der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Standardisierung der quantitativen Messung reaktiver Sauerstoffspezies und der
Phagozytoseaktivität caniner neutrophiler Granulozyten mittels Durchflusszytometrie
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Sandra Eickhoff, geb. Ayasse
aus Mühlacker
Hannover 2002
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. A. Tipold
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. A. Tipold
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. H.-P. Sallmann
Tag der mündlichen Prüfung: 5. Juni 2002
Meinen Eltern
1 Einleitung ... 15
2 Schrifttum... 16
2.1 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten... 16
2.1.1 Entwicklung und Morphologie... 16
2.1.2 Aufgaben und Funktion der PMN im Rahmen der Infektionsabwehr... 20
2.1.2.1 Aufgaben... 20
2.1.2.2 Aktivierung und Chemotaxis der PMN ... 21
2.1.2.3 Adhärenz der PMN an den Endothelzellen der Gefässe ... 22
2.1.2.4 Transmigration der PMN ins Gewebe ... 28
2.1.2.5 Phagozytose durch neutrophile Granulozyten ... 29
2.1.2.6 Abtötung der phagozytierten Organismen... 31
2.1.2.6.1 Sauerstoffabhängige Mechanismen... 31
2.1.2.6.2 Sauerstoffunabhängige Mechanismen... 34
2.2 Krankheitsbilder mit PMN-Dysfunktion ... 36
2.2.1 Leucocyte adhesion protein deficiency Typ I (LAD I) ... 36
2.2.2 Chronische Granulomatose... 37
2.2.3 Chediak-Higashi-Syndrom (CHS)... 38
2.2.4 Zyklische Neutropenie der silbergrauen Collies... 38
2.2.5 Pelger-Huet-Anomalie ... 39
2.2.6 Hypogammaglobulinämie und Komplementdefizienz ... 40
2.2.7 Erworbene Störungen der PMN-Funktion... 40
2.3 Überprüfung wichtiger Funktionen der PMN... 41
2.3.1 Quantitative Bestimmung der Phagozytosekapazität... 41
2.3.2 Überprüfung der Bildungskapazität reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) ... 45
3 Material und Methodik ... 48
3.1 Geräte und Materialien... 48
3.1.1 Geräte, Klinik-und Laborbedarf ... 48
3.1.1.1 Geräte ... 48
3.1.1.2 Klinikbedarf... 49
3.1.1.3 Laborbedarf ... 49
3.1.2 Reagenzien... 50
3.1.3 Puffer, Lösungen und Suspensionen... 52
3.2.1 Klinisch gesunde Hunde... 55
3.2.2 Patienten... 56
3.3 Methodik ... 57
3.3.1 Probengewinnung und – behandlung ... 57
3.3.1.1 Blutentnahme ... 57
3.3.1.2 Zeitpunkt der Probenverarbeitung... 57
3.3.1.3 Gewinnung der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten... 57
3.3.2 Herstellung der eingesetzten Zellsuspension ... 59
3.3.2.1 Ermitteln der PMN-Zahl in der Zellsuspension... 59
3.3.2.2 Einstellen der gewünschten PMN-Konzentration ... 59
3.3.3 Untersuchung zum Einfluss des Verhältnisses von PMN : MNC im Ansatz ... 59
3.3.4 Vorbereitung der Reagenzien für den Phagozytose-Assay... 61
3.3.4.1 Bakteriensuspension ... 61
3.3.4.2 PMA-Verdünnungsreihe ... 62
3.3.4.3 Herstellung der Reagenzienmischung für die Histopaque®-Kissen ... 62
3.3.5 Durchführung des Phagozytose-Assays... 62
3.3.5.1 ohne Histopaque®-Kissen ... 62
3.3.5.2 mit Histopaque®-Kissen ... 64
3.3.6 Vorbereitung der Reagenzien für den ROS-Assay ... 65
3.3.6.1 DHR-Arbeitslösung... 65
3.3.6.1.1 Versuch zum Einfluss der DHR-Endkonzentration im Ansatz... 65
3.3.6.2 Herstellung der PMA-Verdünnungsreihe ... 66
3.3.6.2.1 Vorversuche zum PMA-Einsatz ... 66
3.3.6.2.1.1 Test zum Einfluss der DMSO-Endkonzentration im Ansatz ... 66
3.3.6.2.1.2 Untersuchung zur PMA-Lagerung ... 66
3.3.6.3 Herstellung der Reagenzienmischung für die Histopaque®-Kissen ... 67
3.3.7 Durchführung des ROS-Assays... 67
3.3.7.1 ohne Histopaque®-Kissen ... 67
3.3.7.2 mit Histopaque®-Kissen ... 68
3.3.8 Bestimmung der absoluten Zellzahlen, die im ROS- bzw. Phagozytose-Assay erfasst werden können, mit Hilfe von Referenzzellen... 70
3.3.9 Einfluss von Histopaque® auf die Phagozytosekapazität ... 73
3.3.9.1 Vergleich der Ergebnisse ohne und mit Histopaque®-Kissen ... 73
3.3.9.2 Einfluss des Histopaque® auf die Phagozytierbarkeit der Bakterien... 73
3.3.9.3 Einfluss des Histopaque® auf die Fluoreszenzintensität der FITC-markierten Staphylokokken... 74
3.3.10 Einfluss des Histopaque® auf die ROS-Bildung ... 74
3.3.11 Varianz der Messergebnisse ... 74
3.3.11.1 Varianz innerhalb der Gruppe der gesunden Hunde ... 74
3.3.11.2 Reproduzierbarkeit von Tag zu Tag ... 76
3.3.12 Überprüfung des Einsatzes von Kristallviolett zur Auslöschung extrazellulärer Fluorezenz bei der Phagozytose caniner PMN ... 76
3.3.13 Einfluss von PMA auf die caninen, neutrophilen Granulozyten ... 77
3.3.14 Ermittlung des Anteils toter Zellen pro Messansatz ... 78
3.3.14.1 Einsatz von Propidiumjodid (PJ) ... 78
3.3.14.2 Einsatz von 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) ... 78
3.3.14.3 Einsatz von To-Pro 3 (TP3) ... 79
3.3.15 Einfluss einer 24-stündigen Lagerzeit der Blutproben... 80
3.3.15.1 Einfluss der Lagerung des Blutes beim Phagozytose-Assay... 80
3.3.15.2 Einfluss der Lagerung des Blutes beim ROS-Assay ... 81
3.3.16 Einfluss der Umgebungstemperatur ... 81
3.3.16.1 Phagozytose... 81
3.3.16.2 ROS-Bildung... 82
3.3.17 Einfluss der untersuchenden Person ... 82
3.3.17.1 Phagozytose... 82
3.3.17.2 ROS-Bildung... 82
3.3.18 Untersuchung von Hunden mit Verdacht auf Immundefizienzen... 83
3.3.18.1 Ergebnisse aus Voruntersuchungen ... 83
3.3.18.2 eigene Untersuchungen... 84
3.3.19 Durchflusszytometrie... 84
3.3.20 Statistische Auswertung ... 85
Funktion... 86
4.1.1.1 ROS-Bildung ... 86
4.1.1.2 Phagozytosekapazität... 88
4.1.2 Untersuchung zum Einfluss der DHR-Endkonzentration im Ansatz ... 90
4.1.3 Untersuchungen zum PMA-Einsatz... 94
4.1.3.1 Einfluss der DMSO-Endkonzentration im Ansatz... 94
4.1.3.2 Einfluss der PMA-Lagerung auf die Messergebnisse... 96
4.2 Bestimmung der absoluten Zellzahl im ROS- bzw. Phagozytose-Assay mittels Referenzzellen ... 98
4.2.1 Markierung der Referenzzellen mit Phycoerythrin (PE) ... 98
4.2.2 Markierung der Referenzzellen mit CyTM5 ... 99
4.2.2.1 Ermittlung der absoluten Zellzahl je Messansatz ... 101
4.2.2.2 Einfluss der Histopaquemenge bei der Durchführung des Phagozytoseassay auf die absolute Zellzahl... 102
4.3 Einfluss des Histopaque®-Kissen auf die Phagozytosekapazität ... 104
4.3.1 Vergleich der Ergebnisse ohne und mit Histopaque®-Kissen... 104
4.3.2 Einfluss des Histopaque® auf die Phagozytierbarkeit der Bakterien... 109
4.3.3 Einfluss des Histopaque® auf die Fluoreszenzintensität der FITC-markierten Staphylokokken ... 111
4.4 Einfluss des Histopaque® auf die ROS-Bildungskapazität ... 113
4.4.1 Vergleich der Assay-Ergebnisse ohne und mit Histopaque®-Kissen... 113
4.5 Varianz der Messergebnisse... 115
4.5.1 Varianz innerhalb der Gruppe der gesunden Tiere... 115
4.5.2 Varianz bei Wiederholungsuntersuchungen desselben Tieres ... 117
4.5.2.1 Phagozytose... 117
4.5.2.2 ROS ... 118
4.6 Unterdrückung der Fluoreszenz extrazellulär adhärierender Bakterien mittels Kristallviolett ... 120
4.6.1 Einfluss von Kristallviolett auf die mittlere Fluoreszenzintensität... 120
4.6.2 Einfluss des Kristallviolett auf den %-Anteil phagozytierender Zellen ... 122
4.8 Anteil toter Zellen im Messansatz... 132
4.9 Einfluss einer 24-stündigen Lagerzeit des Blutes ... 138
4.9.1 Einfluss der Lagerzeit des Blutes bei der Phagozytose ... 138
4.9.2 Einfluss der Lagerzeit des Blutes auf die ROS-Bildung ... 141
4.10 Einfluss der Umgebungstemperatur ... 143
4.10.1 Einfluss der Umgebungstemperatur auf die Phagozytosekapazität ... 144
4.10.2 Einfluss der Umgebungstemperatur auf die ROS-Bildung ... 145
4.11 Einfluss der untersuchenden Person... 147
4.11.1 Einfluss der untersuchenden Person bei der Phagozytose... 147
4.11.2 Einfluss der untersuchenden Person auf die ROS-Bildung... 150
4.12 Untersuchung von Hunden mit Verdacht auf eine vorliegende Immundefizienz.. 153
4.12.1 Ergebnisse aus Voruntersuchungen... 153
4.12.2 Ergebnisse aus eigenen Untersuchungen ... 153
4.13 Zusammenfassende Betrachtung der Einflüsse auf die Funktionsüberprüfung der PMN ………154
5 Diskussion... 155
6 Zusammenfassung... 168
7 Summary... 170
8 Literaturverzeichnis ... 172
9 Tabellarischer Anhang ... 188
a 7-AAD
annum (Jahr)
7-Amino-actinomycin D
Abb. Abbildung
ADC Analog-to-Digital-Converter, Analog-zu-Digital- Wandler
Aqua dest. Aqua destillata
BLAD bovine Leucocyte adhesion deficiency, bovine Leukozytenadhäsionsdefizienz
Br- Bromid-Ionen
BSA Bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise C1q Complement factor 1q C3a Complement factor 3a C3b Complement factor 3b
C3bi Instabilitätsprodukt aus C3b
C5a Complement factor 5a C5b Complement factor 5b
Ca 2+ ionisiertes Kalzium
ca. zirka
CD cluster of differentiation (System zur Bezeichnung zellulärer Differenzierungsantigene)
CFU-GEMM colony forming unit of granulocytes, erythrocytes, macrophages and megacaryocytes
CFU-GM colony forming unit of granulocytes and macrophages
CGD Chronic granulomatous disease, Chronische Granulomatose
CHS Chediak-Higashi-Syndrom
Cl- Chlorid-Ionen
CLAD canine Leucocyte adhesion deficiency, canine Leukozytenadhäsionsdefizienz
CR-3 Complement receptor 3 CRP C-reaktives Protein
CXC-Chemokin Cystein - Aminosäure X - Cystein - Chemokin CXCR-1 Cystein - Aminosäure X - Cystein-Rezeptor-1 CXCR-2 Cystein - Aminosäure X - Cystein-Rezeptor-2 d.h. das heisst
DCF Dichlorofluoreszein
DCFH Dichlorofluoreszin DCFH-DA Dihydrochlorofluoreszindiacetat
DHE Dihydroethidium DHR-123 Dihydrorhodamin-123 DNA Desoxyribonucleinacid
DSH Deutscher Schäferhund
ELAM-1 Endothelial-Leucocyte-Adhesion-Molecule-1, Endothel-Leukozyten-Adhäsions-Molekül-1 ENA-78 Epithelial-cell-derived-neutrophil-attractans-78,
von Epithelzellen stammendes Neutrophilen- Attraktanz-78
E-Selektin Endothelial-Selectin
FACS Fluorescence activated cell sorter (Fluoreszenz- aktiviertes Zellanalysegerät = Durchflusszytometer) FcR fragment crystalline- Receptor (Antikörperrezeptor) FITC Fluoresceinisothiocyanat
FL Fluoreszenzkanal im Durchflusszytometer g Gramm
GCP-2 Granulocyten-chemotaktisches-Protein-2
G-CSF Granulocyte–colony stimulating factor, Granulozyten- Kolonie-stimulierender Faktor
ggr. geringgradig
GM-CSF Granulocyte–makrophage–colony stimulating factor, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor
GSH Glutathion GSSG Glutathiondisulfid
H2O2 Wasserstoffperoxid
HBSS HANKS`balanced saline-Solution hgr. hochgradig
HIV Humane immundeficiency virus, humanes Immundefizienzvirus
IAP Integrin-Associated-Protein, Integrinassoziiertes Protein
ICAM-1 Intracellular-Adhesion-Molecule-1, Intrazelluläres Adhäsions-Molekül-1
IgG Immunglobulin G IgM Immunglobulin M
IL-1 Interleukin 1
IL-11 Interleukin 11
IL-2 Interleukin 2
IL-3 Interleukin 3
IL-6 Interleukin 6
IL-8 Interleukin 8
IL-9 Interleukin 9
J- Jodid-Ionen LAD I Leucocyte adhesion protein deficiency Typ I,
Leukozytenadhäsionsdefizienz Typ I
LFA-1 Leukozyten-funktionsassoziiertes-Antigen-1, CD11a/CD18
LY lucifer yellow (Luzifergelb)
m. männlich
MAC-1 Macrophage-receptor-1 oder CD11b/CD18 MG Molekulargewicht
Mg2+ ionisiertes Magnesium
mgr. mittelgradig
MIF-Puffer Membranimmunfluoreszenz-Puffer µ mikro
min Minute Mio Million MIP-2 Macrophage-inflammatory-protein-2 mg
ml
Milligramm Milliliter mmol
MNC
Millimol
mononuklear cells (mononukleäre Zellen) M
MW NADPH
Mol Mittelwert
Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat NAP-1 Neutrophilenaktivierendes Peptid 1
NAP-2 Neutrophilenaktivierendes Peptid-2 NAP-3 Neutrophilenaktivierendes Peptid-3 NAP-4 Neutrophilenaktivierendes Peptid-4 NBT-Test Nitroblautetrazolium-Test
nm
nops Nanometer (= 10-9 m) nicht opsonisierte Bakterien
1O2 Singulett-Sauerstoff
O2 molekularer Sauerstoff
O2.- Superoxidanion
OH. ops
Hydroxylradikal
opsonisierte Bakterien
PAF Plättchenaktivierender Faktor
PBS Phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung)
PC-red Polychromatin-red (Polychromatin-rot) PDGF Platelet derivated growth factor
PE Phycoerythrin
PECAM-1 Platelet/Endothelial-Cell-Adhesion-Molecule-1 oder CD 31
PF-4 Plättchenfaktor-4
PMA Phorbol-Myristat-Acetat
PMN Polymorphkernige neutrophile Granulozyten P-Selektin Platelet-Selectin
PSGL-1 P-Selektin-Glykoprotein-Ligand-1 R-123 Rhodamin-123
sec
Stabw. Sekunde
Standardabweichung Staph. Aureus Staphylokokkus aureus
Tab. Tabelle TNF Tumornekrosefaktor
TP3 To-Pro3 (Fluoreszenzfarbstoff)
u.a. unter anderem
usw. und so weiter
VE-Cadherine VK
Vascular Endothelial Cadherine Variationskoeffizient
VLA-4 Very-late-Antigen-4 oder CD49/CD29 w. weiblich
xg x Erdbeschleunigung
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
1 Einleitung
Die um die Jahrhundertwende von dem russischen Zoologen Elie Mechnikoff entdeckten polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (STICKLE 1996) sind ein wichtiger Bestandteil der unspezifischen Abwehr des Körpers. Sie schützen den Organismus vor schädigenden Einflüssen in Form von Mikroorganismen oder anderen Fremdkörpern, können jedoch auch geschädigte oder überalterte körpereigene Zellen erkennen und beseitigen. Sie tätigen somit gleichzeitig unerlässliche Abwehr- und Aufräumarbeiten. Eine Störung dieser Zellpopulation und ihrer Funktionen geht mit schweren, rezidivierenden Infektionen einher. Für klinische Aspekte ist es daher von grosser Bedeutung, Funktionsdefekte der neutrophilen Granulozyten mittels labortechnischer Verfahren aufzudecken. In der Humanmedizin wird seit Jahren die Durchflusszytometrie in der Diagnostik eingesetzt. Auch in der Tiermedizin sollte dieses moderne Verfahren vermehrt angewandt werden. Probleme bereiten allerdings starke Schwankungen der Messergebnisse bei gesunden Hunden, wodurch eine Unterscheidung zwischen gesunden und erkrankten Tieren bisher oft schwierig war. Die vorliegende Arbeit versucht Ursachen für diese Unregelmässigkeiten zu ergründen und, wenn möglich, zu beseitigen. Ziel ist eine Standardisierung geeigneter durchflusszytometrischer Verfahren für die quantitative Messung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und der Phagozytoseaktivität beim Hund.
2 Schrifttum
2.1 Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
2.1.1 Entwicklung und Morphologie
Die Blutbildung beginnt bei Hunden ab der dritten Woche des pränatalen Lebens.
Hauptbildungsorgane sind zu dieser Zeit Leber, Knochenmark und Milz. Postnatal bleibt die Haematopoese weitestgehend auf das Knochenmark beschränkt. Leber und Milz sind in ihrer Funktion als Blutbildungsorgane meist inaktiv, behalten jedoch weiterhin ihr Potential dazu (DA SILVA et al. 1994).
Das blutbildende Gewebe besteht in der Hauptsache aus den pluripotenten Stammzellen, den multipotenten Vorläuferzellen und den reifen Vertretern jeder Zellreihe. Die Bildungs- und Reifungszeit der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) im Knochenmark beträgt zwischen 8 und 14 Tagen (JÄGER 1989). Beim gesunden Menschen werden täglich ca. 1x1011 reife PMN aus dem Knochenmark ans Blut abgeben. Diese Zahl kann bei akuten, bakteriellen Infektionen um das 10-20fache gesteigert werden (JÄGER 1989).
Wie jede Blutzelle haben auch die neutrophilen Granulozyten ihren Ursprung in den pluripotenten Stammzellen des Knochenmarks (ROITT 1988; DA SILVA et al. 1994).
Diese werden frühembryonal gebildet und als sogenannte koloniebildende Einheit der Stammzellen bezeichnet. Sie haben die privilegierte Fähigkeit, ihr Dasein durch Replikation selbst zu erhalten (LICHTMAN 1983; KWON 1987; DA SILVA et al.
1994).
Haematopoetisch wirksame Faktoren regen die Stammzellen zur Replikation an. In erster Linie wären hier als koloniestimulierende Stoffe der vom Stroma des Knochenmarks gebildete Stammzellfaktor (SCF) und das Interleukin 3 (IL-3) zu nennen. Der SCF wirkt spezifisch auf die Teilung der pluripotenten Stammzellen ein, wogegen IL-3 nahezu alle haematopoetischen Vorläuferzellen einschliesslich der pluripotenten Stammzelle zur Teilung anregt (BAUER 1994). Interleukine werden von aktivierten Blutzellen vermehrt gebildet und abgegeben. Neben IL-3 wirken
Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 9 (IL-9), Interleukin 11 (IL-11) (DA SILVA et al. 1994) und Interleukin 2 (IL-2) (BAUER 1994) positiv auf die Stammzell-und Vorläuferzellreplikation ein.
Aus einem mitotischen Teilungsprozess entstehen zum einen die multipotenten, lymphatischen Vorläuferzellen als Ausgangspunkt der lymphozytären Zellreihe, zum anderen die für die Granulopoese weitaus wichtigeren multipotenten, myeloischen Vorläuferzellen. Diese sind Ursprung aller Zellen der myeloischen Linie wie Erythrozyten, Thrombozyten, Monozyten, eosinophilen, basophilen und neutrophilen Granulozyten (LICHTMAN 1983; DA SILVA et al. 1994; KRAFT et al. 1997) und werden deshalb auch colony forming unit of granulocytes, erythrocytes, macrophages and megacaryocytes (CFU-GEMM) genannt (DA SILVA et al. 1994).
Im Rahmen der Granulozytopoese entwickelt sich während der Vermehrungsphase im Knochenmark aus der myeloischen Vorläuferzelle durch mitotische Prozesse der Myeloblast. Dieser Zelltyp ist ca. 10-15µm gross und hat ein hohes Kern/Plasma- Verhältnis. Im Zytoplasma befinden sich reichlich Mitochondrien und freie Polysomen mit hydrolytischen und oxidativen Enzymen (DA SILVA et al. 1994). Der Myeloblast teilt sich in Vorläuferzellen für eosinophile und basophile Granulozyten und in die gemeinsamen Vorläuferzellen von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen, der colony forming unit of granulocytes and macrophages (CFU-GM). Diese nächste Zellstufe wird auch als Promyelozyt bezeichnet. Er ist mit 15-25µm der grösste Vertreter in der granulozytären Zellreihe (LIEBICH 1993; DA SILVA et al. 1994). Sein Zellkern ist von runder Gestalt und im Zytoplasma von zahlreichen peroxidase- positiven, d.h. azurophilen Granula umgeben. Über die erneute Zellteilung entsteht der neutrophile Myelozyt (KWON 1987; LIEBICH 1993; DA SILVA et al. 1994;
KRAFT et al. 1997). Hierbei kommt es zur Differenzierung in peroxidase-positive, azurophile Granula und die kleineren, peroxidase-negativen, „spezifischen“ Granula.
Die Zelle ist ca. 10µm gross, hat einen gezackten Zellkern und einen sekretorisch aktiven, prominenten Golgiapparat (DA SILVA et al. 1994). Der Myelozyt ist der letzte zur mitotischen Teilung fähige Vertreter der Granulozytopoese. Dessen Nachkomme ist der Metamyelozyt. Im Entwicklungsprozess der neutrophilen Granulozyten ist jetzt die Reifungsphase im Knochenmark erreicht. Ab diesem
Zeitpunkt sind die Zellen im Notfall zur Phagozytoseaktivität fähig (KWON 1987), d.h.
die Nachkommen der Vorläuferzellen erlangen die Fähigkeit zu spezifischen Funktionen, verlieren gleichzeitig jedoch die Möglichkeit zur Replikation (DA SILVA et al. 1994). Ein Drittel der Zellen im Knochenmark gehört zum aktiven, sich teilenden Pool, die Granulopoese betreffend sind das Myeloblasten, Promyelozyten und Myelozyten. Zwei Drittel gehören zum maturen, sich nicht teilenden Pool (DA SILVA et al. 1994). Der Metamyelozyt hat einen sekretorisch inaktiven Golgiapparat.
Im Zytoplasma befinden sich gemischte Granulapopulationen, Ansammlungen von Glykogenpartikeln und wenige Mitochondrien. Während der Reifung verändert sich das Aussehen des Zellkerns und die Zellgrösse nimmt kontinuierlich ab (LIEBICH 1993). Der Gestalt des Kerns entsprechend werden die nachfolgenden Generationen auch benannt. Man unterscheidet den stabkernigen neutrophilen Granulozyten als jugendliche Form und den segmentkernigen neutrophilen Granulozyten als reifen Vertreter der Granulopoese. Als segmentkerniger neutrophiler Granulozyt ist die Funktionsphase erreicht und die Zellen sind bereit ins Blut abgegeben zu werden, um von dort aus ihre Aufgaben wahrzunehmen (DA SILVA et al. 1994; KRAFT et al.
1997). Eine positive Wirkung auf die Ausdifferenzierung und Reifung der Granulozyten haben die haematopoetisch wirksamen Faktoren Granulocyte–
makrophage–colony stimulating factor (GM-CSF) und Granulocyte–colony stimulating factor (G-CSF) (TILL u. THIELMANN 1989; BAUER 1994; DA SILVA et al. 1994), gebildet u.a. von aktivierten Granulozyten und Makrophagen, unterstützt von IL-3 und IL-6 (BAUER 1994). Die Abgabe der reifen Granulozyten aus dem Knochenmark ins Blut erfolgt mehr oder weniger über einen sogenannten Pipeline- Mechanismus, d.h. die älteren, reiferen Zellen verlassen dieses zuerst (DA SILVA et al. 1994). Bei Mensch, Hund, Katze und Pferd sind die neutrophilen Granulozyten die mengenmässig grösste Fraktion der weissen Blutzellen (DA SILVA et al. 1994;
KRAFT et al. 1997). Man spricht daher auch von einem granulozytären Blutbild.
Zellform Hund Katze Pferd Mensch
% % % % %
stabkernige Granulozyten segmentkernige
Granulozyten Lymphozyten Monozyten
eosinophile Granulozyten basophile Granulozyten
0-4 55-75
12-30 0-4 0-6 bis 1
0-4 60-78
15-38 0-4 0-6 bis 1
0-6 45-70
20-45 0-5 0-4 0-2
3-5 50-70
25-40 2-6 2-4 0-1 absolute Zellzahl / µl / µl / µl / µl stabkernige Granulozyten
segmentkernige Granulozyten Lymphozyten Monozyten
eosinophile Granulozyten basophile Granulozyten
0-500 3000-9000
1000-3600 40-500 40-600 bis 40
0-600 3000- 11000 1000-4000
40-500 40-600 bis 40
0-600 3000-7000
1500-4000 40-400 40-350 0-150
120-450 2000-6300
1000-3600 80-540 80-360 bis 90
Tab. 2.1 Differenzialblutbild (Roche Lexikon Medizin 1991; KRAFT et al. 1997)
Im Blut halten sich die Granulozyten abhängig von der Fliessgeschwindigkeit in marginalen Randgebieten der Gefässe oder im zentralen Blutstrom auf. Man unterscheidet daher den marginalen und zentralen Leukozytenpool. Durch eine Blutuntersuchung werden jedoch nur die sich im fliessenden Blut befindlichen Zellen erfasst. Eine Blutdruckerhöhung z.B. kann durch vermehrtes Abspülen der an den Gefässwänden haftenden Granulozyten zu einer Erhöhung der Zellzahl im fliessenden Zentralpool führen. Das Blutbild wird somit durch alle den Blutdruck beeinflussende Faktoren, wie z.B. Stress, Hitze usw. geprägt und ist daher immer kritisch zu betrachten (KRAFT et al. 1997). Das Blutbild des Hundes wird als
besonders empfindlich beschrieben (KRAFT et al. 1997). Die Aufenthaltsdauer der PMN im Blut beträgt normalerweise ca. 6-12 Stunden (KWON 1987), danach kommt es zu einer vom Bedarf abhängigen Abwanderung ins Gewebe. Dort überleben die Zellen je nach Beanspruchung noch ca. 2-4 Tage. Im Rahmen einer Entzündung kommt es zu einem erhöhten Verbrauch der zirkulierenden Reserven im peripheren Blut. Dies führt zur forcierten Freisetzung der Granulozyten aus dem Knochenmark.
Das von aktivierten Abwehrzellen gebildete Interleukin 1 (IL-1) fördert die rasche Bereitstellung der Granulozyten im Blut (TILL u. THIELMANN 1989; DA SILVA et al.
1994). Dabei kann es auch zum Übertritt unreifer Formen ins Blut kommen. Das Auftreten von jugendlichen, unreifen Zellformen im Blut wird als Linksverschiebung im weissen Blutbild beschrieben. Bei Bedarf kann die Entwicklungszeit vom Myeloblasten zur reifen Blutzelle von normal 96-144 Stunden auf 48 Stunden verkürzt werden (DA SILVA et al. 1994).
2.1.2 Aufgaben und Funktion der PMN im Rahmen der Infektionsabwehr
2.1.2.1 Aufgaben
Die neutrophilen Granulozyten dienen im Rahmen der Immunabwehr der Bekämpfung von Infektionserregern und anderen entzündungsauslösenden Noxen (DA SILVA et al. 1994). Aus dem Blut wandern sie durch amöboide Bewegung vornehmlich in Regionen, welche stark den Angriffen durch Mikroorganismen oder Fremdstoffen von aussen ausgesetzt sind, wie Haut und Schleimhäute von Respirationstrakt, Magen-Darm-Trakt, Harn- und Reproduktionstrakt und Augen und schützen den Organismus dort durch ihre Abwehrtätigkeit vor diesen Eindringlingen (DA SILVA et al. 1994). PMN gehören zum unspezifischen zellulären Teil des Immunsystems, d.h. sie verfügen über kein immunologisches Gedächtnis und haben keine spezifischen Erkennungsmechanismen (KWON 1987). Sie sind neben allgemein regulierenden Funktionen darauf programmiert, körperfremde Stoffe zu
entfernen und beteiligen sich an der Produktion von humoralen Komponenten des Immunsystems, wie den lysosomalen Enzymen und Zytokinen. Nach Anheftung und Aufnahme der Fremdstoffe ins Zellinnere, vermittelt u.a. durch Komplementfaktoren, kommt es zu einer intrazellulären Inaktivierung mit Hilfe von lysosomalen Enzymen und anderen Metaboliten (KWON 1987). Ein Teil der lysierenden Enzyme kann nach Abgabe auch extrazellulär wirken (KWON 1987).
Eine Abnahme der Verfügbarkeit und eine reduzierte Funktionsfähigkeit der neutrophilen Granulozyten ist vergesellschaftet mit einer abnehmenden Immunkompetenz und einer ansteigenden Zahl von den Körper heimsuchenden Infektionen (DA SILVA et al. 1994).
2.1.2.2 Aktivierung und Chemotaxis der PMN
Der ruhende neutrophile Granulozyt weist eine kugelige Zellform auf und befindet sich meist im fliessenden Blut. Sein oxidativer Stoffwechsel dient zur Aufrechterhaltung der Zellfunktion (JÄGER 1989). Durch verschiedene chemotaktische Substanzen werden die PMN aktiviert. Hierfür sind neben Komplementfaktoren die CXC-Chemokine von grosser Bedeutung. Bei diesen Stoffen werden zwei Cysteinanteile (C) durch eine andere Aminosäure (X) getrennt.
Einige wichtige Vertreter dieser Gruppe sind das Macrophage-inflammatory-protein-2 (MIP-2) (ROVAI et al. 1998; BAJT et al. 2001), Granulocyte-chemotactic-protein-2 (GCP-2) (WILLIAMS et al. 1999), Epithelial-cell-derived-neutrophil-attractans-78 (ENA-78) (WILLIAMS et al. 1999), das Neutrophilenaktivierende-Peptid-1 (NAP-1), -2 (NAP-2), -3 (NAP-3) und – 4 (NAP-4) (BAGGIOLINI 2001). Ihre Wirkung können sie über die Rezeptoren CXCR-1und CXCR-2 an der Oberfläche der PMN ausüben (WILLIAMS et al. 1999). Zur Gruppe der effektiver aktivierend wirkenden Cytokine zählen u.a. einige Interleukine, z.B. IL-1 und IL-8 (BAJT et al. 2001; ETHUIN et al.
2001), der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) (AHMED et al. 1996; ROVAI et al. 1998;
BAJT et al. 2001), Leukotrien B4 (BAUER 1994), Prostaglandine (BAUER 1994), der Plättchenaktivierende Faktor (PAF), Platelet derived growth factor (PDGF) und
Plättchenfaktor-4 (PF-4) (BAUER 1994). Die genannten Mediatoren werden als Folge einwirkender Traumata entweder von geschädigten Endothelzellen oder von bereits aktivierten Entzündungszellen selbst produziert und freigesetzt. Auch können Komplementkomponenten, ihrerseits aktiviert durch Lipopolysaccharide, Zelltrümmer von Bakterien oder Ähnlichem, stimulierend auf die neutrophilen Granulozyten wirken. Zu nennen wären hier im einzelnen die Komplementfaktoren C3a und C5a (ROITT 1988; BAUER 1994). Infolge der Bindung solcher aktivierenden Stoffe an spezifische Rezeptoren (WILLIAMS et al. 1999) kommt es an der Oberfläche der neutrophilen Granulozyten zu einer vermehrten Expression von L-Selektin (JAGELS et al. 1995; AHMED et al. 1996; BAJT et al. 2001) und von Integrinen, die für die Adhärenz entscheidend sind. Ein Teil der granulozytenaktivierenden Substanzen wird auch Chemotaxine genannt, weil diese die PMN dazu veranlassen sich im Gewebe entgegen des Konzentrationsgefälles dieser Stoffe zum Entzündungsgeschehen hin zu bewegen. Man nennt diesen Vorgang auch Chemotaxis, die im Gegensatz zur Chemokinesis eine zielgerichtete Bewegung auf einen chemischen Reiz hin ist (KWON 1987). Es kommt zur bipolaren Ausrichtung der Zelle und Ausbildung von Pseudopodien. Die Granulozyten sind somit zur amöboiden Bewegung befähigt (TILL u. THIELMANN 1989). Bevor sich die PMN jedoch im Gewebe selbst fortbewegen können, müssen sie erst die Blutbahn an geeigneter Stelle nah des Entzündungsgeschehens verlassen. Hierfür ist die im folgenden Abschnitt besprochene Adhärenz an den Endothelzellen von grosser Bedeutung.
2.1.2.3 Adhärenz der PMN an den Endothelzellen der Gefässe
Durch die oben beschriebenen Mediatoren wie z.B. Prostaglandine, C5a u.a. kommt es im Entzündungsgebiet zu einer Erweiterung der Blutgefässe, was zu einer Verlangsamung des Blutstromes führt (ROITT 1988). Unter diesen Bedingungen gelangen die im zentralen Blutstrom schwimmenden Granulozyten leichter zu den Randgebieten der Gefässe, man nennt diesen Vorgang auch Margination (TILL u.
THIELMANN 1989). Erst jetzt wird ein Kontakt zwischen Endothelzelle und PMN überhaupt möglich. Die eigentliche Adhäsion erfolgt in fünf aufeinanderfolgenden Schritten, wobei alle fünf notwendig sind für ein effektives Zusammenziehen der Leukozyten im Entzündungsgebiet. Die fünf Komponenten sollen an dieser Stelle nur kurz aufgezählt werden, eine genaue Beschreibung der Vorgänge folgt im nachstehenden Text. 1. „Capture“, 2. „Rolling“, 3. „Slow Rolling“, 4. „Firm Adhesion“
und abschliessend 5. „Transmigration“. Die Abfolge der Einzelvorgänge wird auch als Leukozytenadhäsionskaskade bezeichnet (LEY u. BROOKE 2000).
Abb. 2.1 Leukozytenadhäsionskaskade (LEY u. BROOKE 2000)
Wie erwähnt steht an erster Stelle das sogenannte „Capture“, das lose Einfangen der neutrophilen Granulozyten. Es beschreibt den ersten echten Kontakt der PMN mit dem aktivierten Endothel. Eine entscheidende Rolle hierbei spielen Selektine. Das sind Ca 2+-abhängige Transmembranmoleküle, die entweder auf der Oberfläche von Leukozyten oder von aktivierten Endothelzellen exprimiert werden.
Abb. 2.2 Selektinstruktur (LEY u. BROOKE 2000)
Selektine besitzen eine N-terminale extrazelluläre Struktur homolog zu Ca-abhängigem Lectin, gefolgt von einer Einheit ähnlich dem epidermal growth factor (EGF) und 2-9 Sequenzen ähnlich den in complement regulatory proteins gefundenen consensus repeats (CR).
Der grösste und bedeutendste Vertreter der Familie ist das P-Selektin. Es wird bei stimulierenden Traumata durch C5a, LTB4 und Histamin aktiviert und innerhalb von wenigen Minuten auf Endothelzellen exprimiert. Es kann an den auf Granulozyten sitzenden P-Selektin-Glykoprotein-Liganden-1 (PSGL-1) binden. P-Selektin wird bis zur Aktivierung in spezifischen Granula, den sogenannten Weibel-Palade- Körperchen, in den Endothelzellen gespeichert (LEY u. BROOKE 2000). Unterstützt wird das P-Selektin durch das auf PMN exprimierte L-Selektin. Dessen Aufregulierung wird vor allem durch das Cytokin TNF-α induziert. Es ist das kleinste bekannte Selektin und kommt auf fast allen Leukozyten vor. Seine Bindungsstelle am Endothel ist bislang nicht bekannt (LEY u. BROOKE 2000).
Gefolgt wird das Capture vom sogenannten „Rolling“. Durch die Selektine vermittelt kommt es zu einem „Abbremsen“ der Granulozyten am Endothel. Die Zellen „rollen“
an den Endothelzellen entlang. Es kommt an der Frontseite der Zelle zur Ausbildung neuer, reversibler Adhärenzen, wobei gleichzeitig die Anheftung am Ende der Zelle wieder gelöst wird. Auch beim „Rolling“ ist das P-Selektin hauptverantwortlich (NORMAN et al. 1995; LEY u. BROOKE 2000) und wird von L-Selektin unterstützt (LEY u. BROOKE 2000). Sobald Geschwindigkeiten unter 5µm/sec erreicht werden, spricht man vom „Slow Rolling“. Eine entscheidende Funktion hierbei hat das E- Selektin auch ELAM-1 (Endothelial-Leukocyte-Adhesion-Molecule-1) genannt. Es wird wie das P-Selektin auf Endothelzellen exprimiert, aber erst Stunden nach der erfolgten Aktivierung durch Mediatoren wie z.B. TNF-α (FRANK 2000; LEY u.
BROOKE 2000). Durch die extrem langsamen Geschwindigkeiten kann es anschliessend zur Ausbildung einer „Firm Adhesion“ oder festen Adhärenz kommen.
Studien haben gezeigt, dass bei Fehlen von E-Selektin kaum festhaftende Leukozyten nachzuweisen sind, was wahrscheinlich auf die zu hohen Geschwindigkeiten beim „Rolling“ ohne die Einwirkung von E-Selektin zurückzuführen ist (LEY u. BROOKE 2000). Während des immer langsamer werdenden Rollvorgangs kommt es in den Granulozyten zu einem intrazellulären Anstieg des freien Kalziums. Es scheint, als würden die PMN zunehmend aktiviert werden. Unter Einfluss des Interleukin 8 und anderer Stimulantien kommt es zu einer Konformitätsänderung der Oberflächenantigene der Granulozyten. Neben L-Selektin spielen bei der jetzt folgenden festen Adhärenz die Leukozytenintegrine LFA-1 (Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen) bzw. MAC-1 (Macrophage-receptor-1) eine wichtige Rolle. Integrine sind heterodimere Transmembranglykoproteine, die aus einer grossen α-Kette und einer kleineren ß-Kette bestehen. Bei den beiden genannten Vertretern handelt es sich um sogenannte ß2-Integrine. Das heisst, ihre ß- Kette ist in diesem Fall jeweils ß2 , auch CD18 genannt. Sie variieren nur in ihren α- Ketten (LEY u. BROOKE 2000). LFA-1 entspricht dem Glykoprotein CD11a/CD18, wogegen MAC-1 auch als CD11b/CD18 bezeichnet wird (TILL u. THIELMANN 1989;
TROWALD-WIGH et al. 1993; LEY u. BROOKE 2000).
Abb. 2.3 ß2-Integrinstruktur (LEY u. BROOKE 2000)
Da MAC-1 zusätzlich eine wichtige Aufgabe bei der opsonisierenden Adhärenz inne hat und als Rezeptor für den Komplementfaktor C3bi fungiert, wird auch häufig vom Complement-Receptor-3 (CR-3) gesprochen (TROWALD-WIGH et al. 1993). Neben den genannten α-Ketten CD11a und CD11b der ß2-Integrine sind weiterhin CD11c (TROWALD-WIGH et al. 1993; LEY u. BROOKE 2000) und CD11d bekannt (LEY u.
BROOKE 2000). Die Funktion der letzten beiden im Zusammenhang mit der Adhärenz der Zellen ist noch nicht geklärt. Ein bekanntes ß1-Integrin ist das Very- late-Antigen-4 (VLA-4) (CD49/CD29). Es ist vor allem für die Adhärenz von Lymphozyten am Gefässendothel verantwortlich und spielt bei den Granulozyten eine kleinere Rolle (LEY u. BROOKE 2000). Die Integrine enthalten Bindungsstellen für bivalente Ionen wie Ca2+ und Mg2+, deren Einfluss für die adhäsive Funktion der Glykoproteine notwendig ist. Lokalisiert ist das LFA-1-Glykoprotein nur in der Plasmamembran, wogegen das MAC-1-Glykoprotein auch in höherer Dichte in Membranen der intrazellulären, sekundären Granula vorkommt. Nach Stimulierung kommt es zu einem Transport der MAC-1-haltigen Granula an die Oberfläche, zur Verschmelzung mit der Zellmembran und somit zu einer Aufregulierung der Rezeptoren (LEY u. BROOKE 2000), was zu einer Oberflächenvergrösserung der Zelle um 25% und zu einer gesteigerten Adhäsionsfähigkeit führt (TILL u.
THIELMANN 1989). Dem Oberflächenantigen MAC-1 kommt eine entscheidendere Rolle bei der Neutrophilenaktivierung und Phagozytose zu als bei der Adhärenz an
Mg2+
ß
2α α α α
α α α α
ß
2LFA-1
MAC-1
den Gefässwänden. Hierbei hauptverantwortliches Integrin ist vor allem das LFA-1 unterstützt vom L-Selektin der Granulozyten. Die Integrine binden an extrazelluläre Matrixproteine der Basalmembran der Gefässwände oder an entsprechende Liganden anderer Zellen und führen somit zur festen Adhäsion (LEY u. BROOKE 2000). Der letzte Schritt der Adhärenzkaskade ist die Transmigration der Granulozyten.
2.1.2.4 Transmigration der PMN ins Gewebe
Das durch Cytokine, wie z.B. IL-1 oder TNF-α, aktivierte Endothel und der durch Ansammlung von chemotaktisch wirkenden Substanzen, wie z.B. IL-8, am Entzündungsort entstandene Gradient sind wichtige Voraussetzungen für eine effektive Emigration der neutrophilen Granulozyten aus den Blutgefässen ins Gewebe (FURIE u. MCHUGH 1989; SMITH et al. 1991; SMITH et al. 1994). Die Stimulation der Endothelzellen führt am Übergang von einer Endothelzelle zur nächsten zu einer gesteigerten Exprimierung von PECAM-1 (Platelet/Endothelial- Cell-Adhesion-Molecule-1 oder CD31), einem spezifischen Adhäsionsmolekül, welches auch auf vielen Leukozyten vorkommt (MULLER 1995). Es führt über meist homophile Bindung zu PECAM-1-Molekülen der Entzündungszellen zu einer Anheftung der PMN genau über den Zell-Zell-Verbindungen des Endothels (MULLER et al. 1993; PIALI et al. 1995) und vermittelt im weiteren die Transmigration der neutrophilen Granulozyten durch die Gefässwand (VAPORCIYAN et al. 1993).
Unterstützt wird PECAM-1 durch das ebenfalls auf Endothelzellen gezeigte ICAM- 1(Intercellular-Adhesion-Molecule-1) (LUSCINSKAS et al. 1991; BULLARD et al.
1995) und dem ELAM-1 oder E-Selektin (LUSCINSKAS et al. 1991). ICAM-1 dient als Ligand für die auf PMN exprimierten ß2-Integrine (FURIE et al. 1991; ALLPORT et al. 1997). Die Verbindungen zwischen den Endothelzellen werden in Ruhezeiten hauptsächlich durch homophile VE-Cadherine (Vascular Endothelial Cadherine)- Komplexe aufrechterhalten (LAMPUGNANI et al. 1992; GOTSCH et al. 1997). Diese
gehören ebenfalls zur Familie der Adhäsionsmoleküle und sind essentiell für die Funktionalität der Endothelbarriere (GOTSCH et al. 1997). Durch das Anheften der PMN an den beschriebenen Adhäsionsmolekülen wird das sich anschliessende Zerreissen der VE-Cadherin-Komplexe induziert, wodurch es zu einem Verlust der Zell-zu-Zell-Verbindungen kommt (ALLPORT et al. 1997). Die Basalmembran wird unter Einfluss proteolytischer Enzyme für die PMN passierbar (TILL u. THIELMANN 1989; FRANK 2000). Beim Kontakt des an der Phagozytenoberfläche sitzenden LRI (Leukocyte-Response-Integrin) mit dem Basalmembranprotein Eutactin kommt es zur weiteren Aktivierung der Granulozyten (ZHOU u. BROWN 1993). Das mit LRI vergesellschaftete IAP (Integrin-Associated-Protein) fungiert als Ca2+-Kanal (SCHWARTZ et al. 1993). Bei Kontakt erfolgt ein starker intrazellulärer Ca2+-Anstieg.
Die PMN zeigen eine erhöhte Phagozytoseaktivität und einen gesteigerten O2- Stoffwechsel (BROWN et al. 1990; SCHWARTZ et al. 1993; LINDBERG et al. 1994).
Im Gewebe bewegen sich die PMN durch Verformung ihres Zytoskeletts (BOKOCH 1995) mittels Pseudopodien in Richtung der chemotaktischen Stoffe hin zum Entzündungsgebiet, wo sie ihrer eigentlichen Abwehraufgabe, nämlich der Eliminierung von Eindringlingen, nachkommen.
2.1.2.5 Phagozytose durch neutrophile Granulozyten
Die neutrophilen Granulozyten wandern solange im Gewebe gegen Konzentrationsgradienten chemotaktischer Faktoren, bis sie die durch Komplementfaktoren opsonisierten Mikroorganismen und damit den Kern des Entzündungsgeschehens erreichen (ROITT 1988). Das an der Kennzeichnung der Erreger beteiligte Komplementsystem wird meist über den sogenannten alternativen Weg aktiviert. Hierbei kommt es direkt zur Spaltung des C3-Faktors in einen kleineren Anteil C3a und den mengenmässig grösseren Teil C3b, welcher sich wegen seiner Instabilität schnell zu C3bi wandelt (TROWALD-WIGH et al. 1993).
Das agierende Enzym C3-Konvertase bindet an der Oberfläche vieler Bakterien, so dass dort grosse Mengen von C3b und C3bi entstehen. Es kommt zu einer
Komplexbildung zwischen C3b und dem weiteren Komplementfaktor C5. Der instabile C5-Komplementfaktor wird zu C5a und C5b gespalten. C3a und C5a fungieren als effektive Chemotaxine und führen ausserdem zu einem erhöhten O2- Stoffwechsel in den PMN, dem sogenannten Respiratory Burst (ROITT 1988; TILL u.
THIELMANN 1989). C3b, C3bi und C5b verbleiben an der Bakterienmembran und bilden zum einen zusammen mit anderen Komplementfaktoren einen Membranangriffskomplex (ROITT 1988; BAUER 1994), welcher zur Lyse der Bakterienzellwand führen kann. Andererseits wirken sie als sogenannte Opsonine und erleichtern somit die Phagozytose durch die Entzündungszellen. Der klassische Weg der Komplementkaskade beginnt mit der Aktivierung des Komplementfaktors C1q durch Immunkomplexe von IgG und Mikroorganismen. Über die Aktivierung verschiedener Faktoren mündet dieser Weg auch in der Spaltung des Faktor C3 und verläuft dann weiter wie der alternative Weg (ROITT 1988; BAUER 1994). Das durch IL1-Einfluss vermehrt in der Leber produzierte CRP (C-reaktives Protein), welches zur Familie der akute Phase-Proteine gezählt wird, bindet an der Oberfläche zahlreicher Bakterien und Pilze (ROITT 1988; TILL u. THIELMANN 1989; BAUER 1994). Dies führt wiederum zu einer verstärkten Bindung von Komplement und ist somit phagozytosefördernd (TILL u. THIELMANN 1989). Die Anlagerung der PMN an opsonisierende Komplementfaktoren oder Antikörper erfolgt durch spezifische C3b- (CR1), C3bi- (CR3 oder MAC-1 oder CD11b/CD18) (ARNAOUT 1990b; TROWALD- WIGH et al. 1993; BAUER 1994) und Fc-Rezeptoren (FcχRII, FcχRIII) der Phagozytenmembran (TROWALD-WIGH et al. 1993; BAUER 1994) und macht die nachfolgende Aufnahme der Erreger erst möglich. Man spricht von einer opsonisierenden Adhärenz (FELLENBERG VON 1978). Bei der sogenannten Internalisierung wird der Fremdstoff von Ausläufern der Plasmamembran vollständig umschlossen. Die sich nach innen einstülpenden Vesikel werden Phagosomen genannt (KWON 1987; TILL u. THIELMANN 1989; BAUER 1994) und schnüren sich bald vollständig von der Plasmamembran ab. Im Zellinneren verschmelzen sie mit den zytoplasmatischen Lysosomen, die als Granula der PMN viele verschiedene zytotoxische Enzyme enthalten. Bei der Bildung von Phagolysosomen werden die aufgenommenen Mikroorganismen diesen bakteriziden Mechanismen ausgeliefert
(ROITT 1988; TILL u. THIELMANN 1989; BAUER 1994). Im weiteren kommt es durch sauerstoffabhängige und sauerstoffunabhängige Vorgänge zur Abtötung der aufgenommenen Organismen.
2.1.2.6 Abtötung der phagozytierten Organismen
2.1.2.6.1 Sauerstoffabhängige Mechanismen
Die Erhöhung des respiratory burst (extramitochondraler Sauerstoffmetabolismus) wird durch Kontakt der Plasmamembran mit Komplementfaktoren, Immunkomplexen und ähnlichem induziert (KWON 1987; TILL u. THIELMANN 1989). Es kommt zu einer Aktivitätszunahme der plasmamembranständigen NADPH-Oxidase, dem Schlüsselenzym der Sauerstoffradikalbildung (KWON 1987; TILL u. THIELMANN 1989). Diese Flavinoxidase katalysiert die Reduktion von molekularem O2 zum Superoxidanion O2.- in Gegenwart des Reduktionsäquivalents NADPH (ZABUCCHI et al. 1980; KWON 1987; TILL u. THIELMANN 1989). Das Superoxidanion diffundiert in die Phagolysosomen und wird dort spontan unter Einwirkung des sauren Milieus zu Wasserstoffperoxid H2O2 reduziert. Aus H2O2 und O2.- entstehen in der sogenannten Haber-Weiss-Reaktion Singulett-Sauerstoff 1O2 und Hydroxylradikale OH. (KWON 1987; ROITT 1988; TILL u. THIELMANN 1989). Es handelt sich bei diesen um hochreaktive, keimtötende Agentien, die Enzyme oder Membranbestandteile oxidieren und somit funktionell inaktivieren können (KLEBANOFF 1980; KWON 1987). Unter Einfluss der lysosomalen Myeloperoxidase bilden H2O2 und Halogenionen wie Cl-, J- oder Br- ein stark antimikrobiell wirkendes Halogenierungssystem. Die entstehenden Halogensäuren führen zu einer Halogenierung und damit zur Schädigung der Membranen des aufgenommenen Materials (KWON 1987; ROITT 1988; TILL u. THIELMANN 1989). Desweiteren katalysiert die Myeloperoxidase durch H2O2 induzierte oxidative Decarboxylierung und Abspaltung membranständiger Aminosäuren und Peptide (KWON 1987; TILL u.
THIELMANN 1989). Die entstehenden O2-Metaboliten haben alle ein stark zytotoxisches Potential. Um die körpereigenen Zellen vor einer Entgleisung zu schützen, werden im umgebenden Zytoplasma reduzierende Stoffwechselwege mit dem Ziel der Entgiftung von O2.- und H2O2 aktiviert. Beteiligt sind die Superoxiddismutase, die Katalase und das Glutathionperoxidase- Glutathionreduktase-System (Glutathion (GSH) – Glutathiondisulfid (GSSG)-System) (KWON 1987; TILL u. THIELMANN 1989).
Superoxid-
Dismutase Katalase
2O2.- 2 H2O2 O2 Peroxidase 2 H2O
2 O2 2GSH GSSG
--- Membranoxidase 2 NADPH 2 NADP
Glutathionreductase
2 NADP Hexosemono- 2 NADPH
phosphatweg
Plasmamembran
Abb. 2.4 Schematische Darstellung der Bildung reaktiver Sauerstoffmetaboliten und deren Entgiftung nach TILL u. THIELMANN (1989)
Phagosom
2O2.-
2 H2O2
O2
ClO- Cl-
Halogenierung
R-COOH R-C=O
2 OH.
1O2
OH
H+
Peroxidation
Myeloperoxidasesystem
bewirkt bewirken
bewirkt
R-CHNH2-COOH R-C=O ׀
H
CO2
NH3
2H2O
2.1.2.6.2 Sauerstoffunabhängige Mechanismen
Die Granulozyten enthalten in ihren primären und sekundären Granula spezifische, bakterizid wirkende Proteine (ROITT 1988; FRANK 2000). Beim Kontakt mit einem Antigen kommt es, wie bereits beschrieben, zur Verschmelzung mit dem Phagosom und zur Verschmelzung mit der Plasmamembran mit nachfolgender Abgabe von lysosomalen Wirkstoffen in die Zellumgebung (Degranulation der Zelle) (JÄGER 1989).
azurophile (primäre) Granula :
- mikrobizide Enzyme :
Myeloperoxidase Lysozym
kationische Proteine - neutrale Proteasen:
Elastase
Kollagenase Kathepsin G - Metalloproteasen
- saure Hydrolasen:
N-Acetyl-ß-Glukosaminidase ß-Glukuronidase
saure ß-Glycerophosphatase ß-Galaktosidase
α-Mannosidase Kathepsin B,D,E 5-Nukleosidase Arylsulfatase
saure Mukopolysaccharidase
- andere :
Phospholipase A
C5a-Inaktivator spezifische (sekundäre) Granula :
- mikrobizide Enzyme :
Lysozym - Metalloproteasen
- andere : Laktoferrin
Vit. B12- bindendes Protein Cytochrom
Histaminase C3bi-Rezeptor
Abb. 2.5 Inhaltsstoffe der Granula neutrophiler Granulozyten (KWON 1987)
Bei dem mengenmässig überwiegenden Lysozym handelt es sich um eine Muramidase. Hydrolyse glykosilierter Verbindungen von Acetylmuraminsäure und Acetylglukosamin führt zu einer letalen Schädigung der bakteriellen Zellwand (KWON 1987; ROITT 1988) und nachfolgendem Platzen der Bakterien (TILL u.
THIELMANN 1989). Laktoferrin, ebenfalls in Granula der PMN enthalten, entzieht den Bakterien das für das Wachstum essentielle Eisen durch Chelatbildung. Die kationischen Proteine binden an saure Gruppen gram negativer Bakterien und zerstören diese durch strukturelle Veränderung der äusseren phospholipidhaltigen Zellmembran (KWON 1987; TILL u. THIELMANN 1989). In Phagolysosomen abgetötete Organismen werden durch die lysosomalen Hydrolasen verdaut und deren Abbauprodukte in den Extrazellularraum abgegeben, was zu einer Aufrechterhaltung des Entzündungsgeschehens führt. Bei der Degranulation werden auch von PMN gebildete chemotaktisch wirkende Stoffe wie z.B. TNF-α oder IL-8 an die Umgebung abgegeben, was durch Anlockung weiterer Entzündungszellen eine Verstärkung der Entzündungsreaktion bewirken soll. Bei der sogenannten Entspeicherung gehen die aktivierten PMN schnell zugrunde. Die angelockten, längerlebigen Makrophagen und die Zellen der spezifischen Immunabwehr übernehmen weitere Aufgaben.
2.2 Krankheitsbilder mit PMN-Dysfunktion
2.2.1 Leucocyte adhesion protein deficiency Typ I (LAD I)
Bei dieser autosomal oder x-chromosomal rezessiv vererbten Erkrankung (GIGER et al. 1987; TROWALD-WIGH et al. 1993) kommt es zu einer verminderten oder sogar vollkommen ausbleibenden Exprimierung von Oberflächenantigenen der ß2- Integrinfamilie, wie LFA-1 und MAC-1. Verursacht wird der genetische Defekt durch Punktmutation in der Codierungsregion ITGB2 von CD18, also der ß-Untereinheit der Integrine (ARNAOUT et al. 1990; KIJAS et al. 1999). Der Typ I dieser Erbkrankheit ist bisher bei Mensch (ARNAOUT et al. 1985; ARNAOUT et al. 1990; ARNAOUT 1990a), Rind (BLAD) (MULLER et al. 1994; GERARDI 1996; MEYLAN et al. 1997) und Hund (CLAD) (GIGER et al. 1987; TROWALD-WIGH et al. 1992; TROWALD- WIGH et al. 1993; KIJAS et al. 1999; TROWALD-WIGH et al. 2000) beschrieben. Die von CLAD vornehmlich betroffene Hunderasse ist der Irish Setter (STICKLE 1996;
KIJAS et al. 1999). Es wurden DNA-Tests entwickelt, um heterozygote Trägertiere dieser Rasse von der Zucht auszuschliessen. Die homozygot betroffenen Individuen zeigen wiederkehrende bakterielle Infektionen an Körperoberflächen wie Haut, Gingiva, oberer Respirationstrakt und den Schleimhäuten des Magen-Darmtraktes (TROWALD-WIGH et al. 1992; MULLER et al. 1994; MEYLAN et al. 1997;
TROWALD-WIGH et al. 2000), die nach wenigen Lebensmonaten letal enden können. Durch die Störung der Integrine sind alle adhäsionsabhängigen Funktionen der PMN wie die Adhärenz an den Gefässwänden, die Migration, die Chemotaxis und die Aggregation betroffen (GIGER et al. 1987; TROWALD-WIGH et al. 1993). Da MAC-1 zusätzlich als Rezeptor für C3bi fungiert, ist die komplementvermittelte Phagozytose eingedrungener Mikroorganismen ebenfalls stark eingeschränkt (GIGER et al. 1987; TROWALD-WIGH et al. 1993; STICKLE 1996). TROWALD- WIGH (1993) stellte fest, dass der Defekt der Integrinfunktion beim Hund vergesellschaftet ist mit einer verminderten Exprimierung des Fc-Rezeptors III (CD16) und somit auch zum Unvermögen einer IgG-vermittelten Phagozytose führen
kann. Die Fähigkeit zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies dagegen bleibt den PMN vollständig erhalten (GIGER et al. 1987; TROWALD-WIGH et al. 1992). Im Serum betroffener Tiere finden sich eine normale (GIGER et al. 1987) bis erhöhte (MULLER et al. 1994) Anzahl von Immunglobulinen und Komplementkomponenten. Typ II der Erkrankung beruht auf einer Störung der Selektinfunktion und ist in dieser Form bisher nur beim Menschen beschrieben (STICKLE 1996).
2.2.2 Chronische Granulomatose
Im Gegensatz zu LAD handelt es sich bei der Chronic granulomatous disease (CGD) um einen Defekt im extramitochondralen Sauerstoffmetabolismus der PMN. Die Phagozyten können eingedrungene Erreger zwar erreichen und aufnehmen (RYAN et al. 1990), sind aber nicht fähig diese dann nachfolgend abzutöten. Der Infektionsherd bleibt bestehen und zieht weitere Entzündungszellen an (STICKLE 1996). Es kommt zur Granulombildung. Das Verschleppen der Keime im Innern der Granulozyten führt zu chronischen, granulomatösen Infektionen in Lymphknoten, Leber, Knochen, Respirationstrakt und Haut (TILL u. THIELMANN 1989). Durch einen autosomal oder x-chromosomal rezessiv vererbten Defekt (CHOLLET-MARTIN u. GOUGEROT-POCIDALO 2000) an den Genen, die für die vier Untereinheiten gp91-phox, p22-phox, p47-phox und p67-phox des membranständigen Enzyms NADPH-Oxidase kodieren (CURNUTTE 1992; CROCKARD et al. 1997), kann die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu dem reaktiven Superoxidanion nicht mehr erfolgen. Dabei sind genau dieses Superoxidanion und seine Derivate essentiell für die Abtötung des internalisierten Materials (GOSSET et al. 1983). Diese für den Menschen des öfteren beschriebene Erbkrankheit wurde für den Hund erstmals bei einem männlichen Irish Setter Welpen mit multipler Abszessbildung, Lymphadenopathie und Gingivitis bis hin zur Knochennekrose des Kiefers genannt (RENSHAW et al. 1975). Renshaw gab der Symptomatik den Namen Canine Granulocytopathy Syndrome. 1979 bezeichnete er es als geeignetes Modell für die CGD beim Menschen. 1987 wurde bei einem Dobermann mit Rhinitis und Pneumonie eine geschwächte Sauerstoffradikalbildung beschrieben
(BREITSCHWERDT et al. 1987). Auch dieser Fall wurde mit der CGD des Menschen in Verbindung gebracht. Spätere Autoren merkten jedoch an, dass bei den für Hunde bisher beschriebenen Fällen eine Rezeptorproblematik nicht eindeutig auszuschliessen sei (GIGER et al. 1987; STICKLE 1996).
2.2.3 Chediak-Higashi-Syndrom (CHS)
Beim autosomal rezessiv vererbten CHS kommt es neben Störungen der Melanozyten und Thrombozyten zur abnormen Bildung von sogenannten Riesenlysosomen in den PMN (ANONYM; WILLER 1997; CHOLLET-MARTIN u.
GOUGEROT-POCIDALO 2000). Die neutrophilen Granulozyten sind durch das Unvermögen zur Verschmelzung der Lysosomen mit den Phagosomen und zur Degranulation (TAICHMAN 1994) nicht mehr in der Lage, ihre Aufgaben im Rahmen der Infektionsabwehr wahrzunehmen. Neben einer hohen Anfälligkeit für Infektionen kommt es bei der Erkrankung zu partiellem Albinismus, Photophobie und vermehrter Blutungsneigung (CAROTHERS u. COUTO 1997; NELSON u. COUTO 1999). Der Verlauf des CHS ist letal. Beschrieben wurde die Erkrankung bisher bei Mensch, Maus, Nerz, Killerwal und bei der Katze (ANONYM; COLGAN et al. 1992; SCHMIDT 1997; NELSON u. COUTO 1999) und hier besonders bei der rauchfarbenen, gelbäugigen Perserkatze (ANONYM; CAROTHERS u. COUTO 1997; NELSON u.
COUTO 1999). Im Zusammenhang mit dem Hund wurde das CHS von CHAMMAS u.
HAGIWARA (1998) genannt.
2.2.4 Zyklische Neutropenie der silbergrauen Collies
Diese auch beim Menschen vorkommende Erkrankung wurde erstmals beim silbergrauen Collie beschrieben. Die in zeitlich etwa gleichen Abständen wiederkehrende Neutropenie führt zu einer geschwächten Immunabwehr und so zur verstärkten Anfälligkeit für bakterielle Infektionen, was meist in den ersten Lebensmonaten zum Tod führen kann (YANG 1987). Beim Menschen wurden
Knochenmarktransplantationen erfolgreich durchgeführt, was einen Knochenmarksdefekt vermuten lässt (YANG 1987; KELLER u. FREUDIGER 1993).
Eine Stammzellerkrankung ist wahrscheinlich, die neben neutrophilen Granulozyten auch andere Blutzellen wie z.B. Thrombozyten betrifft (YANG 1987). So ist auch die hohe Blutungsneigung der erkrankten Tiere zu erklären. Die Erkrankung wird autosomal rezessiv vererbt, wobei das geschädigte Gen eng verbunden ist mit dem Gen für die graue Haarfarbe (YANG 1987), was die Prädisposition der silbergrauen Collies erklärt. Metabolische und funktionelle Abnormitäten der PMN werden im Vergleich zu gesunden Collies gemessen. Bei erkrankten Hunden werden Störungen der Lysosomenbildung in den PMN gefunden (CHUSID et al. 1975). Ausserdem werden erniedrigte Werte der intrazellulären Myeloperoxidase festgestellt. Die Abwehrzellen sind zwar zur Phagozytose fähig, können jedoch die aufgenommenen Bakterien teilweise nicht abtöten. Die Abnormitäten der PMN werden ähnlich der beim Menschen vorkommenden hereditären Myeloperoxidasedefizienz beschrieben (CHUSID et al. 1975).
2.2.5 Pelger-Huet-Anomalie
Diese autosomal dominant vererbte Anomalie der Blutgranulozyten (LATIMER et al.
1985) wurde auch bei Hund (BOWLES et al. 1979; LATIMER u. PRASSE 1982;
LATIMER et al. 1987; LATIMER et al. 1989) und Katze (LATIMER et al. 1985) beschrieben. Die Granulozyten zeigen eine signifikante Kernhyposegmentierung, was zu eher runden, ovalen oder bohnenförmigen Kernformationen führt und die gewohnten segmentkernigen Granulozyten im Blutbild vermissen lässt (BOWLES et al. 1979). Da neben den PMN auch Monozyten und Megakaryozyten betroffen sind, liegt die Vermutung nahe, dass es sich um einen Defekt im Kernsegmentierungs- und Lobulierungsprozess der gemeinsamen Stammzellen handelt (LATIMER et al.
1987). Von LATIMER (1989) durchgeführte Leukozytenfunktionstests bei betroffenen Hunden haben jedoch keinerlei Einschränkung der Immunabwehr feststellen lassen.
2.2.6 Hypogammaglobulinämie und Komplementdefizienz
Meist ist eine Störung der Phagozytenfunktion Folge von Defekten im Zusammenspiel von Phagozyten, Mikroorganismen und Serumfaktoren (LEHMANN et al. 2000). Der Fehler muss aber nicht zwingend bei den PMN liegen. Eine niedrige Serumopsoninaktivität führt zu ernsten Infektionskrankheiten, da die Aktivierung der PMN und die Phagozytose eingedrungener Erreger nicht ausreichend erfolgen kann (HALSTENSEN et al. 1989; LEHMANN et al. 2000). Bei einem Weimaraner mit wiederkehrenden Infektionen wurden 1989 signifikant niedrige Immunglobulin G - (IgG) und Immunglobulin M (IgM) - Werte im Serum beschrieben (COUTO et al.
1989). 1995 wurde ein ähnlicher Fall über einen 5 1/2 Monate alten Weimaraner mit rezidivierenden bakteriellen Infektionen veröffentlicht (HANSEN et al. 1995). Auch dieser zeigte erniedrigte IgG-Werte und Neutrophilenfunktionsstörungen.
2.2.7 Erworbene Störungen der PMN-Funktion
Primäre, d.h. kongenitale Störungen der Granulozytenfunktion sind äusserst selten (STICKLE 1996). Häufiger kommt es durch systemische Erkrankungen des Organismus, wie z. B. bei der myeloischen Leukose durch tumoröse Entartung beim Hund oder unter dem Einfluss von Viren bei der Katze, zu sekundär bedingten Störungen der Granulozyten. Bei der myeloischen Leukämie des Menschen z.B.
zeigen die Tumorzellen einen verminderten Gehalt an NADPH-Oxidase (TAICHMAN 1994), dem wohl wichtigsten Enzym bei der Eliminierung von Krankheitserregern.
Eine verminderte Bildung von Sauerstoffradikalen zeigen ebenfalls die PMN von mit HIV infizierten Patienten (LAFRADO et al. 1989). Auch therapeutische Behandlung mit Glukokortikoiden oder längerbestehende, stressbedingte Ausschüttung von Cortisol kann zu einer gestörten Funktion der PMN führen. Einen hemmenden Einfluss haben Glukokortikoide auf die reaktiven Sauerstoffradikale (FUKUSHIMA et al. 1990; SALAK et al. 1993; HOEBEN et al. 1998) sowie auf die Bildung und
Ausschüttung der Interleukine 2 und 8 (WERTHEIM et al. 1993; VANCUROVA et al.
2001). Letzteres führt zu einer verminderten Bildung bzw. Chemotaxis der PMN (WERTHEIM et al. 1993). Desweiteren wird durch Dexamethason die L-Selektin- Expression auf den neutrophilen Granulozyten eingeschränkt (NAKAGAWA et al.
1999), was mit einer verminderten Adhäsionsfähigkeit der Zellen einhergeht. Neben den Glukokortikoiden zeigen vereinzelt Vertreter der Antibiotika, wie Ceftiofur oder Oxytetracyclin, über eine Interaktion mit dem Myeloperoxidase-Komplex einen hemmenden Einfluss auf die bakterizide Wirkung der reaktiven Sauerstoffspezies (HOEBEN et al. 1997a; HOEBEN et al. 1997b). Medikamente wie Zytostatika und physikalische Noxen wie Bestrahlungen führen durch Störungen der Zytopoese im Knochenmark unter anderem auch zu einer Verminderung der PMN-Zahl.
2.3 Überprüfung wichtiger Funktionen der PMN
2.3.1 Quantitative Bestimmung der Phagozytosekapazität
Seit etwa 20 Jahren werden durchflusszytometrische Verfahren zur Überprüfung verschiedenster Funktionen von Abwehrzellen in vitro eingesetzt (LEHMANN et al.
2000) und lösen ältere, aufwendige Methoden, wie Fluoreszenzmikroskopie oder andere immunologische Verfahren, wie z.B. den mittels Erythrozyten und Erythrozyten-Antiseren durchgeführten Rosettentest ab. Die Phagozytoseaktivität kann mit Hilfe der Fluoreszenz-activated-cell-sorter-(FACS)-Analyse an Zellen, die auf unterschiedliche Weise isoliert wurden, gemessen werden: an der Leukozytenfraktion nach Gewinnung des Buffy coat (ROTHE u. VALET 1990;
VUORTE et al. 1996) oder an über Dichtegradienten gereinigten Zellpopulationen (SMITH u. WEIDEMANN 1993); eine durchflusszytometrische Messung ist jedoch auch mit Vollblut (WHITE-OWEN et al. 1992; PERTICARARI et al. 1994; ANTAL et
al. 1995; VOWELLS et al. 1995) möglich. Frühere Verfahren zur Überprüfung der Phagozytosekapazität der PMN, wie die Fluoreszenzmikroskopie oder Techniken mit Einsatz von Radioisotopen, setzen eine hohe Reinheit der isolierten Zellpopulation voraus. Für die Messung mit Hilfe der Durchflusszytometrie ist eine exakte Isolierung der zu untersuchenden Zellen nicht nötig, da die Zellen durch ihre unterschiedliche Grösse und Komplexität unterschiedliche Lichtbrechung zeigen und somit gut differenziert werden können. Um einer gegenseitigen Beeinflussung unterschiedlicher Zellpopulationen mit ähnlichen Abwehraufgaben entgegenzuwirken, wird häufig trotzdem eine vorherige Separation der PMN durchgeführt (ROLLAND et al. 1987; RIBER u. LIND 1999). Reine Zellsuspensionen werden durch verschiedene Separierungsverfahren meist durch unterschiedliche Dichtegradienten (BOYUM 1968; KWON 1987; JENSEN-WAERN et al. 1994) oder Dextransedimentation (KWON 1987) mit nachfolgender Lyse der Erythrozyten (BOYUM 1968; ROLLAND et al. 1987) erreicht. Ein bislang seltener genanntes Verfahren zur Separierung stellt die immunomagnetische Selektion (OWEN u.
SYKES 1984; PARTINGTON et al. 1999) dar. Die Zellseparierung kann Zellen in Morphologie und Funktionalität verändern (OGLE et al. 1985; CANTINIEAUX et al.
1989), was viele Autoren dazu veranlasste, Vollblutassays den Vorrang zu geben (WHITE-OWEN et al. 1992; PERTICARARI et al. 1994; ANTAL et al. 1995;
VOWELLS et al. 1995). Prinzip der durchflusszytometrischen Messung ist mit Fluorochromen angefärbte Partikel den zu testenden Zellen zur Phagozytose anzubieten. Verschiedene Bakterienarten (BASSOE u. BJERKNES 1985;
CANTINIEAUX et al. 1989; WHITE-OWEN et al. 1992; PERTICARARI et al. 1994;
SMITS et al. 1997; RAIDAL et al. 1998b), Hefezellen (BJERKNES u. BASSOE 1983;
REIFENBERG et al. 1990; JENSEN-WAERN et al. 1994; PERTICARARI et al. 1994;
JOHANNISSON et al. 1995), Zymosanpartikel (BJERKNES u. BASSOE 1983; SAAD u. HAGELTORN 1985; RIBER u. LIND 1999) oder Latexkügelchen (LEHMANN et al.
1997) haben sich in zahlreichen Untersuchungen als geeignete Zielpartikel für die Phagozyten gezeigt.
Um die Phagozytose durch die PMN zu steigern bzw. überhaupt erst zu ermöglichen, werden die fluoreszierenden Teilchen vor Inkubation mit den Abwehrzellen
opsonisiert. Hierzu werden im besten Fall komplementfaktor- und immunglobulinhaltige Poolseren von gesunden Vertretern der jeweilig zu untersuchenden Spezies verwendet (TROWALD-WIGH u. THOREN-TOLLING 1990b; JENSEN-WAERN et al. 1994; JOHANNISSON et al. 1995; LEHMANN et al.
2000). Bei Verwendung von Vollblut ist nach PERTICRARI (1994) eine vorherige Opsonisierung nicht erforderlich.
Als Fluorochrom für die Anfärbung der Zielpartikel wird meist das Fluoresceinisothiocyanat (FITC) verwendet (BASSOE u. BJERKNES 1985;
CANTINIEAUX et al. 1989; PERTICARARI et al. 1994; JOHANNISSON et al. 1995;
WISSELINK et al. 1997; RAIDAL et al. 1998b; RIBER u. LIND 1999). Andere mögliche Farbstoffe sind Polychromatin-Rot (PC-red) (LEHMANN et al. 2000), Texasrot (SZEJDA et al. 1984), Ethidiumbromid (EB) (RAIDAL et al. 1998b), Luzifergelb (LY) (RAIDAL et al. 1998b) oder Phycoerythrin (PE) (BOGH u. DULING 1993; GOETZMAN 1993). Alle diese Farbstoffe lassen sich durch die Wellenlänge des Laserlichtes im Durchflusszytometer zur Aussendung von Licht ihrer für sie spezifischen Wellenlänge anregen. Im Durchflusszytometer wird jede einzelne Zelle nach Stoppen der Phagozytose auf das von ihr ausgehende Fluoreszenzlicht geprüft.
Dadurch kann sowohl der prozentuale Anteil der phagozytierenden Zellen an der Gesamtpopulation als auch die mittlere Strahlungsintensität der einzelnen Zelle, also die mittlere Phagozytosekapazität der einzelnen Zelle gemessen werden (CANTINIEAUX et al. 1989; GOETZMAN 1993). Um wirklich nur die phagozytierten fluoreszierenden Teilchen in der Messung zu berücksichtigen, müssen freie und angelagerte Zielpartikel entfernt, bzw. die von ihnen ausgehende Strahlung eliminiert werden. Häufig werden dazu ebenfalls Farbstoffe verwendet, die ihrerseits die Fluoreszenz der freien und anheftenden Partikel durch Interferenz oder Gegenfärbung auslöschen. Man nennt diesen Vorgang auch Quenching. Am gebräuchlichsten ist Trypanblau (JENSEN-WAERN et al. 1994; JOHANNISSON et al. 1995; RAIDAL et al. 1998b; RIBER u. LIND 1999; LEHMANN et al. 2000). Aber auch Ethidiumbromid (RAIDAL et al. 1998b) und Kristallviolett (CANTINIEAUX et al.
1989) wurden erfolgreich eingesetzt. Da diese Farbstoffe in lebende Zellen nicht eindringen können, sind phagozytierte Teilchen vor ihrer Wirkung sicher. Aus diesem
Grund werden sie z.T. auch zur Aufdeckung des Anteils toter Zellen verwendet. Zur Eliminierung anheftender und freier Partikel wurden ebenso erfolgreich kommerziell erhältliche Immunolyse-Lösungen nach Stoppen der Phagozytose eingesetzt (WHITE-OWEN et al. 1992; PERTICARARI et al. 1994). Nach ROLLAND (1987) reichte das Waschen in PBS nach Stoppen der Phagozytose zur Entfernung extrazellulärer Partikel aus.
Da die Zellen während der Inkubation an Oberflächen der Mikrotiterplatten und Plastikröhrchen adhärieren (JENSEN-WAERN et al. 1994), ist das gründliche Schütteln (JOHANNISSON et al. 1995) oder Spülen (LEHMANN et al. 2000) vor jeder Messung unerlässlich, um einen zu grossen Zellverlust zu vermeiden. Auch soll die Zugabe eiskalter Lösungen nach Inkubation zum einen die Phagozytose stoppen, zum anderen die PMN von der Oberfläche der Gefässwände lösen. Um einer zu starken Adhäsion am Plastik entgegenzuwirken, sind auch silikonbeschichtete Röhrchen in Gebrauch (RAIDAL et al. 1998a).
Bisher wurden neben zahlreichen durchflusszytometrischen Assays zur Überprüfung der Phagozytose beim Menschen (BASSOE u. BJERKNES 1985; ROLLAND et al.
1987; CANTINIEAUX et al. 1989; WHITE-OWEN et al. 1992; PERTICARARI et al.
1994; ANTAL et al. 1995; LEHMANN et al. 2000) ebensolche für Schweine (JENSEN-WAERN et al. 1994; RIBER u. LIND 1999), Pferde (FOERSTER u. WOLF 1990; JOHANNISSON et al. 1995; RAIDAL et al. 1998b), Rinder (SAAD u.
HAGELTORN 1985; SMITS et al. 1997) und Fische (JOHANNISSON et al. 1995) entwickelt. Die Granulozyten von Hunden wurden sowohl mittels mikroskopischer Verfahren auf ihre Phagozytoseaktivität gegenüber fluoreszierender Partikel hin untersucht (TROWALD-WIGH u. THOREN-TOLLING 1990b; CHAMMAS u.
HAGIWARA 1998), als auch durchflusszytometrische Studien zur Phagozytosekapazität von caninen PMN durchgeführt (WISSELINK et al. 1997).
Ein entscheidender Vorteil der Durchflusszytometrie gegenüber älteren Verfahren ist die Möglichkeit, in kürzester Zeit eine grosse Zellzahl hinsichtlich mehrerer Parameter, wie strukturelle oder funktionelle Eigenschaften, zu untersuchen (GOETZMAN 1993; JOHANNISSON et al. 1995). Bei der Überprüfung der Phagozytose ermöglicht die FACS-Analyse gleichzeitig eine Aussage über den %-
