Durchflußzytometrie

Das Prinzip der Durchflußzytometrie beruht darauf, daß Zellen aus einer Suspension über ein Probenführungssystem vereinzelt werden und dann hintereinander einen Laserstrahl kreuzen. Das dabei gestreute Licht des eingesetzten Lasers mit unveränderlicher Wellenlänge wird in Richtung des Strahls (Vorwärtsstreulicht, Forward Scatter, FSC) und im 90° Winkel dazu (Seitwärtsstreulicht, Side Scatter, SSC) aufgefangen und als elektronisches Signal an den angeschlossenen Computer weitergeleitet. Das Ausmaß der Streuung ist beim Vorwärtsstreulicht abhängig von der Größe und dem Refraktionsindex des Partikels, beim Seitwärtsstreulicht von seiner Komplexität (Oberflächenbeschaffenheit und Granularität).

Das hier verwendete FACScan^-Durchflußzytometer (Becton Dickinson, Heidel-berg) arbeitet mit einem Argonlaser, der Licht einer Wellenlänge von 488 nm erzeugt.

Zusätzlich zu den Streulichtdetektoren registriert das Gerät Fluoreszenzlichtemissionen jedes Partikels in drei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen. Der Detektor „FL1“

registriert Wellenlängen von 515-545 nm (Grünfluoreszenz). Orangefluoreszenz wird vom Detektor „FL2“ im Bereich 564-606 nm und Wellenlängen >650 nm im roten Spektralbereich werden vom Detektor „FL3“ gemessen. Somit werden pro gemessenem Partikel Werte für fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL1, FL2, FL3) erfaßt.

Jeder den Laserstrahl passierende Partikel liefert somit bei einer bestimmten Geräteeinstellung entsprechend seiner optischen Eigenschaften ein Datenmuster, das ihn als Meßereignis definiert. Über die angeschlossene Computereinheit werden die Geräteeinstellungen kontrolliert, Meßergebnisse erfaßt und gespeichert (ORMEROD 1990, RADBRUCH 1992).

Die computergestützte Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm

„WinMDI Version 2.8“ (TROTTER 1999). Es erlaubt die Darstellung eines Parameters gegen die Zahl der gemessenen Ereignisse in Form eines Histogramms oder die Darstellung verschiedener Parameter gegeneinander. Letztere kann u.a. als Kontur-diagramm, Punktediagramm oder Dichtediagramm erfolgen. Die Lage der Meßer-eignisse innerhalb dieser Darstellungen wird durch die Einstellungen des Durchfluß-zytometers bestimmt. Um eine Vergleichbarkeit der gewonnenen Daten gewährleisten zu können, wurde stets bei gleichen Geräteeinstellungen gemessen.

Es lassen sich Untergruppen von Meßereignissen einzeln analysieren, indem innerhalb von Zwei-Parameter-Diagrammen elektonische „Fenster“ (gates) gesetzt werden. Es können mehrere Fenster gleichzeitig gesetzt und auch logisch miteinander verknüpft werden. Auf diese Weise lassen sich auch die Anzahl bestimmter Meß-ereignisse und der prozentuale Anteil einer Untergruppe an MeßMeß-ereignissen an der Gesamtereignismenge, sowie der mittlere Wert eines Parameters für eine Ereignis-gruppe, ermitteln.

Morphologisch ähnliche Zellpopulationen stellen sich in einem korrelierten Diagramm, in dem für jede Zelle der FSC- gegen den SSC-Wert aufgetragen wird, als homogene Wolke dar. Lymphoblasten lassen sich auf diese Weise von ruhenden Lymphozyten auf Grund ihres höheren FSC (und auch SSC) Wertes unterscheiden. In einer korrelierten Darstellung von FSC gegen SSC läßt sich nur eine Granulozyten-population erkennen. Eine Unterscheidung von eosinophilen und neutrophilen Granulo-zyten ist erst nach einer Korrelation von SSC und FL1 möglich. Eosinophile stellen sich auf Grund ihrer höheren Autofluoreszenz in FL1 deutlich weiter rechts, positiver dar (s. 3.3.5, s. Abb. 4 und Abb. 10).

Bei der durchflußzytometrischen Messung der verschiedenen Populationen direkt nach der Separation wurden die Daten der Proben sowohl linear als auch logarithmisch aufgezeichnet. In der logarithmischen Darstellung des Seitwärts- und Vorwärts-streulichtes lassen sich auch die Thrombozyten differenzieren (s. Abb. 3). In der Literatur ist beschrieben, daß Thrombozyten einen Einfluß auf die Apoptose neutrophiler Granulozyten haben. Deshalb sollte der Einfluß der Thrombozyten auf die in dieser Arbeit beschriebenen Effekte untersucht werden. Die aus der Separation ge-wonnene Population der Granulozyten war immer nahezu frei von Thrombozyten, wohingegen in der Population der mononukleären Zellen zwischen 16% und 88%

Thrombozyten enthalten waren.

Durchflußzytometrische Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen (Referenzzell-methode):

Ein Teil der in vitro eingesäten Zellen stirbt im Laufe der Inkubation unter dem Einfluß der Kulturbedingungen und der stimulierenden Signale ab. Daraus resultiert eine unbekannte Zahl vitaler Zellen in Suspension, die dadurch bestimmt werden kann, daß der Zellprobe eine bekannte Anzahl anderer Partikel, in diesem Fall Zellen, zugesetzt wird, die sich in mindestens einem Parameter von den zu messenden Zellen unter-scheidet, aber mit den gleichen Geräteeinstellungen gemessen werden kann (Referenz-zellen). Setzt man die Zahl der gemessenen, als Referenzzellen identifizierten, mit denen als vitale Zellen identifizierten Zellen ins Verhältnis, so kann auf den absoluten Gehalt vitaler Zellen geschlossen werden.

Als Referenzzellen für die Bestimmung der Zahl vitaler Zellen dienten bovine mononukleäre Zellen des Blutes, die mit einem monoklonalen Antikörper gegen bovine MHC-Klasse-I-Moleküle (mAk Bo1, s. Tab. 2) markiert und indirekt mit einem fluoro-chromgekoppelten Ziege-anti-Maus Antikörper (s.S. 46) gefärbt wurden, so daß sie von den unmarkierten Zellen der Probe im Durchflußzytometer zu unterscheiden waren.

Herstellung von Referenzzellen

Die Referenzzellen wurden in größeren Mengen markiert, mit Paraformaldehyd fixiert und bei 4°C lichtgeschützt vorrätig gehalten.

Dazu wurden je 2 x 10⁷ frisch separierte bovine mononukleäre Zellen des Blutes in einem 15 ml Röhrchen abzentrifugiert (5 min, 80 xg, 4°C), der Überstand dekantiert und das Zellpellet in 100 µl PBS resuspendiert. Die Zellen wurden sodann mit 100 µl des unverdünnten mAk Bo1 (s. Tab. 2) für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Der Inkubation folgte ein Waschen der Zellen (Abzentrifugieren für 7 min, 80 xg, 4°C, Dekantieren des Überstandes) in 5 ml MIF-Puffer (s.S. 52) mit Resuspension des Zellpellets in 100 µl MIF-Puffer. Anschließend wurden die Zellen mit 100 µl FITC-konjugiertem Ziege-anti-Maus Antikörper (s.S. 46) 1:40 in MIF-Puffer verdünnt für 20 Minuten bei 4°C lichtgeschützt inkubiert.

Nach einem weiteren Waschschritt mit anschließender Resuspension der Zellen in 5 ml PBS wurde der Inhalt aller Röhrchen in 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt, mit PBS auf 50 ml aufgefüllt und abzentrifugiert (15 min, 80 xg, 4°C). Das Zellpellet wurde dann in 30 ml einer 4%igen Paraformaldehyd-Lösung (s.S. 52) resuspendiert und bei 4°C, lichtgeschützt, für 24h inkubiert. Diese Suspension wurde sodann 15 min bei Raumtemperatur abzentrifugiert, der Überstand dekantiert und ein zweites mal mit PBS gewaschen. Das letzte Zellpellet wurde in Trägerflüssigkeit (s.S. 52) mit Propidium-iodid (2 µg/ml, s.S. 53) resuspendiert und auf eine Zellzahl von 4 x 10⁵/ml eingestellt.

Vor dem Einsatz der Referenzzellen wurde die Suspension auf die Konzentration der Zellen überprüft und gegebenenfalls korrigiert.

Vorbereitung der Proben für die Messung

Nach dem Ende der Inkubationszeit wurden die Mikrotiterplatten mit kultivierten Zellen aus dem Brutschrank genommen und für 15 Minuten auf Eis gestellt, um adhärierte Zellen abzulösen. Der Inhalt jeder einzelnen Vertiefung wurde mit dem Volumen einer Pipette durchmischt und komplett in ein 5 ml Röhrchen für die Durchflußzytometrie (s. 3.2.1) überführt. Jeder Probe wurden dann 150 µl einer Lösung aus Trägerflüssigkeit und Propidiumiodid (Endkonzentration des Propidiumiodid 2 µg/ml, s.S. 53) zugesetzt.

In Vorversuchen wurde untersucht, ob es nach Stimulation mit Superantigenen zu einer verstärkten Adhärenz von Zellen und somit einem Verbleiben der Zellen in der Platte kommt. Dazu wurden nach dem Herauspipettieren der Zellsuspension, 50 µl Trypsin-EDTA (50 ng/ml) in die Vertiefungen gegeben und für eine Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 100µl Medium (s.S. 48) hinzugegeben. Der Inhalt wurde ebenfalls in ein für die Durchflußzytometrie vorbereitetes Röhrchen ge-geben (s. 3.2.1); zuletzt wurden noch 50 µl der Referenzzellsuspension (s.S. 61) zuge-setzt. Nach gründlicher Durchmischung der Proben wurde sie im Durchflußzytometer gemessen.

Ermittlung der Zahl vitaler Zellen

Für jede Probe wurden 10.000 Meßereignisse erfaßt. Nach der Fixierung der Referenzzellen blieb deren Morphologie weitgehend erhalten, so daß sie im Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht die gleichen Charakteristika aufwiesen wie frisch separierte oder kultivierte, vitale bovine mononukleäre Zellen. Das Prinzip der Bestimmung vitaler, kultivierter Zellen ist in Abb. 5 dargestellt und erläutert. Das Prinzip beruht darauf, in verschiedenen Darstellungen derselben Messung eines Gemischs aus Kulturzellen und

Referenzzellen, die einzelnen Zellpopulationen durch Setzen von Fenstern (gates) zu identifizieren und die jeweilige Zahl der Meßereignisse (events, E) zu registrieren. Da die eingesetzte Menge an Referenzzellen (ZREF) bekannt ist, ergibt sich die Zahl vitaler Kulturzellen (ZVIT) nach Erfassung der Meßereignisse für vitale Kulturzellen (EVIT) und der Meßereignisse für Referenzzellen (EREF) aus folgender Formel:

E x Z

E

Z =

Für die Angabe des Parameters Zahl vitaler Zellen (ZVIT) wurden die ermittelten Zahlen vitaler Zellen von Dreifachansätzen jeweils gemittelt.

R2 D)

R3 R4

FL1

C)

R1

FL3

FSC FSC

SSCSSC SSCSSC

A) B)

Abb. 5 Durchflußzytometrische Bestimmung der Zahl vitaler Kulturzellen.

Bovine Granulozyten (1 x 10⁵) wurden gemeinsam mit mononukleären Zellen (1 x 10⁵) für 24h in vitro inkubiert. Für die quantitative, durchflußzytometrische Analyse wurde dem Ansatz eine definierte Zahl an Referenzzellen sowie Propidiumiodid zugesetzt. In A-D sind unterschiedlich korrelierte Konturplots derselben Messung dargestellt, um die für die Analyse relevanten Zellpopulationen identifizieren zu können. A) Darstellung aller Ereignisse im FL1/SSC Konturplot zur Identifizierung der grünmarkierten Referenzzellen (rechter unterer Quadrant, R4, Region 4). B) Identifizierung der vitalen, Propidiumiodid-negativen Ereignisse (FL3-negativ, R1, Region 1). C) Darstellung aller Ereignisse aus R1 („vitale Zellen“) und Identifizierung von vitalen Granulozyten (R2, Region 2) und vitalen mononukleären Zellen (R3, Region 3).

Ereignisse, die links der R3-Zellen liegen, stellen mit hoher Wahrscheinlichkeit apoptotische Zellen dar, die von der Analyse ausgeschlossen wurden. D) Darstellung von Ereignissen, welche die logische Bedingung „R1 und (R2 oder R3)“ erfüllen. Durch Setzen eines Quadranten läßt sich die Anzahl der Meßereignisse für die Populationen mononukleärer Zellen und die der Granulozyten bestimmen. Da zur Messung eine bekannte Zahl an Referenzzellen (R4) zugesetzt wurde, ist es möglich, anhand der im Text erläuterten Formel, die Zahlen vitaler Granulozyten und mononukleärer Zellen zu bestimmen. FSC: Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht); SSC: Side Scatter (Seitwärtsstreulicht).