Tiere und humane Probanden

Bei allen Tieren, denen Blut zur Zellgewinnung entnommen wurde, handelte es sich um

„Deutsche Schwarzbunte“, Typ Holstein-Friesian. Das Alter lag zwischen 1,5 und 12 Jahren. Die klinisch gesunden Rinder stammten aus der Klinik für Geburtshilfe und Gynäkologie des Rindes, der Klinik für Rinderkrankheiten und der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Für die Gewinnung von humanem Blut standen freiwillige, männliche und weibliche, Mitarbeiter (Alter zwischen 20 und 40 Jahre) der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule zur Verfügung.

3.3 Methoden

3.3.1 Isolierung mononukleärer und polymorphkerniger Zellen aus gerinnungsgehemmtem Blut

Vollblut vom Rind wurde durch Punktion der Vena jugularis in sterilen Heparin- oder EDTA-enthaltenden Blutentnahmeröhrchen (Vacutainersystem, s. 3.2.1) gewonnen.

Von Menschen wurde das Vollblut durch Punktion der in der Armbeuge gelegenen Venen, V. cephalica, V. mediana antebrachii oder V. cubitalis medica, in sterilen EDTA-enthaltenden Blutentnahmeröhrchen (Vacutainersystem, s. 3.2.1) gewonnen.

Danach wurde eine von zwei unterschiedlichen Zellseparationstechniken, bei denen es sich in beiden Fällen um eine Dichtegradientenzentrifugation handelte, durchgeführt.

Zur Gewinnung von hochreinen neutrophilen Granulozyten wurde beim Rind die Separation über Percoll^, ansonsten wurde die Separation über Ficoll^ durchgeführt.

Aus humanem Blut wurden Granulozyten und mononukleäre Zellen durch Dichte-gradientenzentrifugation über Ficoll^ gewonnen.

Separation mittels Ficoll^

Zur Isolierung der Zellen wurde das Blut zunächst 1:2 mit PBS verdünnt. In einem Zentrifugenröhrchen (50 ml) wurden 15 ml Ficoll^-Isopaque-Lösung (spezifische Dichte 1,077 g/ml, 10°C) vorgelegt, dann 30 ml verdünntes Vollblut darüber

geschichtet und zentrifugiert (30 min, 10°C; Rind: 1100 xg, Mensch: 700 xg). Auf Grund der spezifischen Dichte der mononukleären Zellen sammelten sie sich zusammen mit Thrombozyten, als sogenannte Interphase, zwischen Plasma und Ficoll^, während Erythrozyten und Granulozyten sich als Pellet am Röhrchenboden absetzten.

Gewinnung der mononukleären Zellen aus der Ficoll^-Separation

Die Interphase wurde vorsichtig abgesaugt und in ein weiteres Zentrifugenröhrchen (50 ml) überführt. Durch dreimaliges Zentrifugieren mit absteigenden g-Zahlen (430 xg, 250 xg, 80 xg, jeweils 10 min bei RT) wurden die mononukleären Zellen gewaschen und ein großer Teil der Thrombozyten entfernt. Die Ausbeute an mononukleären Blutzellen betrug bei diesem Verfahren 1 bis 2 x 10⁶ pro ml Vollblut.

Nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet der mononukleären Zellen in Zellkulturmedium aufgenommen. Im Durchflußzytometer (s. 3.1 und 3.3.3) wurde die Vitalität der Blutzellen und die Reinheit der separierten Zellpopulation beurteilt. anhand der durchflußzytometrischen Charakteristika wurde sowohl der Anteil mononukleärer Zellen an der separierten Zellpopulation als auch der Anteil lebender, also propidiumiodidnegativer Zellen, bestimmt. Er betrug immer über 90%. Nach einer Färbung mit Akridinorange und Ethidiumbromid wurde mit dem Fluoreszenzmikroskop in der Bürkerkammmer die Zahl vitaler Zellen bestimmt (s.S. 58) und die Zell-suspension auf eine Konzentration von 2 x 10⁶/ml eingestellt. Der in der Zellsuspension mononukleärer Zellen enthaltene Anteil an Thrombozyten schwankte in einem weiten Bereich (16% bis 88%, s. Abb. 11).

Seitwärtsstreulicht (SSC)

Vorwärtsstreulicht (FSC)

A) B)

R1

R2 Rgesamt

Abb. 3 Durchflußzytometrische Darstellung der Population mononukleärer Zellen und Thrombozyten nach Separation über einen Dichtegradienten.

Bovine mononukleäre Zellen wurden durch Dichtegradientenzentrifugation aus gerinnungs-gehemmten Vollblut isoliert (s.S. 55). Die Prüfung auf Reinheit und Zusammensetzung erfolgte nach durchflußzytometrischer Erfassung und korrelierter Darstellung von Vorwärtsstreulicht (FSC) gegen Seitwärtsstreulicht (SSC). A) Erfassung von FSC und SSC im linearen Modus. B) Erfassung von FSC und SSC im logarithmischen Modus zur gleichzeitigen Darstellung von Thrombozyten (Region 2, R2) und leukozytären Zellen (Region 1, R1). Der Anteil der Thrombozyten an der Gesamtheit (R_gesamt) der dargestellten Ereignisse liegt in dem gezeigten Beispiel bei 80%.

Gewinnung der Granulozyten nach der Separation über Ficoll^

Das Zellpellet unter dem Ficoll^® setzt sich zusammen aus Granulozyten und Erythrozyten. Die Erythrozyten wurden durch hypotone Lyse entfernt. Dazu wurden 20 ml Aqua tridest. zu dem Zellpellet in das Röhrchen gegeben und dieses für 20 Sekunden geschwenkt. Die Isotonie wurde mit 20 ml doppelt konzentrierter PBS (2 x PBS, s.S. 52) wieder hergestellt. Im Anschluß wurden die Zellen bei 100 xg zentrifugiert (8 min, 4°C). Um die Erythrozyten vollständig zu entfernen, wurde die Prozedur nach Entfernung des Überstands und Resuspension des Pellets wiederholt. Die erhaltene Granulozytenpopulation, zusammengesetzt aus eosinophilen und neutrophilen Granulozyten, war maximal mit 10% mononukleären Zellen verunreinigt. Eine Trennung zwischen neutrophilen und eosinophilen Granulozyten konnte bei der Separation über Ficoll^ nicht erreicht werden. Die eosinophilen Granulozyten können im Durchflußzytometer anhand ihrer höheren Autofluoreszenz (s. Abb. 4) oder nach indirekter Membranimmunfluoreszenz mit dem mAk Bo116 (s. Tab. 2) eindeutig von diesen differenziert werden (s. Abb. 10).

Separation mittels Percoll^

Für die Gewinnung hochreiner PMN war die Ficoll^-Separation nicht geeignet, da - je nach Individuum - der Anteil kontaminierender MNC bis 10% betragen konnte. Um eine hoch reine Population von bovinen neutrophilen Granulozyten zu erhalten, wurde daher die Separation über Percoll^ durchgeführt.

Das durch EDTA gerinnungsgehemmte Blut wurde in Zentrifugenröhrchen (50 ml) gegeben und für 5 Minuten bei 1500 xg und 4°C mit Bremse zentrifugiert. Danach wurde die obere Phase, Plasma, abgesaugt und verworfen. Die Erythrozyten wurden durch hypotone Lyse entfernt. Dazu wurden 20 ml Aqua tridest. zu dem Zellpellet in das Röhrchen gegeben und dieses für 20 Sekunden geschwenkt. Die Isotonie wurde mit 20 ml doppelt konzentrierter PBS (2 x PBS, s.S. 52) wieder hergestellt. Im Anschluß wurden die Zellen bei 100 xg zentrifugiert (8 min, 4°C). Um die Erythrozyten vollständig zu entfernen, wurde die Prozedur nach Entfernung des Überstands und Resuspension des Pellets wiederholt. Im Anschluß wurden die Zellen in ca. 10 ml PBS resuspendiert und in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen über ein Volumen von 4 ml einer 70%igen Percoll^-Lösung geschichtet. Die Röhrchen wurden bei 750 xg und 20°C für 25 Minuten ohne Bremse zentrifugiert. Die neutrophilen Granulozyten wanderten dabei durch das Percoll auf den Röhrchenboden, während sich MNC und eosinophile Granulozyten in der Interphase zwischen Percoll^ und PBS sammelten. War die Population der neutrophilen Granulozyten dennoch mit MNC oder eosinophilen Granulozyten verunreinigt, wurde die Percoll^-Separation 2-3x durchgeführt. Bereits nach dem zweiten Durchgang waren keine mononukleären Zellen mehr in dem Zellpellet zu finden, und nach dem dritten war die Population auch frei von eosinophilen Granulozyten. Zuletzt wurden die Zellen noch zweimal mit PBS gewaschen (100 xg, 4°C, 8 min, dekantieren und resuspendieren in frischem PBS) und im Anschluß daran in Kulturmedium resuspendiert. Die unterschiedlichen Reinheitsgrade der gewonnenen neutrophilen Granulozyten nach Ficoll^- oder Percoll^ -Separation verdeutlicht die folgende Abb. 4.

MNC EGZ

Grün-Fluoreszenz 1(FL1)

Ficoll Percoll

Seitwärtsstreulicht (SSC)

Abb. 4 Durchflußzytometrische Analyse der Reinheit von Granulozyten-populationen nach Separation über zwei verschiedenen Dichtegradienten.

Die Separation von bovinen Granulozyten aus gerinnungsgehemmten Vollblut erfolgte ent-weder über Ficoll^ oder über Percoll^ (s.S. 54 und S. 57). Die Konturplots stellen die Grün-fluoreszenz (FL1) gegen das Seitwärtsstreulicht dar. Nach Separation über Ficoll^ (linke Darstellung) lassen sich in der Zellpopulation sowohl mononukleäre Zellen (MNC) als auch neutrophile und eosinophile Granulozyten (EGZ) identifizieren. EGZ lassen sich, bei ähnlichen SSC-Werten, auf Grund ihrer stärkeren Autofluoreszenz von neutrophilen Granulozyten unterscheiden. Nach Separation über Percoll^ (rechte Darstellung) lassen sich reine neutrophile Granulozyten separieren.