Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration von elf in der Mastitistherapie angewandten Antibiotika gegen verschiedene Spezies der Gattung Corynebacterium.
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Gitta Buhr
Lüneburg
Univ.-Prof. Dr. Günter Klein
Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Martina Hoedemaker, PhD Klinik für Rinder
Univ.-Prof. Dr. Günter Klein
Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit
2. Gutachter: PD Dr. Christoph Baums
Institut für Mikrobiologie
Tag der mündlichen Prüfung: 22.10.2013
Meiner Familie Meinen Freunden
1 Einleitung ... 1
2 Literatur ... 2
2.1 Milchviehhaltung in Deutschland ... 2
2.1.1 Überblick ... 2
2.1.2 Aktuelle Milchmarktsituation ... 2
2.1.3 Kosten der Milchproduktion ... 3
2.2 Bovine Mastitis ... 5
2.2.1 Definition Mastitis ... 5
2.2.2 Klinische/subklinische Mastitis ... 7
2.2.3 Mastitiserreger ... 7
2.2.4 Infektionswege der bovinen Milchdrüse ... 11
2.2.5 Risikofaktoren ... 11
2.3 Corynebacterium bovis ... 13
2.3.1 Eigenschaften des Genus Corynebacterium ... 13
2.3.2 Corynebacterium bovis ... 16
2.3.3 Kultivierung von Corynebakterien ... 18
2.3.4 Speziesdifferenzierung von Corynebacterium bovis ... 20
2.3.5 Vorkommen beim Tier ... 21
2.3.6 Mastitis durch Corynebacterium bovis ... 23
2.3.7 Besiedlungswege des Euters durch Corynebacterium bovis ... 26
2.3.8 Lokalisation von Corynebacterium bovis im Euter ... 26
2.4 Antimikrobielle Wirkstoffe ... 28
2.4.1 Ausgewählte antimikrobielle Wirkstoffe in der Mastitistherapie ... 28
2.4.2 Anwendung der Antibiotika in der Mastitistherapie ... 29
2.4.3 Anwendung der Antibiotika zum Trockenstellen ... 30
2.5 Empfindlichkeitsbestimmung ... 31
2.5.1 In-vitro–Empfindlichkeitsbestimmung ... 31
2.5.2 Agardiffusion ... 33
2.5.3 Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) ... 34
2.5.3.1 E-Test ... 35
2.5.3.3 Bouillondilution ... 36
2.5.3.4 Bouillonmikrodilution für Corynebacterium bovis ... 39
2.5.3.5 Bouillonmikrodilution nach Vorgaben des CLSI ... 39
2.5.4 Interpretation der Ergebnisse ... 40
2.5.4.1 „breakpoint“/ „cut-off“ ... 41
2.5.5 Qualitätskontrollen ... 43
3 Material und Methoden ... 44
3.1 Material ... 44
3.1.1 Probenmaterial ... 44
3.1.1.1 Herkunft der Proben ... 44
3.1.1.2 Gewinnung der Proben ... 44
3.1.2 Corynebakterien ... 45
3.1.2.1 Isolierung und Aufarbeitung der Corynebakterien ... 45
3.1.2.2 Bakterienasservierung ... 46
3.1.3 Nährmedien ... 47
3.1.4 Antimikrobielle Wirkstoffe ... 47
3.2 Methoden ... 49
3.2.1 Kultivierung von Corynebacterium bovis ... 49
3.2.2 Methodenfindung für die Bouillonmikrodilution ... 50
3.2.3 Referenzstämme ... 54
3.2.4 Qualitätssicherung ... 55
3.2.4.1 Reinheitskontrolle des Inokulums ... 55
3.2.4.2 Überprüfung der Einsaatdichte ... 56
4 Ergebnisse ... 57
4.1 Referenzkeime ... 61
4.2 Corynebacterium bovis ... 66
4.3 Corynebacterium urealyticum ... 69
4.4 Corynebacterium auris ... 72
4.5 Corynebacterium subspezies (spp.) ... 75
4.6 Corynebacterium striatum/amycolatum ... 77
4.7 Corynebacterium jeikeium ... 81
4.8 Corynebacterium afermentans/coyleae ... 84
4.9 Corynebacterium argentoratense ... 87
4.10 Corynebacterium propinquum ... 90
4.11 Corynebacterium Group G ... 93
4.12 MHK-Werte Kühe ... 96
4.13 Einsaatdichte-Bestimmung ... 97
4.14 MHK90 ... 98
5 Diskussion ... 101
5.1 Verbreitung der Corynebakterien ... 101
5.2 Mikrotiterplatten ... 103
5.3 Methodenfindung für die Bouillonmikrodilution ... 104
5.4 Grenzwertbestimmung ... 104
5.4.1 „Epidemiological cut-offs“ ... 105
5.5 MHK-Ergebnisse ... 106
5.5.1 MHK-Bestimmung ... 107
5.5.2 api®-Ergebnisse ... 111
5.5.3 Referenzkeime ... 111
5.6 Erreichbare Antibiotikakonzentrationen im Euter ... 113
5.7 Therapeutische Bedeutung der MHK-Werte ... 114
5.8 Fazit ... 115
6 Zusammenfassung ... 116
7 Summary ... 118
8 Anhang ... 120
8.1 Wiederholungen ... 120
8.2 Tabellen und Säulendiagramme ... 122
8.3 MHK-Werte von C. bovis ausgewählter Kühe ... 127
8.4 Verbrauchsmaterial und Rezepte ... 139
8.5 Geräte ... 140
8.6 Abkürzungsverzeichnis ... 142
9 Literaturverzeichnis ... 145
1 Einleitung
Die Milcherzeugung ist in der deutschen Landwirtschaft mit einem Produktionswert von 9,5 Mill. € der wichtigste Produktionszweig (BMELV 2011a). In den letzten Jahren ist es jedoch zunehmend schwieriger geworden, den Milchproduktionszweig als Einnahmequelle zu sichern. Wirtschaftskrise, sinkende Nachfrage und ein Anstieg der Milchanlieferung haben dazu beigetragen, dass der Milchpreis von durchschnittlich 33,84 ct/kg (umgerechnet auf 3,7 % Fett / 3,4 % Eiweiß) im Jahr 2008 auf 22,90 ct/kg in 2009 gefallen ist. Trotz eines geringen Aufwärtstrends nach dem Jahreswechsel 2009/2010, ist es für die Landwirte eine Herausforderung, unter diesen Bedingungen wettbewerbsfähig zu bleiben.
Daher ist es von großer Bedeutung, die Produktionskosten der Milcherzeugung möglichst gering zu halten.
Um dies zu erreichen, ist ein Ansatzpunkt die Verbesserung der Diagnostik bei einer der bedeutendsten Erkrankungen der Milchkuh, der Mastitis. Hierbei handelt es sich um eine Entzündung des Milchdrüsengewebes, die in der Regel durch bakterielle Erreger hervorgerufen wird. Ein sehr viel gezielterer Einsatz antimikrobieller Wirkstoffe zur Therapie und Prophylaxe dieser Erkrankung wird durch bessere Diagnostik ermöglicht. Neben der Kenntnis des am besten geeigneten Wirkstoffes, ist es ebenso wichtig, die In-vitro-Empfindlichkeit des verursachenden Erregers zu kennen.
In dieser Arbeit soll ein Erreger boviner Mastitiden im Besonderen hervorgehoben werden, Corynebacterium bovis. Es gilt, für diesen Keim Vorschläge vorläufiger
„Breakpoints“ (Grenzwerte) oder „cut off-Werte“ zur quantitativen Einschätzung der In-vitro-Hemmkonzentration zu ermitteln. Es stehen mittlerweile aussagekräftige Daten der minimalen Hemmkonzentration (MHK) für viele antimikrobielle Wirkstoffe und Mastitiserreger zur Verfügung, eine Methode für die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration von anspruchsvollen Bakterien, wie Corynebakterien, ist jedoch noch nicht etabliert.
2 Literatur
2.1 Milchviehhaltung in Deutschland
2.1.1 Überblick
In der deutschen Milchviehhaltung ist in den letzten Jahren ein deutlicher Strukturwandel zu verzeichnen. 1996 gab es noch 186.400 milcherzeugende Betriebe, die mit 5,2 Mio. Kühen 26 Mio. t Milch anlieferten. Bereits 2008 war die Zahl der Betriebe auf 99.000 gesunken. Das bedeutet, fast die Hälfte der Milchviehbetriebe hat innerhalb von 12 Jahren die Produktion eingestellt. Dennoch ist die angelieferte Milchmenge auf 28 Mio. t gestiegen, bei einer deutlichen Abnahme der Kuhzahl auf 4,2 Mio. Stück. Als Ursache ist eine gesteigerte Leistung von 5.510 l/Kuh/Jahr (1996) auf 6.827 l/Kuh/Jahr (2008) zu sehen (MILCHINDUSTRIEVERBAND 2010a).
Die Anzahl der Kühe pro Betrieb hat sich von 31,2 Tiere pro Halter (1999) auf 40,2 Tiere pro Halter (2007) gesteigert (BMELV 2011b).
2.1.2 Aktuelle Milchmarktsituation
In der europäischen Union (EU) ist die Milchanlieferung 2009 etwa auf dem Niveau des Vorjahres geblieben. Sie wird auf etwa 134 Mio. t geschätzt. Innerhalb der EU gab es somit keine Überlieferung der festgesetzten Milchquote (Referenzmenge Anlieferungsmilch EU 2009/10: ca. 148 Mio. t) (MILCHINDUSTRIEVERBAND 2009;
UNTERNEHMEN MILCH 2010). Dennoch ist Europa weltweit die Region mit der größten produzierten Milchmenge und lässt damit die USA und Neuseeland weit hinter sich. Innerhalb der EU sind Deutschland und Frankreich die größten Milcherzeugerländer (LATACZ-LOHMANN u. HEMME 2010).
In Deutschland wurden im Jahr 2009 ca. 29 Mio. t Milch angeliefert (LANDESVEREINIGUNG DER MILCHWIRTSCHAFT NIEDERSACHSEN E.V.2010).
Damit ist die Milchquote im Zeitraum von April bis Dezember 2009 zu 99,1 %
ausgeschöpft worden (RAIFFEISEN 2010). (Referenzmenge Anlieferungsmilch Deutschland 2009/10: ca. 29 Mio. t) (MILCHINDUSTRIEVERBAND 2009).
Dennoch brachen die Erzeugerpreise im Jahr 2009 sehr stark ein, was sowohl an dem Nachfragerückgang als auch der Wirtschaftskrise lag (UNTERNEHMEN MILCH 2010). Die Landwirte mussten es hinnehmen, dass der Milchpreis in Deutschland, umgerechnet auf 3,7 % Fett/ 3,4 % Eiweiß, von durchschnittlich 33,84 ct/kg im Jahr 2008 auf durchschnittlich 22,90 ct/kg im Zeitraum von Januar bis Dezember 2009 fiel (MILCHINDUSTRIEVERBAND 2010b). Dabei handelt es sich um die niedrigsten Milchpreise seit Anfang der 1970er Jahre. In Schleswig-Holstein mussten die Milchbauern 2009 die bundesweit niedrigsten Milchpreise von unter 20 ct/kg hinnehmen (AMI 2010). In 2010 erholten sich die Preise leicht und stiegen im Mittel auf 28-30 ct/kg. Die Milchpreise zeigten 2011 eine steigende Tendenz, es wurden im November 35.6 ct/kg Milch bei 4% Fett und 3,4% Eiweiß als Jahreshöchstpreis ausgezahlt. Derzeit (Mai 2012) ist der Preis je kg Milch wieder rückläufig und liegt bei 30,3 ct/kg (AMI 2010; MILCHINDUSTRIEVERBAND 2010a; AMI 2012).
2.1.3 Kosten der Milchproduktion
Die Kosten für die Produktion eines Liters Milch lagen 2006 zwischen 15 und 70 Euro Cent. Diese große Schwankungsbreite ergibt sich aus zwei Faktoren: Zum Einen aus der Betriebsgröße - so haben durchschnittlich große Betriebe höhere Produktionskosten als Großbetriebe. Zum Anderen aus dem Standort - in Nord- und Ostdeutschland sind die Betriebsstrukturen größer, wodurch diese die Milch günstiger produzieren können als kleinere Betriebe in Süddeutschland (LATACZ- LOHMANN u. HEMME 2010).
Ein durchschnittlicher landwirtschaftlicher Betrieb muss für die Erzeugung von einem Liter Milch verschiedene Kosten einrechnen. So fallen Kosten für Futter, Arbeitskraft, Tierarzt, Melktechnik, Remontierung, Stallungen und Düngemittel an. Bei steigenden Produktionskosten pro Liter Milch und einem sinkenden Milchpreis fällt der Gewinn immer geringer aus.
Im Hinblick auf die kostenintensivsten Erkrankungen in der Milchproduktion ist die Mastitis die ökonomisch Bedeutsamste (BLOSSER 1979; KOSSAIBATI u.
ESSLEMONT 1997; HALASA et al. 2007) und stellt eines der größten Probleme der landwirtschaftlichen Milchproduktion dar (KIETZMANN u. BÄUMER 2008). Zudem ist die Mastitis gleichzeitig eine der häufigsten Erkrankungen des Milchviehs (HALASA et al. 2007).
Die Direktkosten entfallen dabei auf tierärztliche Behandlungszeit und Medikamentenkosten, Kosten für die Diagnostik, Arbeitszeit des Betriebsleiters, Milchverlust, Milchleistungsrückgang, Qualitätsverluste der Milch und mögliche Todesfälle unter den Tieren (KOSSAIBATI u. ESSLEMONT 1997; SHIM et al. 2004;
HALASA et al. 2007; KIETZMANN u. BÄUMER 2008). Neben diesen Direktkosten entstehen allerdings weitere Ausgaben, die sogenannten indirekten Kosten. Hierzu zählen unter anderem Aufwendungen aufgrund wiederkehrender Erkrankungen, verlängerter Zwischenkalbezeiten, Merzungen von Tieren und aufgrund höherer Aufwendungen für die Konzeption (KOSSAIBATI u. ESSLEMONT 1997).
Die größten Einbußen bei klinischen Mastitiden entstehen durch den Milchverlust, bedingt einerseits durch den Rückgang der Milchleistung, andererseits durch das Verwerfen der mit Antibiotika behandelten Milch (KOSSAIBATI u. ESSLEMONT 1997; SHIM et al. 2004). Der durchschnittliche Milchverlust durch eine klinische Mastitis beträgt etwa 327 (+/- 172) kg Milch in einer 305-Tage-Laktation (SHIM et al.
2004). Hinzu kommen noch Verluste durch verlängerte Zwischenkalbezeiten und höhere Merzungsraten (KOSSAIBATI u. ESSLEMONT 1997).
Die finanziellen Ausfälle durch eine an Mastitis erkrankte Kuh werden auf etwa 300 US $ pro Kuh und Jahr (BRAY u. SHEARER 2008), bzw. auf 150 € pro Kuh und Jahr beziffert (DVG 2002). Die Behandlungskosten machen dabei nur etwa 1/3 der Kosten der nicht verkaufsfähigen Milch aus (SHIM et al. 2004).
Daher ist es im Zusammenhang dieser Dissertation wichtig, eine hohe Effizienz der Diagnostik zu erreichen, um Aufwand und Kosten möglichst gering zu halten.
2.2 Bovine Mastitis
2.2.1 Definition Mastitis
Eine Entzündung der Milchdrüse (Mastitis) ist eine Folge eines Traumas, einer Störung der physiologischen Funktion ohne beteiligte Mikroorganismen oder, wie in den meisten Fällen, eine Infektion mit einem oder mehreren Mikroorganismen (BRAMLEY u. DODD 1984). Zu den klinischen Anzeichen einer Mastitis gehören die klassischen Entzündungssymptome: Schwellung, Rötung, Schmerz und Fieber.
Zudem kommt es zu makroskopischen Veränderungen der Milch, z.B. wässrige Milch, Gerinnsel oder Flocken (BERRY u. HILLERTON 2002; DVG 2002).
Überwiegend sind Bakterien an der Infektion beteiligt, es treten aber auch Pilze oder Algen auf (BRAMLEY u. DODD 1984). Sobald in einer Viertelanfangsgemelksprobe erhöhte Zellgehalte und Mastitiserreger nachgewiesen werden, liegt eine Mastitis vor (DVG 2002).
Die durchschnittliche somatische Zellzahl (somatic cell count = SCC) von bakteriologisch negativen Eutervierteln beträgt ca. 70 000 Zellen/ml Milch (DJABRI et al. 2002; SCHUKKEN et al. 2003a). Der Zellgehalt von nicht infizierten Tieren sollte unter 200 000 Zellen/ml Milch, auf Ebene der Euterviertel unter 100 000 Zellen/ml Milch liegen (DVG 2002; RUEGG u. REINEMANN 2002; PYÖRÄLÄ 2003;
SCHUKKEN et al. 2003b). Zur Verdeutlichung sind die Kriterien der Mastitisdiagnostik in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Kriterien der Mastitisdiagnostik nach IDF (International Dairy Federation) (DVG 2002)
Beurteilung zytologisch-mikrobiologischer Befunde im Rahmen der Mastitis-Kategorisierung (in Anlehnung an IDF 1967)
Zellgehalt pro ml Milch
Euterpathogene Mikroorganismen nicht nachgewiesen nachgewiesen
< 100.000 normale Sekretion latente Infektion
> 100.000 unspezifische Mastitis Mastitis
Infolge einer Mastitis wird die Zusammensetzung der Milch verändert (Tabelle 2). Der Grad dieser Veränderung hängt von der Pathogenität des Erregers, der Permeabilität der Blut-Euter-Schranke und dem Umfang des infizierten Gewebes ab (PYÖRÄLÄ 2003).
Tabelle 2: Wesentliche Veränderungen der Milchzusammensetzung bei Mastitiden (Pyörälä 2003)
Abnahme Grad der
Veränderung Zunahme Grad der
Veränderung Milchleistung auf
Viertelebene -(--) Somatischer
Zellgehalt +++
Trockenmasse - Molkenproteine +++
Laktose - Bovines
Serumalbumin +
Fett - Immunglobuline +++
Langkettige Fettsäuren - ƙ Casein +(+)
Gesamtcasein -- Freie Fettsäuren ++
α-S1 Casein -- Kurzkettige
Fettsäuren +
ß-Casein --- Natrium ++
α-Lactalbumin - Chlorid ++
ß-Lactoglobulin --- Lactat +++
Calcium --- Enzymaktivität:
Magnesium --- Lipase ++
Phosphor --- Lysozym +++
Zink - NAGase* +++
Kalium - ß-Glucuronidase +++
Plasmin +++
*NAGase= N-Acetyl-ß-D-Glucosaminidase
Zu den Methoden einer Mastitisdiagnostik gehören unter anderem die quantitative Bestimmung des somatischen Zellgehaltes (SCC), der California Mastitis Test (CMT), die mikrobiologische Kultur auf Euterviertel-Ebene und für einen kostengünstigen Überblick über Mastitiserreger auch auf Tankmilch-Ebene, die Leitfähigkeitsmessung (RUEGG u. REINEMANN 2002; PYÖRÄLÄ 2003) und die Messung des ph-Wertes in der Milch (WENDT et al. 1998).
2.2.2 Klinische/subklinische Mastitis
Die klinische Mastitis zeigt sich durch Veränderungen am Tier und/oder der Milch.
Die verursachenden Pathogene sind oft nur eine kurze Zeit zugegen und führen zu klinischen Erscheinungen (ØSTERÅS et al. 2006) und einem starken Anstieg der somatischen Zellzahl (HALASA et al. 2007). Sie ist eine Einzeltiererkrankung und wird als solche therapeutisch behandelt (KIETZMANN u. BÄUMER 2008).
Eine subklinische Mastitis ist eine Entzündung der Milchdrüse ohne erkennbare äußerliche Symptome. Sie fällt meist nur durch erhöhte Zellgehalte der Milch auf (über 100 000 Zellen/ml Milch/Euterviertel) und stellt oft ein gravierendes Bestandsproblem dar. Das Tier ist klinisch gesund, Adspektions- und Palpationsbefunde sind unauffällig. Die ermolkene Milch weist bei der grobsinnlichen Überprüfung keine Veränderungen auf. Bei der mikrobiologischen Untersuchung wird mindestens ein euterpathogener Erreger nachgewiesen (FRITON et al. 1998; DVG 2002; RUEGG u. REINEMANN 2002; KIETZMANN u. BÄUMER 2008).
Der California Mastitis Test (CMT) stellt die am besten geeignete Methode dar, um direkt an der Kuh eine subklinische Mastitis zu erkennen (RUEGG u. REINEMANN 2002). Eine Therapie der subklinischen Mastitis während der Laktation ist nur wenig erfolgversprechend (FRITON et al. 1998).
2.2.3 Mastitiserreger
Generell ist bei den Erregern boviner Mastitiden eine Einteilung in umwelt- und kuhassoziierte Erreger vorzunehmen.
Umweltassoziierte Erreger befinden sich in der Umwelt der Kühe, auf Laufgängen, Liegeboxen oder in Tiefstreuställen. Dort findet auch die Übertragung der Keime statt (PEELER et al. 2000b). Zu dieser Gruppe von Erregern zählen unter anderem Streptococcus uberis (Str. uberis) (FORET et al. 2006), Escherichia coli (E. coli), Trueperella pyogenes (T. pyogenes), Pilze und Algen. Am häufigsten treten E. coli
Kuhassoziierte Erreger werden während des Melkens übertragen, durch Melkgeschirre, Tierkontakte oder das Melkpersonal (BRAMLEY u. DODD 1984;
BRAY u. SHEARER 2008). Dazu gehören unter anderem Staphylococcus aureus (St. aureus), Streptococcus agalactiae (Str. agalactiae), Streptococcus dysgalactiae (Str. dysgalactiae) (BRAMLEY u. DODD 1984), Corynebacterium bovis (C. bovis) und koagulase-negative Staphylokokken (CNS).
Weiterhin wird eine Einteilung von Mastitiserregern in „major“ und „minor pathogens“
vorgenommen. Kriterien für eine Zuordnung in einer dieser Gruppen sind die Prävalenz der Erreger, die Kontagiösität und die Kosten der entstehenden Erkrankung (WILSON et al. 1997).
Als „major pathogens“ werden unter anderem St. aureus, Str. uberis, Str.
agalactiae, Str. dysgalactiae, E. coli (GREEN et al. 2002; SAMPIMON et al. 2010), Mycoplasma spp. (WILSON et al. 1997; SCHUKKEN et al. 2003b) und T. pyogenes bezeichnet (GREEN et al. 2002).
Zu den „minor pathogens“ zählen beispielsweise CNS und C. bovis (GREEN et al. 2002; SAMPIMON et al. 2010). Sie verursachen einen Anstieg der somatischen Zellzahl (LAM et al. 1997).
Die Mehrheit der Euterinfektionen wird durch Staphylokokken, Streptokokken und Gram-negative Bakterien hervorgerufen (WILSON et al. 1997; BRADLEY 2002).
Unter den Staphylokokken tritt St. aureus am häufigsten auf (PITKÄLÄ et al. 2004;
ØSTERÅS et al. 2006; ERICSSON UNNERSTAD et al. 2009). In anderen Untersuchungen waren CNS die am häufigsten isolierten Bakterien in Milchproben (PITKÄLÄ et al. 2004; ØSTERÅS et al. 2006; CASSEL 2009; SAMPIMON et al.
2009; SCHUKKEN et al. 2009).
Bei den Streptokokken sind die Spezies Str. dysgalactiae und Str. uberis am häufigsten vertreten (WATTS 1988; WILSON et al. 1997; ØSTERÅS et al. 2006;
ERICSSON UNNERSTAD et al. 2009). Str. agalactiae tritt seltener auf (PITKÄLÄ et al. 2004).
Bei den Gram-negativen Keimen ist E. coli am weitesten verbreitet (ØSTERÅS et al.
2006; ERICSSON UNNERSTAD et al. 2009).
Im Hinblick auf die Einteilung in „major pathogens“ ist St. aureus der am häufigsten isolierte Keim (SAMPIMON et al. 2009). Er ist vor allem direkt nach der Abkalbung zu finden (ØSTERÅS et al. 2006). Außerdem ist er bei klinisch gesunden Tieren der Keim mit der höchsten Prävalenz (TENHAGEN et al. 2006).
In Milchviehherden, in denen bereits seit Jahren das Trockenstellen der Kühe unter Antibiotikaschutz und Zitzendesinfektion nach dem Melken durchgeführt werden, sind „minor pathogens“ die dominierende Erregerpopulation, die in Viertelgemelksproben nachgewiesen werden (HARMON et al. 1986). Hier sind koagulase-negative Staphylokokken die Keime mit der höchsten Prävalenz bei klinisch gesunden Tieren (TENHAGEN et al. 2006) und treten gehäuft bei Färsen in der ersten Laktation auf (TENHAGEN et al. 2006; SAMPIMON et al. 2009). Ein ebenso weit verbreiteter Keim der „minor pathogens“ ist Corynebacterium bovis, er kommt zu 13 - 80 % in den bakteriologisch positiven Milchproben vor (BROOKS et al. 1983; PITKÄLÄ et al. 2004; CASSEL 2009).
Generell ist zu beobachten, dass die Infektionen mit „major pathogens“ in den letzten Jahren zurückgegangen sind, Infektionen durch „minor pathogens“ aber zugenommen haben (SCHUKKEN et al. 2003b).
Die Mastitiserreger lassen in den Laktationsstadien eine unterschiedliche Verteilung erkennen. Zum Zeitpunkt der Abkalbung ist der Hauptverursacher einer Neuinfektion der Milchdrüse Str. uberis, danach folgen koliforme Keime (BERRY u. HILLERTON 2002; OLDE RIEKERINK et al. 2007). Am Ende der Laktation werden erneut mehr Str.-uberis-Infektionen gefunden. Gleiches gilt für St. aureus und Str. dysgalactiae (ØSTERÅS et al. 2006; TENHAGEN et al. 2006).
Des Weiteren ist bei den Mastitiserregern ein saisonales Auftreten zu beobachten (ØSTERÅS et al. 2006). Das Auftreten von St. aureus und Str. uberis und einer klinischen Mastitis ist am häufigsten, während die Kühe auf der Weide gehalten werden. Für Str. dysgalactiae und CNS gilt das Gleiche für das Ende der Stallperiode (ØSTERÅS et al. 2006; OLDE RIEKERINK et al. 2007). Escherichia coli verursacht deutlich mehr klinische Mastitiden während der Sommermonate (OLDE RIEKERINK et al. 2007).
Erreger gelegentlicher Mastitiden sind unter anderem Mycoplasma spp., Trueperella pyogenes, Pasteurella spp. oder Hefen (WILSON et al. 1997; ERICSSON UNNERSTAD et al. 2009).
Staphylococcus aureus
St. aureus ist ein kuhassoziierter Erreger, der in infizierten Eutern, auf besiedelten Zitzen oder in Zitzenverletzungen vorkommt. Die Übertragung findet während des Melkens durch die Hände des Melkers, das Melkgeschirr oder mehrfach verwendetes Euterpapier statt. Der Keim verursacht meist eine chronische Infektion von langer Dauer, bei der eine antibiotische Therapie oftmals fehlschlägt (BRAMLEY u. DODD 1984; BRAY u. SHEARER 2008).
Streptococcus agalactiae
Hierbei handelt es sich ebenfalls um einen kuhassoziierten Keim, der in infizierten Eutern vorkommt und in der Umwelt nicht lange überlebt (BRAY u. SHEARER 2008).
Str. agalactiae verursacht eine Infektion von kürzerer Dauer als St. aureus, ist meist akuter Natur und kann gut durch eine intramammäre Therapie bekämpft werden (BRAMLEY u. DODD 1984).
Streptococcus dysgalactiae
Dieser ubiquitäre Keim wird während des Melkens, aber auch während der Zwischenmelkzeiten übertragen. Ein gehäufteres Auftreten ist bei vorhandenen Zitzenverletzungen zu beobachten. Trockenstehende Milchkühe und Färsen sind besonders betroffen (BRAMLEY u. DODD 1984; BRAY u. SHEARER 2008).
Streptococcus uberis
Str. uberis ist ein weit verbreiteter Umweltkeim und löst eine meist akute Mastitis aus.
Der Keim ist eine der gängigsten Ursachen für Neuinfektionen während der Trockenstehphase. Er verursacht einen starken Anstieg der somatischen Zellzahl (BRAMLEY u. DODD 1984; BRAY u. SHEARER 2008).
Koliforme Keime
Koliforme Keime sind unter eingestallten Tieren in der Frühlaktation oftmals ein Problem. Sie rufen sowohl perakute bis akute klinische Mastitiden, meist von kurzer Dauer, als auch Todesfälle durch Endotoxämien hervor. Am häufigsten wird E. coli als Verursacher umweltbedingter Mastitiden aus Mastitisproben isoliert. Es besteht ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten koliformer Mastitiden und mit koliformen Keimen verunreinigtem Liegeboxenmaterial (BRAMLEY u. DODD 1984; BRAY u.
SHEARER 2008).
2.2.4 Infektionswege der bovinen Milchdrüse
Mastitiserreger rufen auf unterschiedlichen Wegen in der bovinen Milchdrüse eine Infektion hervor. Einerseits sind sie in der Lage, auf galaktogenem Weg das Euter zu befallen, indem sie durch den Strichkanal eindringen. Andererseits können Erreger wie z.B. Mycoplasmen auf hämatogenem Weg eindringen, indem sie die Blut-Euter- Schranke passieren. Eine Besiedlung auf lymphogenem Weg ist für Bakterien wie Mycoplasmen ebenfalls möglich (BRAY u. SHEARER 2008).
Eine Euterinfektion startet in der Regel mit der Kontamination der Zitze einer empfänglichen Milchdrüse mit einem pathogenen Erreger. Dieser Erreger penetriert dann den Strichkanal und etabliert sich im Folgenden in den Zisternen, den Milchgängen oder im Drüsengewebe des Euters (BRAMLEY u. DODD 1984).
Mastitiserreger lagern sich vornehmlich an die epitheliale Auskleidung der Milchgänge an, da sie dort vermehrt Zellen mit unregelmäßiger Oberfläche vorfinden, an denen sie sich anheften können. Diese Zellen finden sich weniger in der Drüsen- oder Zitzenzisterne, wodurch mehr Mastitiserreger gefunden werden, je weiter man in das Eutergewebe vordringt (FROST et al. 1977).
2.2.5 Risikofaktoren
Vielfältige Risikofaktoren wirken begünstigend auf die Manifestation von
Hierzu zählen äußere Faktoren wie saisonale Schwankungen der Temperatur und Luftfeuchte, ganzjährige Stallhaltung, Haltung auf Tiefstreu, Beschaffenheit der Liegeboxeneinstreu, Fütterung, Entmistungsintervalle, Ektoparasitenbefall oder auch der Keimdruck der Umwelt (BRAMLEY u. DODD 1984; SMITH et al. 1985; ERSKINE et al. 1988; SCHUKKEN et al. 1993; PEELER et al. 2000b; DVG 2002; GREEN et al.
2002; OLDE RIEKERINK et al. 2007).
Weiterhin haben technische Aspekte sehr großen Einfluss auf die Eutergesundheit, besonders im Hinblick auf die Melktechnik. Fehlerhafte Melkmaschineneinstellungen, Melkvakuumschwankungen, Rückfluss oder ungleiche Pulsatoreneinstellungen wirken sich immer negativ aus und fördern eine Verbreitung von Mastitiserregern unter den Kühen (BRAMLEY u. DODD 1984; PEELER et al. 2000b).
Weitere Komponenten ergeben sich aus einer mangelhaften Hygiene während und nach dem Melken. Unterlassene Einhaltung einer Melkreihenfolge, Mehrfachbenutzungen von Eutertüchern, nicht durchgeführte Zitzendesinfektion nach dem Melken, Fehlen einer Melkzeugzwischendesinfektion oder Melken ohne Einmalhandschuhe erhöht die Erregerexposition der Zitze (BRAMLEY u. DODD 1984; OLIVER et al. 1990; BRADLEY 2002; DVG 2002).
Der personelle Faktor hat einen ebenso großen Einfluss auf die Eutergesundheit, da sich die hier festgelegten Managemententscheidungen umfassend auf die gesamte Milchviehherde auswirken. Als Beispiel sei hier eine Risikominimierung durch die Etablierung einer antibiotischen Therapie zum Trockenstellen der Milchkühe und durch die Dauer der Trockenstehperiode genannt (BRAMLEY u. DODD 1984;
SCHUKKEN et al. 1993; PEELER et al. 2000b; BERRY u. HILLERTON 2002).
Zudem stellen individuelle Gesichtspunkte auf Einzeltierebene wichtige Risikofaktoren dar. Rasse, Alter, Laktationsstadium, Anzahl der Laktationen, Integrität des Strichkanals, Zitzenverletzungen oder Traumata, Zellgehalt der Milch, Status des Immunsystems, Vorhandensein von Abwehrzellen oder die Lokalisation einer Infektion im Vorder- oder Hintereuter sind nur einige der komplex zusammenhängenden Merkmale (BRAMLEY u. DODD 1984; SMITH et al. 1985;
BARKEMA et al. 1998; BRADLEY 2002; GREEN et al. 2002; RAINARD u. RIOLLET
2003; PITKÄLÄ et al. 2004; OLDE RIEKERINK et al. 2007; ERICSSON UNNERSTAD et al. 2009; SAMPIMON et al. 2009; SCHUKKEN et al. 2009).
Die Spezies der beteiligten Erreger, deren Virulenzfaktoren und Pathogenität dürfen bei der Risikobeurteilung nicht fehlen (BRAMLEY u. DODD 1984; OLIVER et al.
1990; PEELER et al. 2000b).
2.3 Corynebacterium bovis
2.3.1 Eigenschaften des Genus Corynebacterium
Als coryneforme Bakterien werden im Allgemeinen aerob wachsende, Gram-positive, unregelmäßig geformte oder keulenförmige, nicht-sporenbildende, nicht-partiell säurefeste, unbewegliche, kurze Stäbchen bezeichnet. Sie treten einzeln, palisaden- oder v-förmig auf. Die typischen Kolonien wachsen langsam, sind klein, leicht konvex, rau und weißlich gefärbt (MURRAY et al. 1986; FERNANDEZ- GARAYZABAL et al. 1997; FUNKE et al. 1997).
Das Genus Corynebacterium (C.) ist heterogen und umfasst derzeit mehr als 60 Spezies, die aus humanen und tierischen Proben isoliert wurden (KHAMIS et al.
2004).
Biochemisch lassen sich verschiedene Charakteristika bei den Corynebakterien nachweisen: Sie sind Katalase-positiv und zeigen keine Hämolyse beim Wachstum auf Blutagar (MURRAY et al. 1986; FERNANDEZ-GARAYZABAL et al. 1997;
FUNKE et al. 1997). Die meisten Spezies produzieren aus den Zuckern Glucose, Maltose, Saccharose, Mannitol und Xylose Säure (Tabelle 3: Charakteristika der Speziesdifferenzierung) (MURRAY et al. 1986; FUNKE et al. 1997).
Die Zellwand der Corynebakterien weist charakteristische Merkmale auf. Zu deren Bestandteilen zählen meso-Diaminopimelinsäure, dihydrogeniertes Menachinon und kurzkettige Mycolsäuren mit 22-36 Kohlenstoffatomen. Die wichtigsten Zellwand- Zucker sind Arabinose und Galaktose (MURRAY et al. 1986; FUNKE et al. 1997).
Die Basenzusammensetzung der DNS besteht zu 51-63 mol % aus Guanin und Cytosin (G+C) (MURRAY et al. 1986).
Zur Identifizierung von coryneformen Bakterien im Allgemeinen werden Gramfärbung, Koloniegröße, Pigmentation, Koloniegeruch und das Vorhandensein oder Fehlen einer Hämolyse herangezogen (FUNKE et al. 1997).
Als Schlüsselreaktionen für die Differenzierung von Corynebakterien auf biochemischer Ebene gelten Katalase, fermentativer und oxidativer Metabolismus, Beweglichkeit, sowie Nitratreduktion, Ureaseproduktion, Äsculinhydrolyse, Säureproduktion aus verschiedenen Zuckern und der CAMP-Test. Diese aussagekräftigen Reaktionen können mittlerweile durch kommerziell erhältliche Testsysteme ermittelt werden (FUNKE et al. 1997).
Corynebakterien können in zwei Subgruppen gegliedert werden, eine lipophile und eine nicht-lipophile Gruppe (FUNKE et al. 1997). Die lipophilen Corynebakterien wachsen langsamer als die nicht-lipophilen. Ihr Wachstum wird durch Zugabe von Lipiden in das Nährmedium, wie z.B. Tween 80 in Anteilen von 0,1 bis 1 %, gefördert. Erst dadurch werden größere Kolonien gebildet (SMITH 1970; OLIVER u.
JUNEJA 1990; FUNKE et al. 1997).
Zur lipophilen Subgruppe gehören unter anderem C. bovis, C. jeikeium, C.
urealyticum (FUNKE et al. 1997; HUXLEY et al. 2004), ebenso wie C. mastitidis (HOMMEZ et al. 1999). C. bovis zählt bei dieser Subgruppe zu den am häufigsten isolierten Organismen (WATTS et al. 2001).
Der nicht-lipophilen Subgruppe sind beispielsweise C. amycolatum, C. ulcerans, C.
pseudotuberculosis, C. xerosis, C. argentoratense, C. auris und C. minutissimum zuzurechnen (FUNKE et al. 1997; HOMMEZ et al. 1999).
Corynebakterien sind in ihren Ernährungsgewohnheiten anspruchsvolle Bakterien.
Sie benötigen für ihr Wachstum Vitamine, Aminosäuren, Purine und Pyrimidine. Die Zugabe von Serum oder Blut in 5-10 % Anteilen zum Nährmedium stellt generell alle für das Wachstum nötigen Substanzen zur Verfügung. Die Bebrütungstemperatur liegt für dieses Genus zwischen 30 und 37° C, bei einer Bebrütungsdauer von 24-48 Stunden (MURRAY et al. 1986; FUNKE et al. 1997). Essentiell für das Wachstum von Corynebacterium spp. ist die Anwesenheit der langkettigen C18 Ölsäure,
unabhängig von der cis-, trans- oder iso-Stellung (SMITH 1970), was durch die Zugabe von Tween 80 zum Nährmedium gewährleistet wird (FUNKE et al. 1997).
Tabelle 3: Charakteristika der Speziesdifferenzierung einiger Mitglieder des Genus Corynebacterium, modifiziert nach (MURRAY et al. (1986); HOLT et al. (1994)
C. bovis C. jeikeium C. urealyticum C. striatum C. amycolatum C. afermentans C. argentoratense C. auris C. propinquum C. xerosis C. renale C. cystitidis C. diphteriae C. pseudotuberculosis C. pseudodiphteriticum C. kutscheri C. pilosum C. mycetiodes C. flavescens C. glutamicum
Säureproduktion aus:
Glucose + + - + + - + - - + + + + + - + + + + +
Arabinose d - ND - - ND ND ND ND - - - + d - - - - - -
Xylose - ND - - - - - - - - - + - - - - - - - -
Rhamnose - - ND - - ND ND ND ND - - - + - - - - ND - -
Fructose + - ND + + ND ND ND ND + + + + + - + + ND + +
Galaktose + + ND d - ND ND ND ND + - - + + - - - - + -
Mannose - - - + + - - - - + + - + + - + + - + +
Laktose d - ND d - ND ND ND ND - - - - - - - - - - -
Maltose + d - + + - - - - - d + + + - + + - - +
Saccharose - - - - d - - - - + - - - d - + - ND - +
Trehalose d - ND d d ND ND ND ND - d + - - - d + d - +
Raffinose - - ND - - ND ND ND ND - - - d - - - - - - -
Salicin - - ND - - ND ND ND ND + - - + - - + - ND - -
Dextrin d - ND + ND ND ND ND ND - + + + d - + + - - -
Stärke - - ND + - ND ND ND ND - - + d - - + + ND - -
Hydrolyse von:
Äskulin - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Hippurat + ND ND + d ND ND ND ND + + + - - + + + ND - +
Gelantineverflüssigung - ND ND d ND ND ND ND - - - - d - - - - - -
Urease - - + - d - - - - - + + - + + + + - - +
Phosphatase + - ND + ND ND ND ND ND - - - - - - - - + - ND Zersetzung von Tyrosin - - ND + - ND ND ND ND - - - - - - - - ND ND ND Pyrazinamidase + ND + ND ND + + + v + + + - - + + + ND - ND
Methylrot - - ND + + ND ND ND ND - - - + + - - - - + +
Caseinverdauung - - ND - - ND ND ND ND - + - - - - - - ND ND - Nitratreduktion - - - - ND - - - + + - - + d + + + - - + Anwesenheit von
Tuberculostearinsäure + ND ND ND ND ND ND ND ND - - ND - - - - ND - - - Geißelmorphologie - ND ND - ND ND ND ND ND - - - - - - - - - - - (+) = 90 % der Stämme oder mehr positiv, (-) = 90 % der Stämme oder mehr negativ, (ND) = nicht definiert, (d) = 11-89 % der Stämme positiv, (v) = variabel
2.3.2 Corynebacterium bovis
Corynebacterium bovis zählt zu den langsam wachsenden, anspruchsvollen Bakterien (MARSHALL u. MISHRA 1965) und stammt aus aseptisch gewonnener boviner Milch (MURRAY et al. 1986; FUNKE et al. 1997).
Es ist ein unregelmäßig geformtes, keulenförmiges, Gram-positives Stäbchen von 0,5-0,7 x 2,5-3,0 µm Größe. Die Bakterien liegen oftmals in Paaren oder im Winkel zueinander. Die kleinen Kolonien wachsen unter aeroben Bedingungen auf Tween 80 (0,1 %) angereicherten Nährböden weiß- bis creme-farben, rund, leicht glänzend und sind im Durchmesser 1-2 mm groß (JAYNE-WILLIAMS u. SKERMAN 1966; BLACK et al. 1972b; BROOKS u. BARNUM 1984c; MURRAY et al. 1986). Sie benötigen 48 Stunden, um ausreichend zu wachsen (BERRY u. HILLERTON 2002;
DVG 2009; SAMPIMON et al. 2009).
Abbildung 1: Gram-gefärbter Kulturausstrich von C. bovis
Die biochemischen Reaktionen unterscheiden sich nur geringfügig von den anderen Spezies des Genus, so ist C. bovis im Gegensatz zu den üblichen Genusmerkmalen Oxidase-positiv. Die Katalasereaktion ist positiv (BROOKS u. BARNUM 1984c).
Dieser Keim fermentiert Glucose, Fruktose, Maltose und Glycerol (FUNKE et al.
1997) und ist nicht-hämolytisch (JAYNE-WILLIAMS u. SKERMAN 1966; LEVAN et al. 1985).
Wie bei allen Corynebakterien basieren auch hier die Zellwand-Peptidoglykane auf meso-Diaminopimelinsäure. Kurzkettige Mycolsäuren mit 22-32 Kohlenstoffatomen
sind vorhanden (COLLINS et al 1982). Die wichtigsten Zellwand-Zucker sind Arabinose und Galaktose (CUMMINS 1971; MURRAY et al. 1986). In der Zellwand von C. bovis sind auch bedeutsame Mengen der Fettsäure Tuberculostearinsäure (TBSA, 10-Methyl-Octadecansäure) enthalten, die der Keim bereits in Anwesenheit von 0,01 % Tween 80 bildet (MURRAY et al. 1986; FUNKE et al. 1997). Das Bakterium beinhaltet zudem große Mengen an Octadecen- und 10- Methyloctadecensäure (COLLINS et al. 1982). C. bovis zählt trotz seiner ungewöhnlichen kurzkettigen Mycolsäure-Struktur zu den Corynebakterien und unterscheidet sich somit von allen zugehörigen Bakterien dieses Genus (COLLINS et al. 1982; MURRAY et al. 1986; FUNKE et al. 1997). Ferner besitzt C. bovis im Gegensatz zu anderen Corynebakterien eine kleine Anzahl von einfach ungesättigten Fettsäuren (COLLINS et al. 1982).
Die Basenzusammensetzung der DNS liegt mit 67,8 – 69,7 mol % für Guanin und Cytosin etwas über dem Durchschnitt für das Genus Corynebacterium (MURRAY et al. 1986).
Die Auswirkungen einer C. bovis bedingten Infektion auf den lebenden Organismus und die Milchdrüse des Rindes umfassen unter anderem einen Anstieg der somatischen Zellzahl (PANKEY et al. 1985; NGATIA et al. 1991; SCHUKKEN et al.
2009), eine milde, entzündliche Reaktion des Eutergewebes (BLACK et al. 1972a;
PANKEY et al. 1985) und einen leichten Anstieg der Leukozyten in der Milch (BLACK et al. 1972a). Allerdings ist C. bovis hoch infektiös und verbreitet sich sehr schnell in einem Milchviehbestand (BRAMLEY et al. 1976; PANKEY et al. 1985). Er ist ein Kommensale im Rindereuter und verursacht Mastitiden (MURRAY et al. 1986;
FUNKE et al. 1997). Eine geeignete Bekämpfungsmaßnahme, um eine Verbreitung im Bestand zu unterbinden, ist in erster Linie die Zitzendesinfektion nach dem Melken. Eine Elimination des Erregers kann größtenteils durch Trockenstellen der Kühe unter antibiotischem Schutz erfolgen (BRAMLEY et al. 1976).
2.3.3 Kultivierung von Corynebakterien
Die Kultivierung von C. bovis ist schwierig (WATTS u. ROSSBACH 2000). Da C.
bovis zur lipophilen Subgruppe gehört, benötigen diese Bakterien für ihr Wachstum freie Fettsäuren, die beispielsweise durch die Zugabe von Tween 80 oder anderen Lipidquellen zum Nährmedium bereitgestellt werden (OLIVER u. JUNEJA 1990;
FUNKE et al. 1997). Tween 80 kann dem entsprechenden Medium noch vor der Sterilisation (121° C, 15 min) zugesetzt werden (JAYNE-WILLIAMS u. SKERMAN 1966), ohne dass das Medium negativ beeinflusst wird. Dieses Supplement hat entscheidenden Einfluss auf die Koloniegröße von Corynebakterien. Auf Nährböden, die lediglich mit Blut angereichert sind, weisen die Kolonien eine deutlich geringere Größe auf als auf solchen, denen Tween 80 zugesetzt wurde (WATTS et al. 2000).
Tween 80
Tween 80 wird auch Polysorbat 80 oder E433 genannt. Es besteht zu 58-85 % aus Ölsäure, der Rest setzt sich hauptsächlich aus Linol- (≤18 %), Palmitin- (≤16 %) und Stearinsäure (≤6 %) zusammen (MERCK 2007; SIGMA-ALDRICH(UK) 2010).
Die sirupartige Flüssigkeit ist wasserlöslich, gelb und geruchlos. Sie wird als Lösungsmittel und Emulgator in Kosmetika, Arzneimitteln, Futtermitteln und Lebensmitteln eingesetzt.
In der folgenden Tabelle 4 sind die Kultivierungsverfahren von C. bovis verschiedener Autoren dargestellt.
Tabelle 4: Kultivierungsverfahren von C. bovis verschiedener Autoren
k. A.= keine Angabe
Autor Nährboden Supplement
Vol.%
Supple- ment
Bebrü- tungs- dauer (h)
Bebrü- tungs- tempera-
tur (°C)
(BERRY u. HILLERTON 2002) Blut - Agar Tween 80 1 48 35-37
(SAMPIMON et al. 2009) Blut - Agar Schafblut 6 48 37
(WATTS et al. 2000) Tryptikase – Soja - Agar
Schafblut Tween 80
5 1
k. A. k.A.
(EBERHART et al. 1983) Tryptikase – Soja - Agar
gewaschene bovine Erythrozyten
5 48 37
(LEVAN et al. 1985) Tryptikase – Soja - Agar
gewaschene bovine Erythrozyten Tween 80
5
10ppm
48 37
(BLACK et al. 1972b) Tryptikase – Soja - Agar
defibriniertes Rinderblut
5 48 37
(WATTS u. ROSSBACH 2000) Tryptikase – Soja - Agar
Schafblut Tween 80
5 1
24 35-37
(HARMON et al. 1986; OLIVER u. JUNEJA 1990; BERNARD et
al. 2002)
Brain– Heart–
Infusion- Agar
Tween 80 0,1- 1 72 37
(OLIVER et al. 1990) Brain– Heart–
Infusion- Agar
defibriniertes Schafblut Hefeextrakt Pferdeblut Tween 80
5 1 1 1
48 37
(DOANE et al. 1987) Brain– Heart–
Infusion- Agar
defibriniertes Schafblut Hefeextrakt Pferdeblut Tween 80
5 1 1 0,1
72 37
(BROOKS u. BARNUM 1984c)
Brain– Heart–
Infusion- Bouillon
Tween 80 0,1 48 37
(ANDERSON et al. 1985) Hefe- Glucose- Tween- Agar
Tween 80 0,25 48 30
(EADY et al. 2000) Direct- Sensitest- Agar
steriles defibriniertes Pferdeblut Tween 80
5
0,1
k.A. k.A.
(NGATIA et al. 1991)
Äskulin- Rinderblut-
Agar
k.A. k.A. 48 37
(PITKÄLÄ et al. 2004) Äskulin- Agar k.A. k.A. 48 37
2.3.4 Speziesdifferenzierung von Corynebacterium bovis
Aseptisch gewonnene Milchproben werden auf Nährböden ausgestrichen und für 48 Stunden aerob bei 37° C bebrütet (LEVAN et al. 1985; NGATIA et al. 1991; WILSON et al. 1997). Sofern in den Proben Corynebakterien vorkommen, werden sie durch Koloniemorphologie, Gramfärbung, Hämolysinproduktion und Katalase-Reaktion identifiziert. Auch der Effekt von Lipiden auf das Bakterienwachstum wird zur Identifizierung herangezogen. Lipophile Bakterien, wie C. bovis, zeigen verbessertes Koloniewachstum auf Nährböden, die mit Tween 80 supplementiert wurden (OLIVER et al. 1990; WATTS et al. 2000; HUXLEY et al. 2004).
In manchen Fällen versagt die herkömmliche, kulturelle Anzucht von Corynebakterien. Hier kann man sich die Identifikation mittels einer real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) zu Hilfe nehmen. Für die nötige DNS Extraktion aus den Bakterien wird deren Zellwand mechanisch oder enzymatisch zerstört, die enthaltenen DNS von den Zellwandbestandteilen gereinigt und zentrifugiert. Für die anschließende PCR wird die DNS enzymatisch an bestimmten Stellen geschnitten, denaturiert, hybridisiert und polymerisiert, so dass sie mittels Gelelektrophorese dargestellt werden kann (TAPONEN et al. 2009).
Auf Speziesebene wird eine Identifizierung von C. bovis durch biochemische Reaktionen und Fermentationsprofile erreicht (FUNKE et al. 1997). Dafür gibt es kommerziell erhältliche Testkits (FUNKE et al. 1997; WATTS et al. 2000). Das api®- Coryne-System liefert hier beispielsweise zu 88 % zuverlässige Testergebnisse (WATTS et al. 2000).
Eine weitere Möglichkeit der Speziesidentifikation bietet die Analyse der 16S rRNA Gensequenz. Hier wird die bereits transkribierte genetische Information (RNA) von Corynebakterien mittels verschiedener Restriktionsenzyme in ihre Gensequenzen zerlegt, wobei die 16S rRNA Gensequenz eine besondere Rolle spielt. Diese Gensequenz ist entschlüsselt und liegt abrufbar für verschiedene lipophile Corynebakterien-Spezies in einer Datenbank vor. Mittels einer PCR und anschließender Gelelektrophorese werden die 16S rRNA Sequenzen sichtbar gemacht. Das Ergebnis kann nun mit der Datenbank verglichen und eine
Speziesdifferenzierung von Corynebakterien vorgenommen werden (FUNKE et al.
1997; WATTS et al. 2000; HUXLEY et al. 2004). Dies ist die Methode der Wahl, um Corynebakterien-Spezies sicher zu identifizieren, jedoch ist sie noch sehr teuer (HUXLEY et al. 2004). Lipophile Corynebakterien, die in Milchproben vorkommen, wie C. bovis, können zu 97,2 % sicher identifiziert werden (HUXLEY et al. 2004).
Für die Routine-Diagnostik von Milchproben ist eine Diagnose von C. bovis basierend auf herkömmlichen Nachweismethoden (Kololniemorphologie, Gramfärbung etc.) allerdings ausreichend und liefert ähnliche Ergebnisse (WATTS et al. 2000; HUXLEY et al. 2004). In der Untersuchung von HUXLEY et al. (2004) waren nur 3 % der auf herkömmliche Weise untersuchten Proben falsch positiv. In einer Untersuchung von EBERHART et al. (1983) wurden Corynebakterien allein aufgrund ihrer Koloniemorphologie identifiziert. Auch BLACK et al. (1972a) und ERICSSON UNNERSTAD et al. (2009) züchteten Corynebakterien auf Blutagar an und nahmen die Identifizierung anhand der Koloniemorphologie vor.
Nach WATTS et al. (2000) sind die Mindest-Kriterien für eine Identifikation von C.
bovis Gramfärbung, Zellmorphologie, Katalaseproduktion, Nitratreduktion, ß- Galaktosidaseproduktion und verbessertes Koloniewachstum auf Tween 80 (1 %) supplementierten Nährböden.
Es scheint jedoch für die meisten Mastitisdiagnostik betreibenden Labore schwierig zu sein, C. bovis zu identifizieren (WATTS et al. 2000).
2.3.5 Vorkommen beim Tier
In den 1970ern war man noch der Überzeugung, dass es keinen ausreichenden Beweis dafür gebe, dass C. bovis ein euterpathogener Keim sei. Obwohl C. bovis so häufig vorkomme, gehöre er zu den Bakterien mit begrenzter klinischer Relevanz und werde lediglich mit subklinischen Erkrankungen in Verbindung gebracht (BLACK et al. 1972a; BRAMLEY et al. 1976). In den 1980ern wurde er als Kommensale bezeichnet, er werde häufig aus Milchproben isoliert, verursache aber nur selten eine Mastitis (BRAMLEY u. DODD 1984; BROOKS u. BARNUM 1984b). Mittlerweile wird
2010). Außerdem wird ihm durchaus die Fähigkeit zugesprochen, Ursache für die Entstehung von Mastitiden zu sein, da er des Öfteren bei klinischen Euterentzündungen nachgewiesen wurde (SMITH et al. 1985; WATTS et al. 2001;
HUXLEY et al. 2004).
Die Gruppe der Corynebakterien ist neben koagulase-negativen Staphylokokken das am häufigsten isolierte „minor pathogen“ (PITKÄLÄ et al. 2004; TENHAGEN et al.
2006). Die Mehrheit der lipophilen Corynebakterien, die von bovinen intramammären Infektionen isoliert werden, sind Corynebacterium bovis (WATTS et al. 2000). In verschiedenen Untersuchungen der letzten Jahre konnten Corynebakterien in 7 bis 85 % der Proben nachgewiesen werden (BROOKS et al. 1983; HARMON et al.
1986; HILLERTON et al. 1994; WILSON et al. 1997; DJABRI et al. 2002; PITKÄLÄ et al. 2004; TENHAGEN et al. 2006; CASSEL 2009). In der Untersuchung von PITKÄLÄ et al. (2004) war C. bovis sogar in 80 % der Betriebe zugegen.
Entgegen dieser Ergebnisse wiesen OSTERAS et al. (2006) in Norwegen keine C.- bovis-Infektionen nach. Auch schwedische Studien konnten nur ein gelegentliches Auftreten von Corynebacterien spp. zeigen (ERICSSON UNNERSTAD et al. 2009).
Die Anzahl der Laktationen und das Laktationsstadium haben Einfluss auf das Auftreten von C. bovis. Bereits Erstkalbinnen haben einen Anteil positiver Proben von etwa 15 %, wobei dieser mit zunehmenden Laktationen steigt (PITKÄLÄ et al.
2004). Außerdem kommt Corynebacterium bovis häufiger im späten Stadium der Laktation vor und bei Tieren, die bereits öfter gekalbt haben (BLACK et al. 1972a;
TENHAGEN et al. 2006). C. bovis persistiert während der gesamten Laktationsdauer, vermutlich weil Milch das optimale Milieu für bakterielles Wachstum darstellt (OLIVER u. JUNEJA 1990). Je älter die Kühe sind, desto häufiger wird der Keim aus Milchproben isoliert (BROOKS et al. 1983).
C.-bovis-Infektionen sind relativ persistent und verursachen eine geringgradige intramammäre Entzündung (HONKANEN-BUZALSKI et al. 1984). Bei einem Tier werden meist mehrere Viertel befallen (PITKÄLÄ et al. 2004), Vorder- und Hinterviertel gleichermaßen (HONKANEN-BUZALSKI et al. 1984).
2.3.6 Mastitis durch Corynebacterium bovis
Veränderungen im infizierten Eutergewebe
Euterviertel, die mit Corynebacterium bovis infiziert sind, haben eine höhere somatische Zellzahl als nicht infizierte Viertel (HONKANEN-BUZALSKI u. BRAMLEY 1984; HOGAN et al. 1988; NGATIA et al. 1991; SCHUKKEN et al. 2009). Der Zellgehalt bei infizierten Eutervierteln liegt im Mittel bei 105 000 Zellen/ml Milch (40 000 – 421 000 Zellen/ml) (DJABRI et al. 2002). Dies ist ebenfalls an einem deutlich positiven California Mastitis Test (CMT) zu erkennen (BROOKS et al. 1983).
C. bovis ist aufgrund seiner Eigenschaft, entzündliche Veränderungen in der Milchdrüse hervorzurufen, durchaus in der Lage, eine klinische Mastitis zu erzeugen (HONKANEN-BUZALSKI et al. 1984; NGATIA et al. 1991; PEELER et al. 2000b).
Diese Veränderungen betreffen vor allem die Zitzenzisterne und die Fürstenberg`sche Rosette. Dort finden sich Leukozyteninfiltrationen und eine Proliferation der Fibroblasten im subepithelialen Gewebe. In einigen Fällen zeigt sich fibrinozelluläres Exsudat im Zitzenlumen, degenerative Veränderungen im Epithel der Zitzenzisterne oder im Drüsengewebe. Es kann außerdem zu entzündlichen Veränderungen im Epithel der Ausführungsgänge der Milchdrüse oder der Alveolen kommen. Die Milch in den Alveolen ist zum Teil mit Leukozyten vermischt (NGATIA et al. 1991). Es sind dort mehr Makrophagen vorhanden als in nicht infizierten Vierteln. Des Weiteren finden sich in Bereichen des subepithelialen Stromas vermehrt Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen (SORDILLO et al. 1989).
Dennoch zeigen Euterviertel, die mit C. bovis infiziert sind, gegenüber nicht infizierten Vierteln keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der täglich ermolkenen Milchmenge, des Fett- oder Proteingehaltes (BROOKS et al. 1983;
LEVAN et al. 1985).
Elimination von C. bovis
Eine Elimination von C. bovis findet zu geringen Teilen spontan während der Trockenstehphase statt. Die Eliminationsrate beträgt 47 bis 64 % (HARMON et al.
Trockenstellertherapie unter Antibiotikaschutz können sogar bis zu 90 % der Infektionen geheilt werden (BRAMLEY et al. 1976; PANKEY et al. 1985).
Die Verwendung eines Dipmittels zur Zitzendesinfektion nach dem Melken trägt deutlich zur Verminderung der Zahl von C. bovis infizierten Eutervierteln bei (LEVAN et al. 1985; FORET et al. 2006). Das Zitzendippen kann eine Kolonisation des Strichkanals durch C. bovis zwar nicht verhindern (HONKANEN-BUZALSKI u.
BRAMLEY 1984), verhindert aber nahezu alle Neuinfektionen (HONKANEN- BUZALSKI et al. 1984).
Werden Zitzendippen und ein Trockenstellen unter Antibiotikaschutz kombiniert, kann C. bovis um 50 % innerhalb eines Jahres und um 90 % innerhalb von 3 Jahren reduziert werden (HONKANEN-BUZALSKI et al. 1984). Fehlen beide Maßnahmen, so ist eine hohe Infektionsrate zu erwarten (BROOKS et al. 1983; HARMON et al.
1986).
Protektiver Effekt von Corynebakterien?
In den letzten fünf Jahrzehnten wurden viele Untersuchungen durchgeführt, die sich damit beschäftigten, ob Corynebacterium bovis einen protektiven Effekt für die laktierende Milchdrüse im Hinblick auf Infektionen mit anderen Pathogenen hat.
HOGAN et al. (1988) sind der Meinung, dass es keinen protektiven Effekt von C.
bovis gegenüber Umweltkeimen gibt. Sie nennen dabei durch koliforme Keime und Streptokokken bedingte Infektionen. Außerdem sagen sie, dass „minor pathogens“
die Milchqualität beeinträchtigen, ohne eine nützliche Funktion zu erfüllen. Auch HONKANEN-BUZALSKI et al. (1984) fanden keinen Anhaltspunkt dafür, dass C.- bovis-infizierte Euterviertel resistenter gegenüber einer Infektion mit „major pathogens“ sind oder einen protektiven Effekt ausüben. DOANE et al. (1987) konnten keinen Effekt auf eine Infektion laktierender Kühe mit Streptococcus uberis nachweisen. In Studien während der Trockenstehphase konnte ebenfalls kein schützender Effekt von C. bovis auf Neuinfektionen mit koliformen Keimen oder Str.
uberis gezeigt werden. Hier wurde im Gegenteil eine erhöhte Neuinfektionsrate in unbehandelten Eutervierteln nachgewiesen, wenn diese zu Beginn der Trockensteh- phase mit C. bovis infiziert waren (BERRY u. HILLERTON 2002). Auch bei BROOKS
et al. (1983) gelang es nicht, einen Unterschied in der Infektionsrate mit anderen Pathogenen zwischen C. bovis infizierten und gesunden Eutervierteln festzustellen.
In Versuchen mit dem Mäusemodell schützte ein mit C. bovis infizierter Gesäugekomplex nicht vor einer Etablierung einer Infektion mit St. aureus (HONKANEN-BUZALSKI et al. 1985).
BLACK et al. (1972a) konnten hingegen zeigen, dass C. bovis infizierte Euterviertel einen signifikant geringeren Befall mit pathogenen Mastitiserregern aufwiesen als solche, die nicht infiziert waren. Dies ist womöglich einerseits auf die Aktivierung der körpereigenen Abwehr zurückzuführen, oder andererseits auf eine Behinderung der Passage anderer pathogener Erreger durch den Strichkanal (BLACK et al. 1972a).
Auch bei GREEN et al. (2002) zeigten C. bovis infizierte Viertel weniger klinische Mastitiden, sofern der Keim in der Phase nach der Abkalbung isoliert wurde. LAM et al. (1997) stellten dar, dass natürlich mit C. bovis infizierte Euterviertel die niedrigste Neuinfektionsrate mit „major pathogens“ haben. Außerdem wiesen sie einen signifikanten protektiven Effekt von natürlich mit C. bovis infizierten Eutervierteln vor Infektionen mit „major pathogens“ nach. Auch PANKEY et al. (1985) und BROOKS und BARNUM (1984c) machten für C. bovis infizierte Euterviertel einen protektiven Effekt gegenüber Superinfektionen mit St. aureus deutlich. Diese konnten um 53 % gesenkt werden.
Ein protektiver Effekt von C. bovis gegenüber der laktierenden Milchdrüse ist somit unterschiedlich und hängt von den Pathogenen ab, die die Mastitis verursachen (DOANE et al. 1987). Auch der Zeitpunkt der Infektion ist ein ganz entscheidender Faktor für den Erfolg/Misserfolg eines protektiven Effekts (GREEN et al. 2002).
Werden Euterviertel während der Trockenstehphase mit Corynebakterien infiziert, so werden diese vor folgenden Infektionen mit „major pathogens“ geschützt (BRADLEY 2002). Dies trifft vor allem auf Tag 0 bis 14 vor der Abkalbung zu (GREEN et al.
2002). Dagegen haben Euterviertel, die zum Zeitpunkt des Trockenstellens bereits mit Corynebacterium spp. infiziert sind, ein signifikant höheres Risiko, eine intramammäre Infektion zu entwickeln (BRADLEY 2002; GREEN et al. 2002). Sollte ein protektiver Effekt von C. bovis gegenüber anderen Infektionen bestehen, so ist
dieser nicht auf den Keim selbst, sondern vermutlich auf dessen anregenden Effekt auf die Produktion von Entzündungszellen zurückzuführen (NGATIA et al. 1991).
2.3.7 Besiedlungswege des Euters durch Corynebacterium bovis
C. bovis kolonisiert den Strichkanal (HONKANEN-BUZALSKI u. BRAMLEY 1984) und wird in erster Linie während des Melkens zwischen den Eutervierteln verbreitet, obwohl auch andere Infektionsquellen dazu beitragen (BRAMLEY u. DODD 1984).
Experimentell konnte das Bakterium das Euter aber auch durch Beimpfen des Strichkanals, der Zitzenzisterne oder der Zitzenoberfläche befallen (BROOKS u.
BARNUM 1984b; HONKANEN-BUZALSKI u. BRAMLEY 1984).
2.3.8 Lokalisation von Corynebacterium bovis im Euter
Wie bereits oben erwähnt, siedelt sich Corynebacterium bovis bevorzugt im unteren Bereich der Zitze, in der Nähe des Strichkanals oder direkt im Strichkanal an (BLACK et al. 1972a; BLACK et al. 1972b; BROOKS u. BARNUM 1984a; HONKANEN- BUZALSKI u. BRAMLEY 1984). Der Keim ruft aber auch Veränderungen der Fürstenberg`schen Rosette hervor und kann durchaus oberhalb des Strichkanals, in der Zitzenzisterne, vorkommen. In beiden Fällen heftet er sich an das Plattenepithel (FROST et al. 1977; PANKEY et al. 1985; NGATIA et al. 1991). Die höchsten Bakterienkonzentrationen sind jedoch im Bereich des distalen Drittels des Strichkanals zu finden (BLACK et al. 1972b; PANKEY et al. 1985).
BLACK et al. (1972b) fanden heraus, dass C. bovis selten oberhalb der Fürstenberg`schen Rosette etabliert ist, was sie auf das Fehlen von Keratin zurückführten. Histologisch kann nämlich beobachtet werden, dass C. bovis dicht an abgeschilferten keratinisierten Zellen des Plattenepithels des Strichkanals zu finden ist (PANKEY et al. 1985) und die Keratinschicht des Strichkanals selbst kolonisiert (BLACK et al. 1972b). Keratin enthält eine große Menge an Lipiden (ADAMS et al.
1961), die das Bakterium für sein Wachstum benötigt. Somit liegen im Strichkanal optimale Bedingungen für C. bovis vor.
Auch bei experimentell infizierten Mäusen konnte ein Tropismus von C. bovis zum Keratin der Zitzenhaut bzw. des Zitzenkanals nachgewiesen werden (HONKANEN- BUZALSKI et al. 1985).
In einer Untersuchung von SORDILLO et al. (1989) konnten in C. bovis infizierten Eutervierteln keine Coryneformen im oberhalb der Zitze gelegenem parenchymalen Gewebe gefunden werden, und es konnte auch keine Anheftung an das parenchymale Gewebe festgestellt werden.
Folglich kolonisiert C. bovis primär die Strichkanalregion (PANKEY et al. 1985), was zudem mit einer Stimulation des Wachstums des Keimes durch Lipide des Strichkanalgewebes zusammenhängt (BLACK et al. 1972b).
