Vergleich der RTP1 Homologen auf genomischer Ebene

Sowohl das Uf-RTP1 Gen als auch das Us-RTP1 Gen wurden auf genomischer Ebene mit Hilfe der Primer-walking Methode sequenziert (2.9.3). Mit von der cDNA abgeleiteten Primern wurden die genomischen Sequenzen amplifiziert und anschließend sequenziert.

Die genomische Uf-RTP1 Sequenz wurde über eine Länge von 1.096 bp sequenziert. Bis auf einen kleinen Bereich von 9 bp am 5’ Ende, und 123 bp am 3’ Ende, wurde die Sequenz des Gens doppelsträngig ermittelt. Uf-RTP1 umfasst 1086 bp, einschließlich der Introns.

Die genomische Us-RTP1 Sequenz wurde über eine Länge von 1.513 bp sequenziert. Mit Introns umfasst das Us-RTP1 Gen 1202 bp. Die Sequenzierung lieferte zusätzlich Informa-tionen über einen Sequenzbereich 326 bp vor dem Transkriptionsstartpunkt und über 85 bp nach dem Stopcodon.

Die Sequenzdaten für die Uf-RTP1 Sequenz und die Us-RTP1 Sequenz wurden in der EMBL Datenbank unter folgenden „Accession numbers“ hinterlegt: AJ971426 (Uf-RTP1) und AJ971427 (Us-RTP1).

Die Amplifizierung und Sequenzierung der genomischen Sequenz von Ua-RTP1 erfolgte über

„nested PCR“ mit Hilfe degenerierter Primer, welche von den genomischen Sequenzen des Uf-RTP1 und des Us-RTP1 Gens abgeleitet wurden (Tabelle 2-11).

Es wurde ein 875 bp umfassender Bereich der genomischen Ua-RTP1 Sequenz ermittelt.

Bedingt durch die Auswahl der degenerierten Primer, bzw. wegen der Varianz der RTP1 Sequenzen im 5’ Bereich, war es nicht möglich die Sequenz des kompletten Ua-RTP1 Gens zu bestimmen. Durch Vergleich mit den Uf-RTP1 und Us-RTP1 Sequenzen zeigt sich jedoch,

dass zur vollständigen Ua-RTP1 Sequenz nur noch etwa 175 bp am 5’ Ende bis zum ATG und etwa 60 bp am 3’ Ende bis zum Stopcodon fehlen (siehe Anhang A).

Die genomischen Sequenzen von Uf-RTP1 und Us-RTP1 weisen mit 73,3% die höchste Identität unter den drei genomischen RTP1 Sequenzen auf. Die Us-RTP1 und die Ua-RTP1 Sequenzen sind zu 71,7% identisch und die Ua-RTP1 entspricht der Uf-RTP1 Sequenz in 70,6% (Tabelle 3-2). Für die Vergleiche wurden nur die Sequenzbereiche von Uf-RTP1 und Us-RTP1 herangezogen, für welche Sequenzinformation von Ua-RTP1 zur Verfügung steht.

3.1.1.1 Vergleich der Exon-Intron Struktur von RTP1

Ein Merkmal der meisten eukaryontischen Gene ist, dass sie durch ein oder mehrere Introns unterbrochen werden (Le Hir et al., 2003). An Hand der Exon-Intron Struktur eines Gens lassen sich Aussagen über die Herkunft dieses Gens machen. Außerdem ist bekannt, dass das Vorhandensein von Introns, das Expressionsprofil entscheidend beeinflusst (Le Hir et al., 2003). Aus diesen Gründen wurden bei den drei bekannten RTP1 Genen, die Lage und Größe einzelner Introns sowie ihre Splice-Sequenzen näher betrachtet und verglichen.

Die Lage der Introns wurde für Ua-RTP1 mittels der „GT-AG“ Regel (Saxonov et al., 2000) innerhalb der genomischen Sequenz bestimmt. Durch Vergleich mit den cDNA Sequenzen von Uf-RTP1 und Us-RTP1 wurde die abgeleitete cDNA Sequenz von Ua-RTP1 auf ihre Richtigkeit überprüft.

Abbildung 3-1 Übersicht über die Exon-Intron Struktur der chromosomalen RTP1 Sequenzen.

Das Sequenzalignment wurde mit dem Programm CLUSTAL W durchgeführt (Thompson et al., 1994). Gelb dargestellt sind die 6 Introns, grün eingezeichnet sind die Exons. Bereiche mit 1-50% Ähnlichkeit sind weiß, Bereiche mit 50-70% Ähnlichkeit blau, Bereiche mit 70-80% Ähnlichkeit orange und Bereiche mit 80-100%

Ähnlichkeit rot eingezeichnet. Bereiche in denen Deletionen auftreten sind grau eingezeichnet.

Bei den beiden vollständig bekannten RTP1 Genen, Uf-RTP1 und Us-RTP1 werden die 7 Exons durch 6 Introns unterbrochen, die sich in Lage und Länge entsprechen. Auch in der für Ua-RTP1 bekannten Sequenz stimmt die Lage der Introns 2-5 genau mit der, der beiden anderen RTP1 Vertreter überein.

Beim Vergleich der gesamten Intronsequenzen von Uf-RTP1 mit den Introns von Us-RTP1 und Ua-RTP1 wird deutlich, dass diese Bereiche sowohl in der Sequenz als auch in der Länge wesentlich weniger konserviert sind, als die proteinkodierenden Bereiche (Abbildung 3-1).

Tabelle 3-1 kann man entnehmen, dass die Exons 3, 4 und 5 identische Längen aufweisen,

TAG

ATG 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7

wohingegen die Exons 1, 2 und 6 leicht in den Längen zwischen den einzelnen Vertretern variieren.

Für den Vergleich der Ähnlichkeiten von RTP1 wurden für Bereiche, in welchen nur Informationen von Uf-RTP1 und Us-RTP1 zur Verfügung standen, die beiden Vertreter verglichen. War Sequenzinformation auch für Ua-RTP1 vorhanden, so wurde diese in den Ähnlichkeitsvergleich miteinbezogen. Die Ähnlichkeiten der Introns liegen zwischen 49 - 69%, die der Exons zwischen 70 - 92%. Innerhalb von Exon 2, dem längsten der sieben Exons, gibt es einen Sequenzabschnitt (Anhang A: ch Us-RTP1: 220-257, Abbildung 3-1:

grau schattierter Bereich), der nur in den Sequenzen Us-RTP1 und Ua-RTP1 vorhanden ist.

Die Sequenz dieses Abschnitts zeigt zudem bei Us-RTP1 und Ua-RTP1 nur eine sehr geringe Ähnlichkeit. Bereiche vor oder nach diesem Sequenzabschnitt innerhalb von Exon 2 zeigen vergleichbare Ähnlichkeiten zu Exon 1.

Die Introns aller bisher bei U. fabae untersuchter Gene folgen der „GT-AG“ Regel (siehe Tabelle 3-1), wie nahezu alle bekannten durch Spleissosomen gespleissten Introns (Saxonov et al., 2000). So wird auch für die Introns von Uf-RTP1 die „GT-AG“ Regel erfüllt. Die Introns der RTP1 Gene aus U. striatus und U. appendiculatus beginnen ebenfalls mit Guanin, gefolgt von Thymin und enden mit Adenin gefolgt von Guanin. Die dritte Base der 5’ Splice-Stelle des Introns variiert bei allen drei Vertretern zwischen Adenin, Guanin und Thymin, jedoch wird nie Cytosin verwendet. An der ersten Position der 3’ Splice-Stelle beobachtet man bei Uf-RTP1 und Ua-RTP1, dass bevorzugt Cytosin, aber auch Thymin verwendet wird.

Bei Us-RTP1 findet man nur Cytosin als erstes Nukleotid.

Der durchschnittliche GC-Gehalt ähnelt bei allen drei RTP1 Vertretern dem, der schon für andere Gene von U. fabae und U. striatus beschrieben wurde (Haerter, 2002) und liegt sowohl für Introns als auch Exons zwischen 41,4 und 47,1%. Nur Exon 5 hat bei den drei RTP1 Genen verglichen mit allen anderen Exons und Introns einen relativ niedrigen GC-Gehalt (27 - 39%) (Tabelle 3-1).

RTP1 Exon

Mittel der Länge und des GC-Anteils der Introns 69,5 ± 14,1 68,2 ± 10,5

Mittel der Länge und des GC-Anteils der Exons 93,9 ± 94,7 97,3 ± 92,1 63,4 ± 35,5

45,0 ± 6,9 41,4 ± 8,5 45,6 ± 4,9 Tabelle 3-1 Übersicht über die Exon-Intron Struktur der RTP1 Gene

RTP1 Gene bei Uromyces fabae (Uf-RTP1), Uromyces striatus (Us-RTP1) und Uromyces appendiculatus (Ua-RTP1). D= A, G, T; Y= C,T. Die Introns wurden hellgrau, Exons dunkelgrau hinterlegt. * Diese Werte beziehen sich auf die experimentell ermittelten Start- und Stopsequenzen.

3.1.1.2 Analyse der Kopienzahl von Uf-RTP1

Basierend auf dem Befund, dass bei einer EST Projektanalyse für Uf-RTP1 zwei Kopien gefunden wurden, welche sich in einer Punktmutation unterscheiden (Hempel, 2006), wurden in dieser Arbeit weitere Analysen zur Ermittlung der Kopienzahl unternommen. Mittels Southern Blot Analysen konnte Hempel (2006) in einer vorangegangenen Arbeit zeigen, dass sich die beiden Kopien von RTP1 in einem Nukleotid so unterscheiden, dass im einen Fall eine MunI Schnittstelle vorliegt im anderen aber nicht. Jedoch deuteten alle anderen ver-wendeten Enzyme auf ein „single copy gene“ hin.

Für die in dieser Arbeit beschriebenen Analysen der Kopienzahl wurde das Genom von U. fabae mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, wobei die Enzyme so ausgewählt wurden, dass sie kein-, oder einmal in der bekannten RTP1 Sequenz schneiden (Abbildung 3-2A). EcoRV sollte nicht und XhoI, HindIII und EcoRI sollten einmal schneiden. EcoRI fragmentiert das Genom im Bereich der Sonde, so dass man bei einer Kopie zwei Banden er-warten würde.

Es wurde zudem der Verdau mit MunI wiederholt. Da eine kürzere Sonde als in der Arbeit von Hempel (2006) für die Southern Blot Analysen verwendet wurde, sollten bei zwei Kopien des RTP1 Gens zwei Signale auftreten, da die Schnittstelle außerhalb des Bereichs der Sonde liegt.

Die Analysen erfolgten mit einer von der genomischen Uf-RTP1 Sequenz abgeleiteten, 553 bp langen, DIG-markierten Sonde.

Abbildung 3-2 Southern Blot Analyse zeigt zwei Kopien des Uf-RTP1 im U. fabae Genom.

A Schematische Übersicht über die Lage der Sonde und der Restriktionsschnittstellen auf dem Uf-RTP1 Gen.

Die Uf-RTP1 Sequenz ist hellgrau dargestellt. Die einzelnen Restriktionsschnittstellen wurden mit Pfeilen markiert.

B Southern Blot. Die Zahlen oben geben die Größe der Markerbanden wieder.

1 1086

ATG TAG

MunI 142 XhoI

148

HindIII 393

EcoRI 806I

528 Sonde 1081

A

B

Abbildung 3-2 B zeigt das Resultat der Hybridisierung. Der Verdau mit EcoRV, welches außerhalb des Gens schneidet, führte zu einer einzigen Bande und würde damit für eine Kopie des Gens sprechen. Ebenso der Verdau mit EcoRI, welches im Bereich der Sonde schneidet, und damit bei 2 Kopien im Genom zu 3 oder 4 Banden führt. MunI, XhoI und HindIII schneiden einmal in der Uf-RTP1 Sequenz, jedoch außerhalb des Bereichs der Sonde. Bei einer Kopie des Gens sollte also lediglich eine Bande beobachtet werden. In allen drei Fällen treten jedoch jeweils zwei Banden auf, was darauf hindeutet, dass RTP1 entweder in zwei Kopien im Genom von U. fabae vorliegt, oder in den beiden Kernen des dikaryontischen U. fabae jeweils eine Kopie von RTP1 vorliegt.