zählkammer pipettiert und vier Großquadranten mikroskopisch ausgezählt. Durch Bildung des Mittelwertes und dessen Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor (10-fach), dem Volumen der Zellsuspension und dem Kammerfaktor (10⁴) konnte die absolute Zellzahl bestimmt werden.

2.2.1.4 Magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS^®-Isolation)

Für die magnetische Isolation gibt es zwei verschiedene Prinzipien, die negative und die positive Isolation. Bei den Eosinophilen wurde ausschließlich die Negativisolation genutzt.

CD16 negative Isolation für Eosinophile

Für die Selektion wurde die Granulozyten-Zellsuspension zentrifugiert (353 × g, 4°C, 5 Minuten). Dann wurde das Zellpellet in MACS-Puffer (1µl pro 10⁶ Zellen) resuspendiert und das identische Volumen Anti-CD16 MicroBeads hinzugefügt und für 30 Minuten lichtgeschützt bei 4 °C inkubiert. Danach wurde die Suspension mit MACS-Puffer auf 30 ml aufgefüllt und zentrifugiert (353 × g, 4°C, 5 Minuten). Nach einem Spülvorgang der LS-Säulen mit 3 ml MACS-Puffer wurden 2 × 10⁸ Zellen in 1 ml MACS-Puffer auf die LS-Säule übertragen. Die nicht markierten eosinophilen Granulozyten durchwanderten ungehindert die LS-Säule und wurden in einem 15 ml Röhrchen aufgefangen, während die CD16 positiven Neutrophilen im Magnetfeld der Säule hängen blieben. Um sicher zu stellen, dass alle nicht markierten Zellen durch die Säule wandern, wurden die LS-Säulen mit 3 × 3 ml MACS-Puffer gespült.

Die aufgefangene Zellsuspension wurde zentrifugiert (353 × g, 4°C, 5 Minuten) und zweimal mit PBS gewaschen (353 × g, 4°C, 5 Minuten).

Isolierung der T Zellen (CD4+ und CD8+) und Monozyten (CD14+) durch positive magnetische Isolation

Die gefilterten Zellen der Interphase und der Lymphoprep wurden zentrifugiert und MACS- Puffer in einer Konzentration von 1 × 10⁷/80µl aufgenommen. Zu dieser Zellsupension wurden 20µl CD4, CD8 oder CD14 MicroBeads pro 1 × 10⁷ Zellen hinzugefügt und für 15 Minutenbei 4°C inkubiert. Danach wurde die Zellsupension mit MACS-Puffer auf 30 ml aufgefüllt und zentrifugiert (300 × g, 5 minuten, 4°C). Das Zellpellet wurde in 1 ml MACS-Puffer

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aufgenommen und auf die wie oben beschrieben vorbereiteten LS-Säulen gegeben. Nach dem letzten Waschschritt wurde der Magnet entfernt und die Zellen durch erneute Zugabe von MACS-Puffer aus der Säule isoliert.

Diese Aufreinigung erfolgte in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Prof. N. Novak (Universität Bonn).

2.2.1.5 Erneute Zellzahlbestimmung

Das Zellpellet wurde steril in 1 ml RPMI-Medium aufgenommen und erneut die Gesamtzellzahl bestimmt (wie oben beschrieben).

Die prozentuale Reinheit der Eosinophilen betrug 99,5%, ermittelt durch mikroskopische Auszählung sowie durch FACS Analyse, dies ist beispielhaft in Abb. 1 dargestellt.

2.2.1.6 Testung der Viabilität durch Trypanblaufärbung

Bei der Trypanblaufärbung handelt es sich um eine Methode, abgestorbene Zellen zu markieren. Diese verlieren bei Apoptose und Nekrose ihre Plasmamembranintegrität, sodass der Farbstoff ins Innere der Zelle gelangen kann und die Zelle blau anfärbt. Vitale Zellen hingegen lassen sich nicht anfärben.

Zur Viabilitätsbestimmung wurde die Eosinophilen-Zellsuspension im Verhältnis 1:1 mit 0,4%iger Trypanblaulösung (je 10 µl) vermengt und für 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 10 µl dieses Gemisches erneut in eine Neubauer-Zählkammer pipettiert und dann 100 Zellen ausgezählt. Der Anteil der vitalen Eosinophilen und somit die Viabilität betrug 99%.

2.2.2 Zellkultur

Alle Zellkulturen erfolgten unter sterilen Arbeitsbedingungen. Die Inkubation der Zellkulturen fand in einem humiden Brutschrank bei 37°C mit 5 CO2 statt.

Eosinophile Granulozyten

Zum Anlegen einer Zellkultur wurden die eosinophilen Granulozyten in RPMI-Medium aufgenommen und mit einer Zellzahl von 1 × 10⁶ Zellen pro ml ausgesät.

Das RPMI-Medium wurde zusätzlich mit hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum, nichtessentiellen Aminosäuren, L-Glutamin, Gentamicin und einem Penicillin/Streptomycin-

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Gemisch versetzt. Alle Stimulierungen begannen nach einer Ruhezeit der eosinophilen Granulozyten von 16 Stunden.

Die intrazelluläre Färbung von IL-31 erfolgte nach einer 60-minütigen Stimulierung der Eosinophilen mit jeweils 10ng/ml IL-3, IL-4, IL-5, IL-13 und IL-31. Die Überstände wurden zentrifugiert und bei -80°C gelagert.

Für die Analyse der Sekretion von CCL26 und IL-31 wurden die eosinophilen Granulozyten für 24 bzw. 48 Stunden mit je 10 ng/ml IL-3 und mit Il-31 in einem Konzentrationsbereich von 1 – 100ng/ml kultiviert.

CD4+ CD8+ CD14+ Zellen

Die CD4 und CD8 positiven T-Zellen wurden in RPMI 1640 (Biochrom AG) mit 10%

hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum, 1% Amphotericin B, Streptomycin und Penicillin, 1 % L-Glutamin und 0,002 % ß-Mercaptoethanol kultiviert.

CD14⁺ Zellen (Monozyten) wurden in RPMI 1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum, 1 % Amphotericin B, Streptomycin, Penicillin, 500 U/ml IL-4 und 500 U/ml GMC-SF kultiviert. Für die Differenzierung zu monozytisch abstammenden dendritischen Zellen wurden die CD14+ Zellen für sieben Tage, mit einem Mediumwechsel alle zwei Tage, kultiviert. Nach sieben Tagen wurde ein Teil der Zellen für weitere zwei Tage mit 10 ng/ml IL- 1ß (Peprotech), 10 ng/ml TNFa (Peprotech), 1 µg/ml PEG2 und 100 ng/ml IL-6 (Biomol) kultiviert.

Für die Untersuchung der IL-31 Expression unter dem Einfluss von SEB wurde dem Medium der Zellen 1 µg/ml SEB hinzugefügt und 6 Stunden kultiviert. Der Überstand wurde abgenommen, zentrifugiert und bei -80 °C gelagert.

Diese Zellkulturen wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Prof. Novak (Universität Bonn) angelegt und die Überstände freundlicherweise für weiterführende Untersuchungen zur Verfügung gestellt.

2.2.3 Durchflusszytometrie

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie können Zellen auf die Expression bestimmter Oberflächenmarker und intrazellulärer Proteine untersucht werden.

Die zu untersuchenden Zellen werden über eine Kapillare angesaugt. Der durch den Überdruck erzeugte laminare Zellstrom wird durch die Anregung von monochromatischem Laserlicht im

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sogenannten Analysepunkt, durch den zwei Laserstrahlen gehen, ausgewertet. Das Vorwärststreulicht (engl. forward scatter = FSC) bestimmt die Zellgröße. Das Seitwärststreulicht (engl. Sideward scatter = SSC) die Granularität der Zelle. Je nach Zahl der Einschlüsse und Oberflächenunebenheiten der Zelle, streut der SSC stärker und Zellen können anhand dieser Merkmale unterschieden werden.

Da die Größe und Granularität von eosinophilen Granulozyten bekannt ist, konnte im FSC und SSC eine Population markiert werden (Abb.1 a), die, neben anderen Zellen, die eosinophilen Granulozyten enthält. Anschließend wurden aus dieser Population mit Hilfe spezifischer Marker, z.B. CD16 PE und CD66b FITC, die eosinophilen Granulozyten identifiziert und die Quantität der zu untersuchenden Oberflächenmarker analysiert (Abb.1 b). Mit Hilfe dieses Verfahrens lässt sich eine verlässliche Aussage über die Reinheit der Zellen treffen.

a) b)

Abbildung 1: Darstellung der eosinophilen Granulozyten in der FACS-Analyse. a) Die umrandete Population stellt die eosinophilen Granulozyten dar, die für die weiteren Messungen verwendet wurden. Reinheit der Eosinophilen 99,5%. (SSC = sideward scatter; FSC = forward scatter) b) Darstellung der Zellen nach Markierung spezifischer Oberflächenmoleküle in der FACS Analyse. Die Zellwolke im rechten unteren Quadranten stellt die Population der eosinophilen Granulozyten dar.

Die Expression von Oberflächenantigenen kann durch Fluoreszenzmarkierung der Antikörper nachgewiesen werden. Der Fluoreszenzfarbstoff gebundener Antikörper wird durch den Laser angeregt und das ausgesendete Licht wird dann von Photodetektoren erfasst.

Für alle durchflusszytometrischen Messungen wurde das FACScalibur^TM genutzt und die Analyse der Daten mit der CellQuestPro^TM Software durchgeführt.

16 2.2.3.1 Intrazelluläre Färbung des Zytokins IL-31

Zunächst wurden 2 × 10⁵ eosinophile Granulozyten für 60 Minuten und 24 Stunden in RPMI- Medium mit und ohne Stimulus kultiviert. Als Stimulantien wurden folgende Peptidhormone verwendet: IL-3, IL-4, IL-5, IL-13 und IL-31.

Parallel mit der Zugabe von Zytokinen wurde BrefeldinA hinzugefügt, um den Golgi-Apparat der Zellen zu stoppen. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und zentrifugiert (353 × g, 5 Minuten, 4°C). Zur Öffnung der Zellporen sowie zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen und Fixierung der Zellen wurden je 2 × 10⁵ Eosinophile in 100 µl Cellfix/Perm aufgenommen und für 15 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach zwei Waschschritten mit PBS wurden die Zellen in 100 µl Puffer aufgenommen und monoklonale Maus anti-Human IL-31 Antikörper beigefügt. Als Isotypkontrolle dienten unkonjugierte Maus IgG1 Antikörper. Die anschließende Inkubation erfolgte für 45 Minuten bei 4°C im Dunkeln. Nach erneutem Waschen erfolgte die Markierung der Erstantikörper mit den FITC-konjugierten Ziege anti- Maus IgG-Antikörpern für 30 Minuten. Im Anschluss wurden die Zellen erneut zwei Waschdurchgängen unterzogen und dann in 200 µl PBS aufgenommen, um am FACS gemessen zu werden.

2.2.3.2 Rezeptorfärbung

Bei der direkten Immunfluoreszenz sind Oberflächenmarker bereits mit fluoreszierenden Primärantikörpern markiert. Es erfolgt dann anschließend die Markierung mit Sekundärantikörpern.

Zunächst wurden 2 × 10⁵ eosinophile Granulozyten in 200µl PBS aufgenommen und 2 mal gewaschen (353 × g, 5 Minuten, 4°C). Zur Blockierung unspezifischer Bindungen folgte die Aufnahme der Zelle in 100 µl Blockpuffer. Anschließend wurden dem Gemisch die Antikörper hinzugefügt. Es wurde der Anti-IL31RA PE (Phycoerythrin) mit seinem Isotyp Ziege IgG sowie der Anti- OSMR PE (Phycoerythrin) mit seinem Isotyp Maus IgG1 verwendet. Nach einer Inkubationszeit von 45 Minuten bei 4 °C auf Eis im Dunkeln erfolgten zwei Waschdurchgänge in PBS und die Messung am FACS.

2.2.4 Apoptose

Änderungen in der Plasmamembran zählen zu den sehr frühen Markern der Apoptose. Mittels Annexin V lässt sich das Phophatidylserin, das bei Apoptose aus der Zelle heraus auf die Außenseite transloziert wird, nachweisen. Durch das Hinzufügen eines Fluoreszenzfarbstoffes

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(Annexin V-FITC) kann man die apoptotischen Zellen durchflusszytometrisch messen. Da auf diese Weise nicht zwischen apoptotischen und nekrotischen Zellen unterschieden werden kann, fügt man einen DNA-Farbstoff hinzu, in diesem Fall Propiumiodid, der durch die durchlässige Membran nekrotischer Zellen eindringt und sich in der DNA anlagert und seinerseits rot fluoresziert.

In der Durchflusszytometrie zeigen sich dadurch drei Zellwolken. Die lebenden Zellen, die Annexin V und PI negativ sind, die frühapoptotischen Zellen, die Annexin V positiv, aber PI negativ sind, sowie die nekrotischen Zellen, die für beide Marker positiv sind.

Die zuvor kultivierten Zellen in RPMI-Medium wurden zweimal in 200 µl PBS gewaschen (353 × g, 5 Minuten, 4°C) und anschließend in 100 µl Binding Puffer (1:10 Binding Puffer/Aqua dest.) aufgenommen. Im nächsten Schritt wurden 5 µl Annexin V/ Loch und 10 µl Propidium iodide/ Loch hinzugefügt und das Gemisch dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur durch Alufolie abgedunkelt inkubiert. Danach wurde jedem Loch 200 µl Binding Puffer zugefügt und die Analyse am FACS durchgeführt.

2.2.5 Zytospin-Dünnschicht-Zellpräparation

Bei Zytospins handelt es sich um Dünnschicht-Zellpräparate aus einer beliebigen flüssigen Matrix zur optimalen Darstellung intakter Zellen und ihrer Zellkerne. Mit Hilfe spezieller Zentrifugen werden die darzustellenden Zellen auf einem klar definierten Bereich eines Objektträgers sedimentiert. Die Zellen werden außerdem abgeflacht, um eine gute Zellkerndarstellung zu gewährleisten.

Die eosinophilen Granulozyten wurden in kaltem PBS suspendiert und die Zellzahl auf 2 × 10⁵ Zellen/ 150 µl PBS eingestellt. Dann wurden die Zytospineinheiten vorbereitet. Zunächst wurde der Zytozentrifugenrotor aus der Zentrifuge herausgenommen und der Deckel entfernt. Die Adhäsions-Objektträger wurden mit dem Mattrand in Richtung Klemme der Spannplatte der Zytospineinheit aufgelegt und das Filterpapier mit der glatten Unterseite auf den Objektträger gelegt. Nun wurde die Zytokammer bis zum Anschlag auf die Spannplatte geschoben und die Klemme geschlossen. Anschließend wurde die komplette Zytospineinheit in den Zytozentrifugen-Rotor eingesetzt und dieser dann in die Zentrifuge gehängt. Nun konnte die Zellsuspension in die entsprechenden Zytokammern pipettiert werden. Nach Schließen des Deckels folgte die Zentrifugation (450 rpm, 5 Minuten bei Raumtemperatur). Im Anschluss wurden die Objektträger vorsichtig aus ihrem Gestell herausgenommen und schräg stehend an der Luft getrocknet. Zur Fixierung der Zytospins wurden die trockenen Objektträger für 20

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Minuten in eiskaltem Methanol bei -20 °C gelagert. Anschließend wurden die Objektträger für weitere 30 Minuten luftgetrocknet und dann bei -20 °C gelagert.

Im nächsten Schritt folgte das Einkreisen der zu untersuchenden Bereiche auf dem Objektträger mit dem PAP-PEN. Anschließend konnte die indirekte Färbung der Zytospins erfolgen. In dieser Arbeit wurden die Rezeptoren IL-31 RA und Oncostatin M Rezeptor (OSMR) gefärbt.

Die Objektträger wurden zunächst zweimal mit PBS gewaschen. Zum Blocken des intrazellulären Avidin und Biotin wurden die Zellsektionen auf dem Objektträger für 15 Minuten mit Avidin Solution inkubiert, anschließend vorsichtig mit PBS abgespült und für weitere 15 Minuten mit Biotin Solution inkubiert. Danach folgten zweimal zweiminütige Waschvorgänge in PBS. Als nächstes wurden unspezifische Bindungsstellen für 20 Minuten mit einem Blockpuffer zuzüglich 5% Serum (NS) entsprechend der Spezies des zweiten Antikörpers blockiert. In diesem Fall für den IL-31 RA hergestellt aus Eselserum (PBS/10%

Eselserum/0,1% Triton × 100/10% BSA) und für den OSMR aus Ziegenserum. Anschließend wurde der erste Antikörper, verdünnt in Antibody Diluent, aufgetragen. Zum einen der Anti- Human IL-RA Antikörper mit seinem Isotyp Ziege IgG und zum anderen der monoclonale Anti-human OSMR mit seinem Isotyp Maus IgG1. Die Proben wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach einem 5-minütigen Waschgang in PBS wurde jeweils der zweite Antikörper hinzugefügt. Zur Darstellung der IL-31 RA wurde ein biotinylierter Esel-Anti-Ziege Antikörper (5 µg/ml, gelöst in PBS) verwendet. Für den OSMR nutzten wir einen biotinylierten Ziege- Anti-Maus Antikörper (5 µg/ml, gelöst in PBS). Nach 30 Minuten Inkubation wurden die Objektträger erneut für 5 Minuten gewaschen. Abschließend erfolgte die Avidin Konjugation.

Die Zellsuspensionen wurden mit Phycoerythrin Avidin D (15 µg/ml) für den IL-31 RA und mit Fluorescin Avidin DCS (15 µg/ml) für den OSMR für 5-10 Minuten inkubiert und dann für 5 Minuten gewaschen und eingedeckt.

Außerdem erfolgte die intrazelluläre Färbung von IL-31. Zunächst wurde die endogene Peroxidase 10 Minuten bei Raumtemperatur geblockt. Nach einem 5-minütigen Waschgang mit PBS erfolgte anschließend der Avidin/Biotin-Block. Dazu wurden die Zellsektionen auf den Objektträgern für jeweils 5 Minuten mit Avidin- und Biotin- Lösung inkubiert. Daraufhin wurde erneut für 5 Minuten in PBS gewaschen. Im nächsten Schritt erfolgte die Permeabilisierung der Zellen durch eine 30-minütige Inkubation mit 0,1% Saponinlösung bei Raumtemperatur. Anschließend wurde ein drittes Mal in PBS gewaschen. Als nächstes wurden auch hier unspezifische Bindungsstellen für 20 Minuten mit einem Blockpuffer zuzüglich 5%

Serum (NS) entsprechend der Spezies des zweiten Antikörpers blockiert. In diesem Fall für IL- 31 hergestellt aus Ziegenserum. Danach wurde das Präparat vorsichtig abgeklopft. Nun wurde

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der erste Antikörper, Anti-IL31 (2,5 µg/ml, gelöst in PBS) mit seinem Isotyp Hase IgG verdünnt in Antibody Diluent und Saponin (10ml AB-Diluent + 0,1g Saponin), aufgetragen. Die Proben wurden für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem 5-minütigen Waschgang in PBS wurde der biotinylierte zweite Antikörper, Ziege-Anti-Hase (10 µg/ml, gelöst in PBS), hinzugefügt und für weitere 30 Minuten inkubiert. Nach einem 5-minütigen Waschvorgang in PBS erfolgte die Avidin Konjugation. Die Zellsuspensionen wurden mit Phycoerythrin Avidin D (15 µg/ml) für 15 Minuten inkubiert. Im Anschluss wurde die Kernfärbung mit 300 nM Dapi durchgeführt, um die Zellkerne der eosinophilen Granulozyten darzustellen. Die fertige Lösung wurde vorsichtig auf das Präparat getropft. Nach 5-minütiger Inkubation wurde dann für 5 Minuten gewaschen. Abschließend konnten die Zellsuspensionen eingedeckt und unter dem Fluoreszenzmikroskop gesichtet werden.

2.2.6 PCR

Die Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ist ein etabliertes Verfahren zur in vitro Vervielfältigung definierter DNA-Abschnitte. Im ersten Schritt erfolgt die Denaturierung, bei der die doppelsträngige DNA bei 94°C in zwei Einzelstränge gespalten wird. Als nächstes findet die Primerhybridisierung statt, indem sich spezifische Primer bei einer Temperatur von 61 °C an die DNA-Stränge anlagern. Eine hitzestabile DNA-Polymerase (Taq- Polymerase) füllt in einem dritten Schritt die Stränge von den Primern ausgehend in 3`- Richtung mit freien Nukleotiden auf. Diese sogenannte Polymerisation findet bei 72 °C statt.

Dabei entsteht ein neuer komplementärer Strang, der im nächsten Schritt wieder als Matrize dienen kann.

2.2.6.1 RNA-Isolation

Die angewandte RNA-Isolation beruht auf der spezifischen Bindung von Nukleinsäuren an Glasfaser- bzw. Silicaoberflächen in Gegenwart eines chaotropen Salzes. Die Zellen werden zunächst lysiert und die RNA in Lösung in einem Gefäß durch einen Silicafilter gewaschen.

Begleitsubstanzen wie Salze, Proteine und andere zelluläre Verunreinigungen passieren den Filter, ohne gebunden zu werden. Kontaminierende DNA wird durch den Zusatz von DNAsen eliminiert. Zum Schluss wird die RNA wieder in Wasser ausgespült.

Verwendet wurde das High Pure Isolation Kit von Roche. Frisch isolierte Eosinophile (3 × 10⁶) wurden in PBS gewaschen (1300 rpm, 5 Minuten, 4 °C) und anschließend in 600 µl PBSin einem 2 ml Micro Tube resuspendiert. Es wurden 1200 µl des im Kit enthaltenden Lysepuffer

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hinzugefügt, die Probe gemischt und sofort in flüssigen Stickstoff überführt, wo sie bis zur weiteren Verarbeitung der Probe bei -80 °C zwischengelagert wurden. Vor der Verarbeitung der Probe wurde der Arbeitsplatz mit RNAse away gereinigt. Zur RNA-Isolation wurde die Probe in das obere Reservoir eines RNAse freien Polypropylen-Auffanggefäßes mit Silicafilter überführt. Nach einem Zentrifugationsschritt (30 s, 8000 × g, Mikrozentrifugen 5415 D), wurde dieser Durchlauf verworfen. Anschließend wurde die Probe für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 90 µl DNAse Inkubationspuffer und 10 µl DNAse (I) inkubiert. Es folgten zwei Waschschritte (30 s, 8000 × g) mit 500 µl Waschpuffer I und 500 µl Waschpuffer II aus dem Kit, um dann in einem dritten Schritt mit 200 µl Waschpuffer II zu waschen (2 min,13.000

× g). Nach Überführung der Filter mit der RNA in ein neues Auffanggefäß, wurden 100 µl Elutionspuffer hinzugefügt, eine Minute inkubiert und eine weitere Minute bei 8000 × g zentrifugiert. Die eluierte RNA wurde bis zur Weiterverarbeitung im Auffanggefäß bei -80 °C gelagert.

2.2.6.2 Reverse Transkription

Bei der reversen Transkription wird die zuvor gewonnene RNA mit Hilfe der reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben und dann mittels PCR amplifiziert.

Verwendet wurde das QuantiTect® Reverse Transcription Kit von Qiagen. Zuerst wurden je 10 µl der RNA Proben für 2 Minuten in einem RNAsefreien Safe-Lock micro test Röhrchen mit 2 µl gDNA Whipeout Puffer und 2 µl Rnase freiem Wasser bei 42°C inkubiert, um kontaminierende DNA zu eliminieren.

Während der Inkubation wurde der Reverse-Transcription Master Mix auf Eis vorbereitet. Pro RNA-Probe wurden 1 µl Quantiscript Reverse Transcriptase, 4 µl Quantiscript RT Buffer und 1 µl RT Primer Mix bereitgestellt.

Das gesamte Volumen der gDNA Eliminationsreaktion (14 µl) jeder Probe wurde in ein Röhrchen mit Reverse-Transkriptions Master Mix pipettiert. Nach einer Inkubation von 15 min bei 42 °C im PTC 200 Thermal Cycler™ folgte die Deaktivierung der reversen Transkriptase durch eine dreiminütige Inkubation bei 95 °C. Bis zur PCR konnte die cDNA bei -20 °C gelagert werden. Eine Kontrollprobe (-RT) wurde ohne reverse Transkriptase vorbereitet.

2.2.6.3 Real-time PCR

Für die Real-Time PCR wurde ein QuantiTect® SYBR Green PCR Kit benutzt. Jede Probe wurde jeweils auf die Ziel-DNA mittels IL-31 Primer und auf das sogenannte housekeeping

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gene RPS20 als Vergleichswert untersucht. Für die Proben wurde zunächst der Master Mix angesetzt, der jeweils 2 µl Primer, 6 µl RNase-freies Wasser und 10 µl PCR Master Mix enthielt. Von diesem Gemisch wurden je 18 µl in eine Kapillare pipettiert und dann 2 µl der DNA-Probe hinzugegeben. Als Negativkontrolle diente bei jedem Durchlauf eine Kapillare mit Master Mix und RNase-freiem Wasser. Eine weitere Kontrollprobe wurde ohne vorherigen reverse Transkription messen. Nachdem die Kapillaren verschlossen wurden, wurden sie in das Probenkarussel überführt und in einer Kapillarenfuge für 1 Minute bei 700 × g zentrifugiert.

Anschließend wurden die Proben im LightCycler nach einem definierten Protokoll (Two Step RT-PCR) in 35 Zyklen gemessen. Für jede Probe wurde die Ziel-cDNA des Primers zum ubiquitären RPS20 als Referenzgen über den sogenannten Crossingpoint des Amplifikats in Beziehung gesetzt. Dieser Messpunkt zeigt an, wann die Fluoreszenz von einer linearen in eine exponentielle Phase übergeht. Dadurch ist eine Quantifizierung der Ziel-cDNA möglich.

Mittels Schmelzkurvenanalyse wurde die Spezifität des Produktes verifiziert und mit Hilfe einer hinterlegten Standardkurve die Ziel-cDNA quantifiziert. Ein bereits vorab bewährter Referenzwert aus der Standardkurve wurde als Kalibrator genutzt, um die Proben vergleichbar zu machen.

2.2.7 Western Blot

Der Western Blot beruht auf einer spezifischen Antikörper-Antigen-Interaktion und dient der Proteinanalyse. Durch die spezifische Bindung des eingesetzten Antikörpers an ein Antigen kann ein einzelnes Protein in einem komplexen Gemisch identifiziert werden. Durch antikörpergekoppelte Meerrettichperoxidase wird bei der Zugabe von Luminol dessen Oxidation katalysiert und freiwerdende Energie in Form von Lichtquanten abgegeben, die mit Hilfe des Aequoria MDS Photonendetektors detektiert wurden. Der Western Blot ermöglicht eine qualitative und semiquantitative Aussage über das entsprechende Protein.

2.2.7.1 Protein Extraktion

Die untersuchten eosinophilen Granulozyten wurden mit einer Zellzahl von 1 × 10⁶ kultiviert und für 60 Minuten mit IL-3 (10 ng/ml) stimuliert bzw. in RPMI Medium (Negativkontrolle) inkubiert. Für die Extraktion der Proteine wurden 1 × 10⁶ eosinophile Granulozyten in 150µl des Western-Blot-Lyse-Puffers aufgenommen. Die Zellen wurden 15 Sekunden gevortext und dann für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Nach der Lyse wurde die Zellsuspension bei maximaler

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Geschwindigkeit für fünf Minuten zentrifugiert und die geklärten Überstände in ein vorgekühltes Reaktionsgefäß überführt. Die Lagerung erfolgte bei -80°C.

2.2.7.2 Proteinbestimmung nach Lowry

Die hier angewandte Methode ist mit der Biuret-Reaktion verwandt und dient der kolorimetrischen Bestimmung der Proteinkonzentration in Lösungen. Im ersten Schritt bildet sich unter alkalischen Bedingungen ein Kupfer-Protein-Komplex. Im Folgenden wird das Cu²⁺

zu Cu⁺ reduziert, wodurch die hinzugegebene gelbe Folin-Ciocalteu-Reagenz (Molybdatophosphorsäure und Wolframatophosphorsäure / Heteropolysäuren) zu Molybdänblau reduziert wird. Die Absorption der daraus resultierenden Blaufärbung der Lösung kann bei einer Wellenlänge von 540, 650 oder 750 nm gemessen.

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde das DC Protein Assay von BioRad verwendet. Für die Messungen wurde zunächst die Reagenz S mit der Reagenz A im Verhältnis 1:50 verdünnt und je 25µl dieser Lösung zu 5µl der Probe in einem Loch einer 96 Lochplatte pipettiert. Nach kurzem Vermischen wurden 200µl der Reagenz B hinzugefügt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Messung erfolgte bei 750 nm. Zur absoluten Bestimmung wurde parallel eine BSA Standardkurve in einem Bereich von 31,25 – 1000µg/ml gemessen.

2.2.7.3 SDS-PAGE

Für die Elektrophorese wurden zunächst die Proben mit einem fünffach konzentrierten Ladepuffer vermischt und für fünf Minuten bei 95°C erhitzt. Zur Auftrennung der Proteine wurde ein 4-16-prozentiges Gel in eine Mini-Protein-Kammer eingespannt, die Kammer mit Elektrophoresepuffer befüllt und in den Taschen jeweils die gleiche Menge an Protein nebst Proteinmarker und Positivkontrolle hinzugefügt. Die Auftrennung erfolgte bei 120V.

Anschließend erfolgte der Transfer der Proteine aus dem SDS-Gel auf eine Nitrozellulosemembran nach der Semi-Dry Methode. Auf in Anodenpuffer getränktes Filterpapier wurde eine ebenfalls in Anodenpuffer getränkte Nitrozellulosemembran gelegt.

Auf diese Membran wurde das in Kathodenpuffer equilibrierte SDS Gel aufgetragen und abschließend in Kathodenpuffer getränkte Filterpapiere. Der Aufbau muss luftblasenfrei erfolgen. Der Transfer erfolgte bei 20 Volt für 25 Minuten geblottet.

Um unspezifische Bindungsstellen zu blocken, wurde die Membran für zwei Stunden bei Raumtemperatur in einem 5% BSA-haltigen Blockpuffer inkubiert. Anschließend folgten drei