Die hier erzielten MHK-Werte sind weder für die Festlegung definitiver „cut-off-Werte“
noch für die Festlegung von „breakpoints“ ausreichend. Dennoch kann anhand der MHK90-Werte die Aussage getroffen werden, dass die hier untersuchten Corynebakterien mit den üblichen, für die Indikation „Mastitis“ zugelassenen Präparaten in niedrigen Konzentrationen bekämpft werden können. So kann der Einsatz antimikrobieller Wirkstoffe optimiert werden, um letztendlich am Tier eine hohe Behandlungssicherheit bei vertretbaren Nebenwirkungen und geringe Resistenzentwicklung gegenüber den eingesetzten Wirkstoffen zu erzielen.
Für die Therapie der hier untersuchten Corynebakterien sind die Wirkstoffe Enrofloxacin, Ampicillin, Cefquinom, Erythromycin und die Kombination aus Penicillin/Framycetin am besten geeignet. Die Wirkstoffe Oxacillin und Trimethoprim/Sulfamethoxazol sind weniger geeignet.
6 Zusammenfassung
Gitta Buhr
Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration von elf in der Mastitistherapie angewandten Antibiotika gegen verschiedene Spezies der Gattung Corynebacterium.
Corynebakterien zählen zu den am häufigsten in Milchproben nachgewiesenen
„minor pathogens“, die mäßige Entzündungsreaktionen mit erhöhten Zellzahlen verursachen. In bis zu 80 % der Betriebe lassen sich bereits Corynebakterien nachweisen. Zudem sind die Infektionen relativ persistent und es sind meist mehrere Euterviertel betroffen. Befallen sind vor allem die Zitzenzisterne sowie der Strichkanal.
In dieser Studie soll das Resistenzverhalten verschiedener Spezies von Corynebakterien für unterschiedliche in der Mastitistherapie eingesetzte Antibiotika untersucht werden. Für viele Antibiotika sind bisher keine „breakpoints“ oder „cut off-Werte“ bekannt oder nur aus der Humanmedizin abgeleitet, so dass keine ausreichend sichere Aussage über das Resistenzverhalten von Corynebakterien beim Rind getroffen werden kann. Im Hinblick auf den richtigen und gezielten Einsatz von Antibiotika in der Mastitistherapie soll diese Arbeit einen Beitrag zur Festsetzung solcher „breakpoints“ oder „cut off-Werte“ leisten.
Hierzu wurden in einem vierwöchigen Probennahmezyklus in zwei- bis dreitägigen Abständen (12 Probentage) Viertelgemelksproben von Kühen einer konventionell gemolkenen Milchviehherde entnommen (durchschnittlich 40 Tiere, n= 1876 Milchproben). Zur Isolierung der Corynebakterien wurden die Milchproben bakteriologisch untersucht und eine Speziesdifferenzierung mittels api®-Coryne durchgeführt. Es konnten n=458 Corynebakterien isoliert werden, von denen etwa 80 % der Spezies Corynebacterium (C.) bovis (n=367), 11 % der Spezies C.
urealyticum (n=51) und 2 % der Spezies C. auris (n=10) angehörten. Die übrigen Spezies waren C. spp., C. striatum/amycolatum, C. jeikeium, C.
afermentans/coyleae, C. argentoratense, C. propinquum und C. Group G. Die unterschiedlichen Spezies wurden von n=31 verschiedenen Kühen entnommen, von denen 58,1 % mit mehr als einer coryneformen Spezies befallen waren.
Für die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) mittels Bouillonmikrodilution wurde eine spezielle Methode für die anspruchsvollen Corynebakterien entwickelt. Es war eine Bebrütungsdauer von 48 Std. nötig, der Nährboden wurde mit Tween 80 supplementiert und es wurde für jedes Isolat eine individuelle Einsaatdichte ermittelt. Die elf zu testenden Wirkstoffe waren auf einer vorgefertigten Mikrotiterplatte „Mastitis“ in unterschiedlichen Konzentrationen (0,063- 304 µg/ml) enthalten. Die minimale Hemmkonzentration, bei der 90 % der Isolate der verschiedenen Spezies in ihrem Wachstum gehemmt wurden (MHK90), lag zwischen 0,063 µg/ml und 8 µg/ml. Die niedrigste MHK90 wies C. urealyticum bei dem Antibiotikum Cefquinom auf, die höchste MHK90 hatte C. argentoratense (Trimethoprim/Sulfamethoxazol, 8 µg/ml). Alle Stämme zeigten bei der Wirkstoffkombination Trimethoprim/Sulfamethoxazol (0,5-8 µg/ml) und dem Penicillinase-festen ß-Lactamantibiotikum Oxacillin (1-4 µg/ml) hohe MHK90-Werte.
Im Gegensatz dazu war die MHK90 bei den Wirkstoffen Enrofloxacin, Erythromycin und Penicillin/Framycetin für alle Isolate gering (0,125-0,25 µg/ml).
Die hier getesteten Corynebakterien können mit den untersuchten Wirkstoffen für die Mastitisbekämpfung in niedrigen Konzentrationen in vitro inhibiert werden. Die erzielten Ergebnisse könnten unter Berücksichtigung weiterer erforderlicher Gesichtspunkte, wie beispielsweise den Bedingungen in vivo, einen Beitrag zur Festsetzung von definitiven „breakpoints“ oder „cut off-Werten“ leisten.
7 Summary
Gitta Buhr
Determination of the minimum inhibitory concentration of eleven antibiotics applied in mastitis therapy against different species of the genus Corynebacterium.
Corynebacteria belong to the most frequently detected “minor pathogens” in milk samples and cause moderate inflammatory reactions with higher somatic cell counts.
Up to 80 % of dairy farms are already positive for corynebacteria. The infection is relatively persistent and often more than one udder-quarter are affected. The teat canal and the teat-cistern are commonly affected.
In this study, the resistance pattern of different species of the genus Corynebacterium for different antibiotics used in mastitis therapy were investigated.
For antibiotics, no “breakpoints” or “cut off values” with respect to Corynebacterium are known or they are derived from human medicine. So, there is no sufficient knowledge about the resistance of bovine corynebacteria. With regard to the accurate and selective use of antibiotics in mastitis therapy, this study shall contribute to define clear “breakpoints” or “cut off values”.
Quarter milk samples from a conventionally milked dairy herd were taken in a four week lasting period in two to three days intervals (12 sample days, 40 cows on average, n=1876 milk samples). Corynebacteria were isolated via bacterial culture and species identification was achieved using api®-Coryne.
Of the n=458 isolated corynebacteria, 80 % belonged to the species Corynebacterium (C.) bovis (n=367), 11 % to the species C. urealyticum (n=51) and 2 % to the species C. auris (n=10). The other species were C. spp., C.
striatum/amycolatum, C. jeikeium, C. afermentans/coyleae, C. argentoratense, C.
propinquum and C. Group G. The different species were taken from n=31 different cows, from which 58.1 % were affected with more than one species.
A special method was developed for the not easily growing corynebacteria in order to define the minimal inhibitory concentration (MIC) by microdilution broth method. It was necessary to incubate the bacteria for 48 hours, to substitute the culture medium with Tween 80 and to find out individual seeding densities for every sample. The eleven antimicrobial drugs for this testing were determined using a pre-assembled microtiter plate at different concentrations (0.063- 304 µg/ml). The MIC that inhibited 90 % of the growth of the different species (MIC90) was between 0.063 µg/ml and 8 µg/ml. C. urealyticum revealed the lowest MIC90 with the antibiotic cefquinome, the
highest was found for C. argentoratense with trimethoprim/sulfamethoxazole (8 µg/ml). All strains had high MIC90 values within the drug combination of
trimethoprim/sulfamethoxazole (0.5-8 µg/ml) and the penicillinase-resistant ß-lactam-antibiotic oxacillin (1-4 µg/ml). On the opposite, the MIC90 of enrofloxacin, erythromycin and penicillin/framycetin was low for all isolates (0.125-0.25 µg/ml).
The corynebacteria tested in this thesis can be inhibited in vitro by the examined antibiotics against mastitis. Under consideration of other additional necessary aspects (e.g. in vivo situation), the achieved results might contribute to establish clear “breakpoints” or “cut off values” for Corynebacteria.