RTP1p, eine neue Familie amyloid- ähnlicher Proteine
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer.nat.)
im Fachbereich Biologie Universität Konstanz
Vorgelegt von
Ariane Christiane Kemen
Konstanz, im November 2006
Tag der mündlichen Prüfung: 27.04.2007 Referent: Prof. Dr. K. Mendgen Referent: Prof. Dr. P. Kroneck Referent: Prof. Dr. H. Deising
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL: http://www.ub.uni-konstanz.de/kops/volltexte/2007/3148/
URN: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-31486
Für Eric
„Der unermesslich reichen, stets sich erneuernden Natur gegenüber wird der Mensch, soweit er auch in der wissenschaftlichen Erkenntnis fortgeschritten sein mag, immer das sich wundernde Kind bleiben und muss sich stets auf neue Überraschungen gefasst machen.“
Max Planck (1858-1947)
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Kurt W. Mendgen für die Überlassung dieses interessanten Themas, die Möglichkeit, diese Arbeit am Lehrstuhl für Phytopathologie unter hervorragenden Bedingungen anzufertigen sowie für sein Interesse und seine Diskussions- bereitschaft, mit welchen er den Fortschritt dieser Arbeit begleitete.
Herrn Professor Dr. Kroneck danke ich für die Übernahme des Koreferats und für sein dem Thema entgegengebrachtes Interesse sowie für die wertvollen Diskussionen.
Mein herzlicher Dank gilt Herrn Dr. Ralf Vögele für die bereitwillige Unterstützung und Förderung, die mir während der gesamten Zeit als „Rusty“ zu Teil wurde. Ebenso danke ich ihm für die engagierte Vermittlung von Methoden, seine ständige Diskussionsbereitschaft, die Weitergabe der Freude an der Lehre sowie die kritische Durchsicht nicht nur dieses Manuskripts.
Herrn Prof. M. Hahn und MSc. Maryam Rafiqi von der Universität Kaiserslautern danke ich für die fruchtbare Kooperation und Diskussion.
Bei Prof. Dr. A. Bürkle und Prof. Dr. W. Welte, möchte ich mich für wertvolle Anregungen bedanken.
Besonderer Dank gilt auch allen Laborkollegen, für das freundschaftliche Arbeitsklima und die vielen kleinen und großen Hilfen, die zum Gelingen der vorliegenden Arbeit beigetragen haben. Vielen Dank für die nette Atmosphäre, die Kuchen, die Weihnachts- und Apfelfeste und unzählige schöne Gespräche.
Im Besonderen bedanke ich mich bei Herrn Dipl. Ing. Heinz Vahlenkamp für die Unter- stützung bei der Anfertigung der fluoreszenzmikroskopischen Bilder und bei Annette Schmid für die tatkräftige Unterstützung bei den Southern und Northern Blots sowie für unzählige kompetente Zellen. Frau Dr. Elisabeth Rehn danke ich herzlich für die Hilfe bei organi- satorischen Problemen und bei der Literaturrecherche.
In diesem Zusammenhang möchte ich auch den Mitarbeitern des botanischen Gartens für die Anzucht und Pflege der Pflanzen und den Mitarbeitern der TFA Konstanz für die Pflege und Immunisierung der Kaninchen danken.
sich mit der RTP1p Begeisterung anstecken ließ, und der ich viel Erfolg bei der Fortführung des Projekts wünsche.
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt. Der Universität Konstanz danke ich für die großzügige Förderung in Form eines Stipendiums.
Mein grenzenloser Dank gilt meiner Familie, insbesondere meinen Eltern, die mich in jeder Situation mit unermüdlichem Einsatz unterstützt und beraten haben, und ohne die mein sorgenfreies Studium und meine Promotion so nicht möglich gewesen wären. Auch meinen Schwiegereltern danke ich, die mir in allen Lebenslagen tatkräftig unter die Arme greifen.
Eric danke ich für seine liebevolle Geduld und Unterstützung, dafür dass er mir mit Rat und Tat zur Seite stand, und dass sich unsere Kooperation nicht nur auf das Laborleben be- schränkt.
PUBLIKATIONSLISTE
Haerter, A.C., and Voegele, R.T. (2004). A novel beta-glucosidase in Uromyces fabae: feast or fight? Curr Genet 45, 96-103
Kemen, E.*, Kemen, A.C.*, Rafiqi, M., Hempel, U., Mendgen, K., Hahn, M., and Voegele, R.T. (2005). Identification of a protein from rust fungi transferred from haustoria into infected plant cells. Mol Plant Microbe Interact 18, 1130-1139.
*Authors contributed equally to this work
Folgende Publikation befindet sich in Vorbereitung:
Kemen, E. *, Kemen, A.C. *, Voegele, R.T., and Mendgen, K. RTP1p: Rust Transferred Protein 1 - A protein with amyloid-like properties.
*Authors contributed equally to this work
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG... 1
1.1 Rostpilze... 1
1.2 Die Uredosporeninfektion ... 2
1.3 Die Rolle des Haustoriums bei der biotrophen Interaktion ... 5
1.4 Sekretierte Effektorproteine bei Pilzen und Oomyceten ... 7
1.5 Pilzliche Amyloide... 11
1.6 Zielsetzung dieser Arbeit... 13
2 MATERIAL UND METHODEN... 14
2.1 Verwendete Computerprogramme und Onlinedatenbanken... 14
2.2 Chemikalien... 15
2.3 Kulturmedien ... 15
2.3.1 Medien zur Kultivierung von Bakterien... 15
2.3.2 Medien zur Kultivierung von Hefen... 16
2.4 Verwendete Stämme ... 18
2.4.1 Bakterienstämme ... 18
2.4.2 Pichia pastoris-Stamm ... 18
2.5 Verwendete Plasmide... 18
2.6 Bakteriophagen ... 19
2.7 Pflanzen- und Pilzmaterial ... 19
2.7.1 Kultivierung und Inokulation von V. faba, V. unguiculata und P. vulgaris... 20
2.7.2 Kultivierung und Inokulation von M. sativa und M. truncatula... 20
2.7.3 Keimung von Uredosporen von Uromyces fabae... 20
2.7.4 Kultivierung von Sporen auf Polyethylenfolien ... 21
2.7.5 Haustorienisolierung aus U. fabae bzw. U. striatus infizierten Blättern ... 21
2.8 Immunisierung von Kaninchen... 23
2.9 Molekularbiologische Methoden... 23
2.9.1 DNA-Präparation und Reinigung ... 23
2.9.1.1 DNA-Präparation aus gekeimten U. fabae Sporen ... 23
2.9.1.2 DNA Extraktion aus infiziertem Blattmaterial ... 24
2.9.1.3 Plasmidpräparation ... 24
2.9.1.4 Reinigung von PCR Produkten, DNA aus Restriktionsansätzen ... 24
2.9.1.5 Reinigung von DNA aus Agarosegelen... 24
2.9.1.6 DNA Konzentrationsbestimmung... 24
2.9.2 RNA-Isolierung... 25
2.9.2.1 RNA-Isolierung aus mit U. fabae infizierten und nicht infizierten V. faba Blättern ... 25
2.9.2.2 RNA-Isolierung aus auf PE-Folie angezogenen Infektionsstrukturen von U. fabae... 25
2.9.2.3 RNA-Isolierung aus Haustorien, Sporen und gekeimten Sporen... 26
2.9.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... 26
2.9.3.1 Oligonukleotide ... 27
2.9.4 Kolonie-PCR ... 29
2.9.5 Mutagenese... 30
2.9.6 Sequenzierung von PCR Fragmenten... 30
2.9.7 Sequenzanalyse ... 31
2.9.7.1 Genomische Sequenzanalyse des Uf-RTP1 und des Us-RTP1... 31
2.9.7.2 Teilsequenzanalyse der genomischen Sequenz des Ua-RTP1... 31
2.9.7.3 Sequenzanalyse der cDNA von Us-RTP1... 32
2.9.8 Herstellung von DIG-markierten Sonden... 32
2.9.9 Agarose-Gelelektrophorese ... 32
2.9.9.1 Alkalische Agarosegele ... 32
2.9.9.2 Denaturierende Agarosegele... 33
2.9.10 Klonierung von DNA ... 33
2.9.10.1 Klonierung in Vektoren zur heterologen Expression in E. coli... 33
2.9.10.2 Klonierung in Vektoren zur heterologen Expression in P. pastoris... 34
2.9.10.3 Herstellung von Uf-RTP1p-GFP Fusionskonstrukten im heterologen System P. pastoris... 35
2.9.10.4 DNA Verdau durch Restriktionsenzyme ... 35
2.9.10.5 Ligation... 36
2.9.10.6 Herstellung kompetenter Zellen für Transformationen ... 36
2.9.10.7 Transformation von Bakterien und Hefen ... 37
2.9.11 Transfer von Nukleinsäuren auf Trägermembranen... 38
2.9.11.1 RNA-Transfer: Northern-Blot ... 38
2.9.11.2 DNA-Transfer: Southern Blot ... 38
2.9.11.3 DNA-Transfer: „Plaque lift Technik”... 39
2.9.12 Hybridisierungs- und Detektionsmethoden von DNA und RNA ... 39
2.10 Biochemische Methoden ... 40
2.10.1 Proteinextraktion aus infizierten Pflanzen... 40
2.10.1.1 Proteinextraktion unter denaturierenden Bedingungen... 40
2.10.1.2 Proteinextraktion unter schwach denaturierenden Bedingungen (ohne SDS und DTT)... 41
2.10.1.3 Proteinextraktion unter nicht denaturierenden Bedingungen... 41
2.10.2 Heterologe Expression in E. coli BL21(DE3) ... 42
2.10.3 Heterologe Proteinexpression in P. pastoris... 42
2.10.4 Proteinreinigung über Ni-NTA Affinitätschromatographie ... 43
2.10.4.1 Proteinreinigung unter denaturierenden Bedingungen ... 43
2.10.4.2 Proteinreinigung unter nativen Bedingungen über FPLC... 43
2.10.5 Säulenherstellung zur Affinitätschromatographie ... 45
2.10.6 Aufreinigung von RTP1p aus Pflanzenextrakten durch Affinitätschromatographie ... 45
2.10.7 Aufreinigung von Partnern durch Affinitätschromatographie... 46
2.10.8 Antikörperreinigung aus Seren mittels CNBr-aktivierter Sepharose 4B... 46
2.10.9 Proteinkonzentrationsbestimmung ... 47
2.10.10 Cross-Linking Assays... 47
2.10.11 Pelletionsversuch... 48
2.10.12 „Conversion“... 48
2.10.13 Proteinase K Versuche ... 49
2.10.13.1 Proteinase K Behandlung von heterologem ΠRTP1p... 49
2.10.13.2 Proteinase K Behandlung von nativem Uf-RTP1p ... 49
2.10.14 Deglykosylierung von Proteinproben... 49
2.10.15 SDS-PAGE... 50
2.10.16 Coomassie-Färbung... 51
2.10.17 Silberfärbung... 51
2.10.18 Western Blot Analysen... 51
2.10.19 N-terminale Sequenzbestimmung... 52
2.10.20 Far Western Analysen ... 52
2.10.21 Immuno-Co-Präzipitation... 53
2.11 Mikroskopische Methoden ... 54
2.11.1 Immunfluoreszenzmikroskopie ... 54
2.11.1.1 Chemische Fixierung von pflanzlichem Material... 54
2.11.1.2 Formaldehydfixierung von P. pastoris Zellen ... 54
2.11.1.3 Harzeinbettung, Polymerisation und Mikrotomie... 54
2.11.1.4 Präadsorption der verwendeten Seren... 55
2.11.1.5 Immunocytochemie ... 56
2.11.2 Fluoreszenzmikroskopie RTP1p–GFP–Fusionsprotein exprimierender P. pastoris Zellen ... 57
3 ERGEBNISSE ... 58
3.1 RTP1 Homologe in Rostpilzen ... 58
3.1.1 Vergleich der RTP1 Homologen auf genomischer Ebene ... 58
3.1.1.1 Vergleich der Exon-Intron Struktur von RTP1... 59
3.1.1.2 Analyse der Kopienzahl von Uf-RTP1... 62
3.1.2 Isolierung der vollständigen Us-RTP1 cDNA Sequenz... 63
3.1.3 Vergleich der RTP1 Homologen auf cDNA Ebene... 64
3.1.4 Die „codon usage“ der RTP1 Homologen... 65
3.1.5 Haustorienspezifische Expression von Uf-RTP1... 67
3.2 Analyse von RTP1p... 68
3.2.1 Vergleich von Uf-RTP1p, Us-RTP1p und Ua-RTP1p auf Proteinebene... 68
3.2.2 Strukturvergleich des N- und des C-Terminus von RTP1p... 70
3.2.2.1 Bedeutung des N- und des C-Terminus von RTP1p in P. pastoris... 71
3.2.3 Das Hydrophilizitätsprofil von RTP1p... 72
3.2.4 Immunologischer Nachweis von RTP1p... 73
3.2.4.1 Herstellung RTP1p spezifischer polyklonaler AK... 73
3.2.4.2 Immunocytologischer Nachweis von RTP1p ... 75
3.2.4.3 Immunologischer Nachweis von RTP1p Homologen in verschiedenen Wirt-Pathogen-Systemen. 78 3.3 Proteincharakterisierung von RTP1p durch heterologe Expression in P. pastoris... 79
3.3.1 Etablierung der ΠRTP1p Expression ... 79
3.3.2 Aufreinigung von ΠRTP1p über IMAC... 81
3.4 Die Rolle des RTP1p Sekretionssignals ... 82
3.5 Die N-terminale Prozessierung ... 85
3.5.1 N-terminale Prozessierung des heterologen Uf-RTP1p... 85
3.5.2 N-terminale Prozessierung des nativen Uf-RTP1p... 86
3.6 Die Rolle des potentiellen NLS von RTP1p... 88
3.6.1 Untersuchung der Funktionalität des Uf-RTP1p-NLS... 88
3.7 Die Glykosylierung von RTP1p ... 89
3.7.1 Untersuchung der Glykosylierung im nativen System ... 91
3.7.2 Untersuchung der Glykosylierung im heterologen System ... 92
3.7.3 Glykosylierungsmutanten... 93
3.8 Die Funktion der Disulfidbrücken bei RTP1p... 96
3.9 Analyse der Interaktion von RTP1p mit potentiellen Partnern... 97
3.9.1 Identifizierung potentieller Partner über Far Western Blot Analysen ... 98
3.9.2 Identifizierung potentieller Partner über Immuno-Co-Präzipitation... 100
3.9.3 Aufreinigung potentieller Partner mittels Affinitätschromatographie... 101
3.10 RTP1p Multimerisierung ... 101
3.10.1 Untersuchung der Rolle der cross β-Faltblatt Strukturen für die Multimerisierung ... 102
3.10.2 RTP1p bildet Dimere und Multimere aus... 103
3.10.3 pH- Abhängigkeit des Aggregationsverhaltens von RTP1p... 104
3.10.4 Konzentrationsabhängigkeit des Aggregationsverhaltens von RTP1p... 105
3.10.5 Umformen der RTP1p Aggregate in filamentartige Strukturen ... 105
3.11 Proteinase K Resistenz des RTP1p ... 106
4 DISKUSSION ...108
4.1 RTP1p – eine neue Familie unter den pilzlichen, sekretierten Proteinen ... 109
4.1.1 RTP1 eine neue Genfamilie... 110
4.1.1.1 Genstruktur der RTP1 Familie... 111
4.1.1.2 Verwandtschaftsverhältnisse zwischen den RTP1 Vertretern... 114
4.1.1.3 Uf-RTP1 ist ein „low copy gene“ ... 116
4.1.2 Regulatorische Elemente der RTP1p Expression ... 117
4.1.3 RTP1p ein „Zwei Domänen Protein“ ... 120
4.1.4 Biochemische Eigenschaften der RTP1p Familie ... 122
4.1.5 Struktur der RTP1p Proteine ... 124
4.1.6 Motive der RTP1p Familie... 125
4.1.7 Glykosylierungsmuster der RTP1p Familie ... 133
4.1.8 Bedeutung der Cysteine für die Struktur der RTP1p Familie... 135
4.2 Bedeutung posttranslationaler Modifikationen für den Transfer und die Lokalisation im pflanzlichen Cytoplasma ... 136
4.2.1 Der Weg des RTP1p in die pflanzliche Zelle ... 136
4.2.2 Charakteristika für die Lokalisation in der extrahaustoriellen Matrix... 139
4.2.3 Charakteristika, die den Transfer vermitteln ... 140
4.2.4 Lokalisation im pflanzlichen Cytoplasma bzw. in den pflanzlichen Organellen... 145
4.3 Interaktionspartner von RTP1p ... 147
4.3.1 RTP1p ein multifunktionales Protein? ... 147
4.3.2 RTP1p-RTP1p Interaktion Multimerisierung und Filamentbildung... 151
4.3.3 Rolle der RTP1p Multimerisierung im nativen System ... 155
4.4 Ausblick ... 157
5 ZUSAMMENFASSUNG ...160
6 SUMMARY ...162
7 LITERATUR ...164
ANHANG A ...181
ANHANG B ...185
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1-1 Übersicht über die Entwicklungsphasen der Uredosporeninfektion verändert nach Mendgen und Hahn (2002). ... 4Abbildung 1-2 Schematische Darstellung eines Rosthaustoriums (H)... 5
Abbildung 3-1 Übersicht über die Exon-Intron Struktur der chromosomalen RTP1 Sequenzen... 59
Abbildung 3-2 Southern Blot Analyse zeigt zwei Kopien des Uf-RTP1 im U. fabae Genom. ... 62
Abbildung 3-3 Haustorienspezifische Expression von Uf-RTP1. ... 67
Abbildung 3-4 Aminosäurezusammensetzung von Uf-RTP1p, Us-RTP1p und Ua-RTP1p. ... 69
Abbildung 3-5 Übersicht über die Verteilung der vorhergesagten Faltblätter, Helices und „regions of disorder“ in RTP1p... 71
Abbildung 3-6 Hydrophilizitäts- und Antigenizitätsprofile. ... 73
Abbildung 3-7 Nachweis des Transfers von Uf-RTP1p... 76
Abbildung 3-8 Verteilung von Uf-RTP1p und Us-RTP1p in der Zelle... 76
Abbildung 3-9 Nachweis von RTP1p Homologen in den Leguminosenrosten U. fabae, U. striatus, U. appendiculatus und U. vignae... 78
Abbildung 3-10 Zeitreihe zur Kontrolle der ΠRTP1p Konzentration während der Induktionsphase. ... 80
Abbildung 3-11 Aufreinigung von ΠRTP1p aus Kulturüberständen mit Hilfe von IMAC. ... 82
Abbildung 3-12 Aufbau der Signalsequenzen von Uf-RTP1p und Us-RTP1p. ... 83
Abbildung 3-13 Kontrolle der Funktionalität der Sekretionssignale von Uf-RTP1p und Us-RTP1p durch Western Blot Analysen. ... 84
Abbildung 3-14 Kontrolle der Effizienz des Sekretionssignals von Uf-RTP1p... 84
Abbildung 3-15 Lage der N-terminalen Prozessierungsstellen bei Uf-RTP1p, Us-RTP1p und Ua-RTP1p. ... 86
Abbildung 3-16 Immunoaffinitätschromatographie zur Aufreinigung verschiedener Uf-RTP1p Formen. ... 87
Abbildung 3-17 Lage des potentiellen NLS bei Uf-RTP1p und bei Us-RTP1p... 88
Abbildung 3-18 Expression von GFP-RTP1p in P. pastoris... 89
Abbildung 3-19 Lage der potentiellen N- und O-Glykosylierungsstellen bei Uf-RTP1p, Us-RTP1p und bei Ua-RTP1p... 90
Abbildung 3-20 Deglykosylierungsexperiment für Uf-RTP1p und Us-RTP1p. ... 91
Abbildung 3-21 Deglykosylierung von ΠRTP1p... 93
Abbildung 3-22 Immunoblotanalyse der Glykosylierungsmutanten... 94
Abbildung 3-23 Immuncytologische Analyse der Glykosylierungsmutanten... 95
Abbildung 3-24 Deglykosylierungsexperiment mit Glykosylierungsmutanten ... 95
Abbildung 3-25 Lage der Cysteine in der RTP1p Sequenz... 96
Abbildung 3-26 Monomerisierung von Uf-RTP1p in Pflanzenextrakten... 97
Abbildung 3-27 Lage der potentiellen Phosphoserin/Phosphothreonin-Prolin Motive bei RTP1p... 98
Abbildung 3-28 Far Western Analysen zur Identifizierung pflanzlicher Interaktionspartner von RTP1p... 99
Abbildung 3-29 Immuno-Co-Präzipitation von RTP1p und potentiellen Interaktionspartnern ... 100
Abbildung 3-30 Silberfärbung des ankonzentrierten Eluats, der über Affinitätschromatographie aufgereinigten Interaktionspartner von RTP1p... 101
Abbildung 3-31 Bereiche mit vorhergesagter hoher Aggregationstendenz in RTP1p. ... 102
Abbildung 3-32 Cross-Linking zum Nachweis von RTP1p Dimeren und Multimeren. ... 104
Abbildung 3-33 Pelletionsversuch mit ΠRTP1p bei pH 4, 6 und 8. ... 104
Abbildung 3-34 Analyse verschiedener Stufen eines Red-Ox-Experiments auf ihren ΠRTP1p Gehalt... 106
Abbildung 3-35 Untersuchung der Proteinase K Resistenz. ... 107
Abbildung 4-1 Übersicht über die im Rahmen der Diskussion beleuchteten Analysen von RTP1p... 108
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 2-1 Verwendete Computerprogramme für in silico Analysen ... 14Tabelle 2-2 Verwendete Onlinedatenbanken... 15
Tabelle 2-3 Herkunft verwendeter Chemikalien... 15
Tabelle 2-4 Zusammenstellung der verwendeten Bakterienstämme... 18
Tabelle 2-5 Verwendeter P. pastoris Stamm ... 18
Tabelle 2-6 Zusammenstellung der verwendeten bzw. hergestellten Plasmide ... 19
Tabelle 2-7 Übersicht über verwendetes Pflanzenmaterial sowie Herkunft und Inokulum... 19
Tabelle 2-8 Übersicht über die zur Immunisierung verwendeten Tiere und Antigene ... 23
Tabelle 2-9 Zusammensetzung eines allgemeinen PCR-Ansatzes ... 27
Tabelle 2-10 PCR-Programm ... 27
Tabelle 2-11 Allgemeine Vektor- und RTP1-Primer ... 28
Tabelle 2-12 RTP1 Primer zur Klonierung... 29
Tabelle 2-13 PCR-Programm Mutagenese ... 30
Tabelle 2-14 Zusammensetzung eines Sequenzieransatzes ... 31
Tabelle 2-15 Zur Sequenzierung verwendetes PCR Programm „GATC-Seq“... 31
Tabelle 2-16 10x DIG-dNTP Mix zur Sondenherstellung... 32
Tabelle 2-17 Primerkombination und Länge der DIG-markierten Sonden... 32
Tabelle 2-18 Übersicht über die, für die Expression in E. coli hergestellten Konstrukte ... 34
Tabelle 2-19 Übersicht über die für die Expression in P. pastoris hergestellten Konstrukte ... 35
Tabelle 2-20 Verwendete Restriktionsenzyme ... 36
Tabelle 2-21 Extraktionspuffer für nicht denaturierende Proteinextraktion ... 41
Tabelle 2-22 FPLC-Programm zur Aufreinigung von 6x His getaggtem ΠRTP1p... 44
Tabelle 2-23 Übersicht über die zur Deglykosylierung verwendeten Enzyme... 50
Tabelle 2-24 Zusammensetzung eines 12% Polyacrylamid-Mini-Gels... 50
Tabelle 3-1 Übersicht über die Exon-Intron Struktur der RTP1 Gene... 61
Tabelle 3-2 Übersicht über die Ähnlichkeit von Uf-RTP1, Us-RTP1 und Ua-RTP1 auf genomischer, cDNA und Protein Ebene... 64
Tabelle 3-3 Vergleich der „codon usage“ von Uf-RTP1, Us-RTP1 und Ua-RTP1... 66
Tabelle 3-4 Übersicht über das Expressions- und Sekretionsverhalten partieller RTP1p Konstrukte. ... 72
Tabelle 3-5 Übersicht über die Spezifität der in dieser Arbeit verwendeten RTP1p Antikörper... 74
Tabelle 4-1 Schematische Darstellung der verwandtschaftlichen Beziehung zwischen den drei Rostpilzen bzw. zwischen ihren Wirtspflanzen... 115
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABPs Actin Binding Proteins
APS Ammoniumperoxidsulfat
AS Aminosäure
bp Basenpaare
BSA Bovine Serum Albumin
cDNA complementary desoxyribonucleic acid
ConA Concanavalin A = Kohlenhydrat freies Lectin der Canavalia ensiformis
CSPD 3-(4-Methoxyspiro(1,2-dioxetan-3,2-(5-Chloro)-tricyclo-decan)-4-yl)phenylphosphat- Dinatriumsalz
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid
DEPC Diethylpyrocarbonat
dpi days post infection
DTT Dithiothreitol
ECL Enhanced Chemo Lumineszenz
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EST Expressed Sequence Tag
FPLC Fast Protein Liquid Chromatography
His-Tag Abfolge von 6 Histidinen
IP Isoelektrischer Punkt
IPTG Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyranosid
IUP Intrinsically Unstructured Protein
kbp Kilobasenpaare
kDa Kilodalton
MAB Maleinsäurepuffer
MAPs Microtubuli Associated Proteins
MOPS 3-Morpholinopropansulfonsäure
N127Q Uf-RTP1p mit mutierter N-Glykosylierungsstelle an N127
N78/127Q Uf-RTP1p mit mutierten N-Glykosylierungsstellen an N78 und N127 N78Q Uf-RTP1p mit mutierter N-Glykosylierungsstelle an N78
Ni-NTA Ni-nitriloacetic acid
NLS Nuclear Localization Signal
NP40 NonidetP40
ODx Optische Dichte bei der Wellenlänge x
ORF Open Reading Frame
PAMP Pathogen Associated Molecular Pattern
Pbb Post blot buffer
PBS Phosphate Buffered Saline
PDI Proteindisulfidisomerase
PEG Polyethylenglykol
PIG In Planta Induced Gene
PIG7 = RTP1 Plant Induced Gene 7 (ehemalige Bezeichnung für RTP1)
PIG7p Protein des Plant Induced Gene 7 (ehemalige Bezeichnung für RTP1p)
PMSF Phenylmethylsulphonylfluoride
PPIasen Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerase
PVDF Polyvinylidenfluorid
PVP Polyvinylpolypyrrolidone
RT Raumtemperatur
RTP1 Gen des „Rust Transferred Protein 1“
RTP1p Rost Transferiertes Protein 1
S746p Gereinigtes Serum aus Kaninchen 746 (Antigen: Uf-HRTP1p Tabelle 2-8) S805p Gereinigtes Serum aus Kaninchen 805 (Antigen: Uf-RTP1Hp Tabelle 2-8) S844p Gereinigtes Serum aus Kaninchen 844 (Antigen: Uf-HRTP1p Tabelle 2-8) S849p Gereinigtes Serum aus Kaninchen 849 (Antigen: Us-HRTP1p Tabelle 2-8)
S894p Gereinigtes Serum aus Kaninchen 894 (Antigen: N-Terminus Uf-RTP1Hp Tabelle 2-8) S907p Gereinigtes Serum aus Kaninchen 907 (Antigen: C-Terminus Uf-RTP1Hp Tabelle 2-8) S932p Gereinigtes Serum aus Kaninchen 932 (Antigen: C-Terminus Uf-RTP1Hp Tabelle 2-8)
SAR Systemic Aquired Resistance
SBD Sphingolipid Binde-Domäne
SDS Natriumdodecylsulfat
sGFP Synthetisches Grün Fluoreszierendes Protein
Spsp Spatelspitze
SSC NaCl-Natriumcitrat-Puffer
TAE-Puffer Tris-Acetat-EDTA-Puffer
Tbb Trans blot buffer
TBS Tris bufferd saline
TEMED N,N,N,N,-tetramethylendiamin
Tris Tris[hydroxymethyl]aminomethan
Tween20 Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaureat
u unit
Ua-RTP1 Gen des „Rust Transferred Protein 1“ aus U. appendiculatus Ua-RTP1p „Rust Transferred Protein 1“ aus U. appendiculatus
Uf-RTP1 Gen des „Rust Transferred Protein 1“ aus U. fabae Uf-RTP1p „Rust Transferred Protein 1“ aus U. fabae
uORF Upstream Open Reading Frame
Us-RTP1 Gen des „Rust Transferred Protein 1“ aus U. striatus Us-RTP1p „Rust Transferred Protein 1“ aus U. striatus
Uv-RTP1p „Rust Transferred Protein 1“ aus U. vignae
WW Domäne Tryptophan-Tryptophan Domäne (universales Proteinmodul zur Bindung Prolin-reicher Liganden
ΠRTP1p Heterolog in P. pastoris exprimiertes Rost Transferiertes Protein 1 mit 6x His-Tag
1 EINLEITUNG
1.1 Rostpilze
Mit über 7.000 beschriebenen Arten, einem Drittel aller beschriebenen Basidiomyceten, sind Rostpilze (Uredinales) die artenreichste Gruppe der phytopathogenen Pilze (Aime, 2006).
Diese Gruppe der obligaten Pflanzenpathogene befällt ein breites Spektrum an Kultur- und Zierpflanzen, sowohl unter den Angiospermen, den Gymnospermen als auch den Pterido- phyten (Fink, 1989). Getreide und Leguminosen, die beiden für den Menschen wichtigsten Pflanzenfamilien, sind Wirtspflanzen der Rostpilze (Voegele, 2006). Puccinia graminis, der Weizenrost, ist seit Jahrhunderten eine der meist gefürchteten Krankheiten in Weizen anbauenden Regionen (Leonard und Szabo, 2005). Mit dem Erscheinen des hochvirulenten Puccinia graminis f. sp. tritici Ug99 Stammes, welcher 1999 zum ersten mal in Uganda entdeckt wurde, entwickelt sich eine neue Weizenrostepidemie in Ostafrika, die eine Be- drohung für die globale Weizenproduktion darstellt (Eckardt, 2006). Beim Leguminosen- anbau stellt der asiatische Sojabohnenrost Phakopsora pachyrhizi ein weltweites Problem dar, das allein in Brasilien die Erzeuger jährlich $1,2 Milliarden (USD) kostet (Posada-Buitrago und Frederick, 2005). Neben der Gattung Phakopsora ist die Gattung Uromyces eine Bedrohung für Speise- und Futterleguminosen. Wichtige Vertreter dieser Gattung sind U. fabae (Bohnenrost), U. striatus (Alfalfarost), U. pisi (Erbsenrost), U. appendiculatus (Gemeiner Bohnenrost) und U. vignae (Kuhbohnenrost) (Rubiales und Moral, 2003).
Fünf Rostpilzarten haben sich als Modellorganismen herauskristallisiert (Voegele, 2006). Das Pathosystem Melampsora lini/Linum usitatissimum, welches bereits Flor zur Demonstration der Gen-für-Gen- Hypothese diente (Flor, 1956); U. appendiculatus, U. fabae und P. graminis welche für eine Reihe cytologischer und physiologischer Studien genutzt wurden (Mendgen et al., 1991; Zhou et al., 1991). In jüngster Zeit konzentrieren sich molekulare Analysen der Rostpilze vor allem auf P. triticina (Thara et al., 2003), M. lini (Catanzariti et al., 2006), Melampsora spp. (Yin et al., 2004) und U. fabae (Jakupovic et al., 2006).
Rostpilze besitzen einen komplexen Lebenszyklus, welcher bis zu fünf verschiedenen Sporen- formen umfassen kann (Mendgen, 1997). Man unterscheidet Basidiosporen, Pyknosporen, Aecidiosporen, Uredosporen sowie Teleutosporen. Oft sind die verschiedenen Sporenformen mit einem Kernphasenwechsel sowie einem Wirtswechsel verbunden, der für die Komplet- tierung des Lebenszyklus nötig ist. U. striatus ist ein solcher als heterözisch bezeichneter Rostpilz, der seine dikaryotische Phase auf Medicago sp. verbringt, während der haploiden
Phase jedoch auf Euphorbia cyparissias angewiesen ist (Pfunder et al., 2001). Einige der Roste, wie zum Beispiel U. fabae, U. appendiculatus und U. phaseolus werden als autözisch bezeichnet, da sie für den vollständigen Lebenszyklus nur eine einzige Wirtspflanze benötigen (Gäumann, 1959). Der von Rostpilzen durchlaufene, makrocyklische Lebenslauf ist einer der komplexesten unter den Eumycota (Mendgen, 1997; Aime, 2006): nach dem Überwintern des Rostpilzes in dickwandigen, diploiden Teleutosporen, keimt der Pilz im Frühjahr mit einem Metabasidium aus. Nach einer Reduktionsteilung werden vier haploide Basidiosporen ausgebildet, die zwei verschiedenen Paarungstypen angehören. Landen die Basidiosporen auf einer Blattoberfläche, werden Infektionsstrukturen ausgebildet. Diese Infektion führt zur Ausbildung von Fruchtkörpern, welche Pycnidien genannt werden und Pycnosporen sowie rezeptive Hyphen enthalten. Zwischen den Pycnidien verschiedener Paarungstypen werden Pycnosporen ausgetauscht, die mit den Empfängnishyphen ver- schmelzen. Nachdem im Primordialaecidium die Dikaryotisierung erfolgt, bildet sich ein Aecidium, in welchem dikaryotische Aecidiosporen entstehen. Diese Aecidiosporen keimen aus und infizieren den Hauptwirt. Auf diesem werden Uredosporenlager ausgebildet, in welchen Uredosporen heranreifen. Uredosporen stellen die asexuelle Hauptsporenform des Rostes dar, denen während des Sommers eine wichtige Bedeutung für die Pathogenese zukommt. Sie werden nach wiederholten Infektionen während des Sommers in enormen Mengen produziert und sorgen damit für eine endemische Verbreitung des Pilzes. Im Herbst verschmelzen die beiden haploiden Kerne während der Sporenentwicklung und es entwickeln sich Teleutosporen.
Fast alle biochemischen und molekularbiologischen Studien beschäftigen sich mit den Infek- tionsstrukturen die ausgehend von den Uredosporen ausgebildet werden (Voegele, 2006).
Auch für die im Rahmen dieser Arbeit bearbeiteten, molekularbiologischen Aspekte wurden Sporen im dikaryotischen Uredosporenstadium verwendet, bzw. ausgehend von Uredosporen differenzierte Infektionsstrukturen.
1.2 Die Uredosporeninfektion
Uredosporen werden durch den Wind verbreitet und können auf diese Weise tausende von Kilometern zurücklegen (Brown und Hovmøller, 2002). Landet eine Spore auf einer Wirtspflanze, so ist die Hydrophobizität der Uredosporenoberfläche für die initiale Adhäsion auf der pflanzlichen Cuticula verantwortlich (Lindow und Leveau, 2002). Bei entsprechender Feuchtigkeit, folgt der initialen Adhäsion die Sekretion einer extrazellulären Matrix, aus niedermolekularen Kohlenhydraten und glykosylierten Polypeptiden (Clement et al., 1993).
Von den Sporen werden zudem Esterasen und Cutinasen abgegeben, die zu einem Abbau von
Cuticulakomponenten führen und so zur Ausbildung eines Adhäsionskissens beitragen (Deising et al., 1992). Der aus der Spore hervorgehende Keimschlauch wächst auf der Cuticula bis die Hyphenspitze die Vorhofleiste einer Spaltöffnung erkennt und durch das topographische Signal die Differenzierung eines Appressoriums ausgelöst wird (Allen et al., 1991). Das Cytoplasma wandert in das Appressorium ein und der vakuolisierte Keimschlauch wird durch ein Septum abgetrennt. Die Differenzierung des Appressoriums geht mit der Sekretion verschiedenster lytischer Enzyme einher: saure Cellulasen (Heiler et al., 1993), extrazelluläre Proteasen (Rauscher et al., 1995) und Chitindeacetylasen (Deising und Siegrist, 1995) wurden gefunden. Mittels leichten Drucks (0,35MPa) dringt der Pilz unter Ausbildung einer Penetrationshyphe in den Interzellularraum ein (Terhune et al., 1991). In der Atemhöhle wird ein substomatäres Vesikel ausgebildet, das von der Penetrationshyphe durch ein Septum getrennt wird. Das substomatäre Vesikel differenziert Infektionshyphen, die die Interzellular- räume der Pflanze durchwachsen und den Hauptanteil der pilzlichen Masse in der infizierten Pflanze darstellen (Heath und Skalamera, 1997). In diesem Stadium kann die Sekretion von Pektinesterasen (Frittrang et al., 1992), Pektinmethylesterasen (Deising et al., 1995) und neutralen Cellulasen (Heiler et al., 1993) festgestellt werden, die eine Rolle bei der Auflösung der pflanzlichen Zellwand spielen könnten. Bei Kontakt einer Infektionshyphenspitze mit einer Mesophyllzelle kommt es zur Differenzierung einer Haustorienmutterzelle, die von den Infektionshyphen durch ein Septum abgetrennt wird.
Die Strukturen der Penetrationsphase bis zur Haustorienmutterzelle können in vitro auf künst- lichen Oberflächen induziert werden (Deising, 1991). Die weiteren Infektionsstadien der parasitischen Wachstumsphase sowie die Differenzierung sporogener Zellen werden hingegen nur in planta ausgebildet. Diese Eigenschaft, des obligat biotrophen Wachstums macht die späten Infektionsstadien der Rostpilze zu einem schwer studierbaren Objekt (Cooper et al., 2006).
Die Haustorienmutterzelle bildet eine Penetrationshyphe aus, um in die Wirtszelle einzu- dringen (Heath, 1997). Die Penetrationshyphe differenziert zum Haustorienhals und weiter zum Haustorium (Heath und Skalamera, 1997). Bei der Penetration wird die Plasmamembran der Wirtszelle eingestülpt, so dass das Haustorium nicht direkt im Cytoplasma der Zelle lo- kalisiert ist. Damit ist der Pilz sowohl durch die eigene, pilzliche Zellwand, als auch die extrahaustorielle Matrix und die extrahaustorielle Membran vom pflanzlichen Cytoplasma getrennt. Die extrahaustorielle Matrix ist reich an Kohlenhydraten und bildet eine amorphe Schicht, die das gesamte Haustorium umhüllt (Szabo und Bushnell, 2001). Diese amorphe Mischung aus Kohlenhydraten und Proteinen ist teilweise pilzlichen, aber hauptsächlich
pflanzlichen Ursprungs (Harder und Chong, 1991). Damit stellt dieser Raum einen idealen Bereich sowohl zum Austausch von Nährstoffen, als auch von Informationen zwischen Pflanze und Pilz dar (Mendgen et al., 2000). Bei der extrahaustoriellen Membran handelt es sich um eine modifizierte pflanzliche Plasmamembran, der die typischen Intramembran- partikel fehlen und die eine Reduktion an Sterolen zeigt (Harder und Mendgen, 1982).
Außerdem konnte im Gegensatz zur pflanzlichen Plasmamembran keine ATPase-Aktivität nachgewiesen werden (Spencer-Phillips und Gay, 1981). Dies bedeutet, dass die Wirtszelle keinen Einfluss auf den Nährstoff- und Mineralientransport nehmen kann (Voegele, 2006).
Die extrahaustorielle Matrix wird vom Apoplasten der Pflanze durch den Halsring abgedichtet (Harder und Chong, 1991). Dieser verhindert das Austreten von Substanzen aus der extra- haustoriellen Matrix in den Apoplasten und ermöglicht somit das Aufrechterhalten sehr spezieller Bedingungen, die sich von denen des Apoplasten unterscheiden.
Abbildung 1-1 Übersicht über die Entwicklungsphasen der Uredosporeninfektion verändert nach Mendgen und Hahn (2002).
Die Uredospore (U) keimt auf einem Adhäsionskissen (AK) mit einem Keimschlauch (KS) aus. Nach Erkennung einer Vorhofleiste wird ein Appressorium (A) ausgebildet. Mittels einer Penetrationshyphe (PH) dringt der Pilz in den Interzellularraum ein, wo er direkt unter der Spaltöffnung ein substomatäres Vesikel (SV) ausbildet, welches sich in zahlreiche Interzellularhyphen (IH) fortsetzt. Diese differenzieren sich bei Kontakt mit einer Wirtszellwand zu Haustorienmutterzellen (HM). Mittels einer Penetrationshyphe (PH) dringt der Pilz in die Mesophyllzelle ein und bildet dort ein Haustorium (H) aus.
1.3 Die Rolle des Haustoriums bei der biotrophen Interaktion
Haustorien werden von allen drei Hauptgruppen der obligat biotrophen Pflanzenparasiten, den echten Mehltaupilzen, den Rostpilzen und den falschen Mehltaupilzen, welche zu den Oomyceten, und damit nicht zu den Eumycota gehören, ausgebildet (Mendgen et al., 2000;
Staples, 2001)
Abbildung 1-2 Schematische Darstellung eines Rosthaustoriums (H).
modifiziert nach Prof. Dr. Mendgen Haustorien- mutterzelle (HM), Halsring (HR), pilzliche Zellwand (PZW), extrahaustorielle Matrix (EHM), extrahaus- torielle Membran (EM), pflanzlicher Nukleus (PN), Einstülpungen der extrahaustoriellen Membran (E), endoplasmatisches Reticulum (ER), Golgi (G), (HN) haustorieller Nukleus
Haustorien stellen eine Art Verlängerung in die lebende Wirtszelle dar, und ermöglichen den biotrophen Lebensstil, bei welchem der Wirt über einen langen Zeitraum kaum geschädigt wird (Mendgen et al., 2000).
Obligat biotrophe Pathogene wachsen und vermehren sich in der Natur ausschließlich auf der lebenden Wirtspflanze (Staples, 2001). Neben dem wichtigsten Kennzeichen der Biotrophie, den Haustorien, gibt es weitere Gemeinsamkeiten, durch welche biotrophe Pilze gekennzeichnet sind: hoch entwickelte Infektionsstrukturen, eine enge Kontaktzone, die pilzliche und pflanzliche Plasmamembran trennt sowie eine lang andauernde Unterdrückung der pflanzlichen Abwehrreaktionen (Mendgen und Hahn, 2002).
Seit ihrer Beschreibung vor mehr als 150 Jahren wird den Haustorien bei Rostpilzen eine wichtige Rolle bei der Ernährung des Pilzes zugeschrieben (de Bary, 1863).
Jedoch erst die Entwicklung einer Methode zur Isolation von Haustorien aus infiziertem Blattmaterial legte den Grundstein zur molekularbiologischen Analyse der Funktion dieser pilzlichen Strukturen (Hahn und Mendgen, 1992). Neben der Tatsache, dass Haustorien nicht in vitro erzeugt werden können, erschwert der Mangel eines stabilen Transformationssystems bei Rostpilzen die Untersuchung der Bedeutung der Haustorien für die Biotrophie. Daher erfolgt die Analyse verschiedenster Rostpilzproteine in heterologen Hefesystemen wie zum
Beispiel S. cerevisiae (Haerter und Voegele, 2004), oder P. pastoris (Voegele et al., 2006), oder in pflanzlichen Systemen wie zum Beispiel in Flachs (Catanzariti et al., 2006).
Die Konstruktion einer Haustorien-spezifischen cDNA Bank von U. fabae durch Hahn und Mendgen (1997) machte die Untersuchung der Funktion der Haustorien von molekular- biologischer Seite möglich. Seither wurden verschiedene präferentiell oder ausschließlich im Haustorium exprimierte Gene identifiziert, welche „in planta-induced genes“ (PIGs) genannt wurden (Voegele, 2006). Es konnte gezeigt werden, dass Haustorien hohe Konzentrationen an in der Biosynthese von Vitamin B1 beteiligten Enzymen (Sohn et al., 2000) sowie Polyolen, wie Mannitol (Voegele et al., 2005) aufweisen. Zudem konnte die Bedeutung der Haustorien für die Nährstoffaufnahme belegt werden. Neben einer ATPase (Struck et al., 1998), welche die Energie für an der Nährstoffaufnahme beteiligte Transportsysteme liefert, wurden drei an der Aminosäureaufnahme beteiligte Aminosäuretransporter charakterisiert (Hahn und Mendgen, 1997; Mendgen et al., 2000; Struck et al., 2002; Struck et al., 2004), von welchen einer haustorienspezifisch exprimiert wird. Zudem konnten ein für die Zuckeraufnahme verantwortlicher Hexosetransporter HXT1 (Voegele et al., 2001), eine am Karbohydrat- metabolismus beteiligte β-Glucosidase BGL1 (Haerter und Voegele, 2004) und eine Invertase INV1 (Voegele et al., 2006) identifiziert werden. Diese Daten belegen die essentielle metabolische Aufgabe der Haustorien während der parasitischen Infektionsphase.
Eine kürzlich durchgeführte Analyse weiterer ESTs, aus der U. fabae, haustorienspezifischen cDNA Bibliothek, identifizierte Gene für putative Metallothionine sowie an der Ribosomen- biogenese, der Translation, der Glykolyse, dem Aminosäuremetabolismus, der Stressantwort und der Detoxifikation beteiligte Gene (Jakupovic et al., 2006). Jedoch konnte auch eine hohe Anzahl an in planta-induzierter und Haustorium-spezifischer Gene identifiziert werden, denen mangels Homologen in den Datenbanken, keine Funktion zugeordnet werden konnte (Jakupovic et al., 2006). Die Produkte dieser Gene sind potentielle Kandidaten für eine Beteiligung an der Ausbildung und Aufrechterhaltung der Kompatibilität zur Wirtspflanze (Bushnell und Rowell, 1981; Voegele und Mendgen, 2003).
Damit kann dem Haustorium neben der Nährstoffaufnahme eine weitere wichtige Funktion bei der Wirt-Parasit Interaktion zugeschrieben werden (Mendgen et al., 2000). Da obligat biotrophe Parasiten, wie oben beschrieben, auf den lebenden Wirt für ihr Wachstum und ihre Nährstoffaufnahme angewiesen sind, müssen sie einen Weg gefunden haben den Wirtsstoff- wechsel zu manipulieren ohne Abwehrmechanismen auszulösen. Die Fähigkeit die pflanz- liche Abwehr zu unterdrücken scheint wirtsspezifisch zu sein, da Rostpilze bei Nichtwirts- pflanzen ein weites Spektrum an Abwehrreaktionen auslösen (Heath, 1997).
Pilzliche Supressoren der pflanzlichen Abwehr wurden verschiedentlich beschrieben sind aber kaum charakterisiert, oder keine Proteine (Voegele, 2006). Auch bei Rostpilzen gibt es Hin- weise auf Suppressoren, bei welchen es sich nicht um Proteine handelt. Rostpilze scheinen in der Lage zu sein Mannitol und D-Arabitol in den Apoplasten abzugeben, welche als Radikalfänger an der Bekämpfung reaktiver Sauerstoffradikale beteiligt sein könnten, die bei der pflanzlichen Abwehr freigesetzt werden (Link et al., 2005; Voegele et al., 2005). Eine weitere Möglichkeit der pflanzlichen Abwehr zu entgehen ist die Detoxifizierung pflanzlicher Saponine durch die Sekretion einer β-Glucosidase in die extrahaustorielle Matrix (Haerter und Voegele, 2004).
Es ist wahrscheinlich, dass Rostpilze in der Lage sind weitere Suppressoren abzugeben, die in die grundlegende Kompatibilität zwischen Parasit und Wirtspflanzen einbezogen sind (Bushnell und Rowell, 1981), deren Ziel aber nicht die extrahaustorielle Matrix sondern das pflanzliche Cytoplasma ist. In anfälligen Wirtspflanzen modulieren diese Effektoren die Physiologie des Wirts so, dass das Wachstum des Pilzes gewährleistet ist (Eckardt, 2006). In resistenten Pflanzen kann die Erkennung der Effektoren als Avirulenzfaktoren durch ein Resistenzgenprodukt der Wirtspflanze zu einer hypersensitiven Reaktion und damit zu einer Abwehrreaktion führen (Catanzariti et al., 2006); (Dodds et al., 2006). Bei bakteriellen Patho- genen erfolgt der Transfer von Effektorproteinen in die pflanzliche Wirtszelle über die direkte Injektion der Proteine über ein Typ III Sekretionssystem (Büttner und Bonas, 2003). Jedoch ist im Gegensatz zu den Effektoren bei Bakterien, bei den Effektoren von biotrophen pilz- lichen Pathogenen sowie denen bei Oomyceten, kaum etwas über die Identität, die Sekretion und die Aufnahme ins Cytoplasma der Wirtszelle bekannt (O'Connell und Panstruga, 2006).
Bis auf die Tatsache, dass das Transkript, das für bestimmte Effektoren kodiert sich im Haustorium anreichert und viele, wenn auch nicht alle, Effektoren ein typisches Sekretions- signal tragen, konnten bisher keine Gemeinsamkeiten der Effektoren identifiziert werden, die einen Hinweis auf den Aufnahmemechanismus geben könnten (Ellis et al., 2006; O'Connell und Panstruga, 2006).
1.4 Sekretierte Effektorproteine bei Pilzen und Oomyceten
Pathogene Pilze und Oomyceten sind in der Lage durch die Sekretion von Effektorproteinen ihren entsprechenden Wirt zu beeinflussen (O'Connell und Panstruga, 2006), was in den meisten Fällen die Beeinflussung der pflanzlichen Abwehrmechanismen betrifft. Dies geschieht zum Einen durch die Unterdrückung der Signaltransduktion oder Genexpression der Pflanzenzellen und damit zum Schutz vor antifungalen Substanzen oder Enzymen, oder zum
Anderen, im Fall von nekrotrophen Pathogenen, durch das Auslösen des Todes der Wirtszelle (Rep, 2005).
Die sekretierten Effektorproteine lassen sich an Hand ihrer unterschiedlichen Lokalisation in der Wirtspflanze in apoplastische und cytoplasmatische Effektorproteine einteilen (Kamoun, 2006). Apoplastische Effektoren werden in den extrazellulären Raum sekretiert, cyto- plasmatische in die Wirtszelle.
Bei einigen der isolierten und biochemisch charakterisierten apoplastischen Effektorproteine handelt es sich um Enzyminhibitoren oder Proteasen, die bei der Abwehr pflanzlicher PR Proteine, wie zum Beispiel Chitinasen und Endoglucanasen, fungieren (Kamoun, 2006). Ein bekanntes Beispiel dieser Effektorklasse ist das Glucanase Inhibitorprotein 1 (GIP1) von Phytophthora sojae, das β-1,3-Endoglucanasen von verschiedenen Glycine Arten hemmt (Rose et al., 2002).
Bei vielen der apoplastischen Effektorproteine handelt es sich um kleine (<200 Aminosäuren), sekretierte, cysteinreiche Avirulenzproteine (Rep, 2005), die eine gerade Anzahl an Cysteinresten in ihrer Sequenz aufweisen. Sie lösen eine Abwehrreaktion aus, wenn sie ins pflanzliche Gewebe infiltriert werden (Lauge und de Wit, 1998; van't Slot und Knogge, 2002). Bei Avr4 und Avr9 von Cladosporium fulvum handelt es sich um umfang- reich untersuchte Avirulenzproteine, die im Apoplast des Tomatenblattes als Elicitoren eine Abwehr in Tomatengenotypen auslösen, welche das entsprechende Resistenzgen tragen (de Wit et al., 2002). Bei NIP1, einem kleinen Protein, das vom Gerstepathogen Rhynchosporium secalis sekretiert wird, ist für die Abwehrinduktion und Avirulenzfunktion neben der Sekretion die Ausbildung von Disulfidbrücken essentiell (van't Slot et al., 2003).
Bei den Nep-like proteins (NLPs) handelt es sich um eine Proteinfamilie, die ca. 25 kDa große Virulenzproteine umfasst, welche unter Pflanzen-assoziierten Bakterien, Pilzen und Oomyceten verbreitet sind (Gijzen und Nürnberger, 2006). NLPs teilen ein hohes Maß an Sequenzähnlichkeit, was sie von den meisten anderen Elicitoren unterscheidet und sind in der Lage Abwehrreaktionen, Nekrosen und Zelltod in Dikotyledonen auszulösen (Pemberton und Salmond, 2004).
CBEL (Cellulose Binding, Elicitor and Lectin-like) ist ein von Oomyceten wie Phytophthora parasitica var. nicotianae sekretiertes 34 kDa großes Protein, das neben der Eigenschaft in Tabakpflanzen Nekrosen und die Expression von Abwehrgenen auszulösen auch zur Haftung an Cellulose reichen Oberflächen, wie zum Beispiel pflanzlichen Oberflächen beiträgt (Mateos et al., 1997).
Auch für Rostpilze sind apoplastische Effektorproteine bekannt. Sowohl bei U. vignae als auch P. graminis f.sp. tritici konnten HR induzierende Elicitoren isoliert bzw. mit mono- klonalen Antikörpern nachgewiesen werden (Marticke et al., 1998) (D'Silva und Heath, 1997).
Eine Zwischenform zwischen extrazellulären und intrazellulären Effektorproteinen stellt das von U. fabae in die extrahaustorielle Matrix sekretierte Protein PIG15p dar (Kemen et al., 2005). Sowohl in jungen als auch in alten Haustorien konnte PIG15p in der extrahaustoriellen Matrix lokalisiert werden, jedoch in keinem Fall wurde ein Übertritt in die pflanzliche Zelle beobachtet (Kemen et al., 2005).
Zusätzlich zu den Effektorproteinen, welche ihre Funktion im Apoplast oder der extra- haustoriellen Matrix haben, steigt die Zahl der Effektorproteine, die ebenfalls sekretiert werden, deren Ziele aber im Cytoplasma oder Kern der entsprechenden Wirtszelle liegen (O'Connell und Panstruga, 2006). In vielen Fällen wird die Aufnahme ins Cytoplasma der Zielzelle indirekt aus der Erkennung des Effektorproteins als Avirulenzprotein durch ein entsprechendes im Cytoplasma der Zielzelle lokalisiertes Rezeptorprotein geschlossen (Jia et al., 2000); (Catanzariti et al., 2006); (Dodds et al., 2006). Bei cytoplasmatischer Expression des Effektorproteins konnte in einigen Fällen ein hypersensitiver Zelltod beobachtet werden, was ebenfalls den Schluss auf die Erkennung durch ein passendes Resistenzprotein zuließ (O'Connell und Panstruga, 2006).
In vielen Fällen in denen eine intrazelluläre Lokalisation der Effektoren angenommen wird, scheint das Protein im Haustorium synthetisiert, dann durch den sekretorischen Apparat der Zelle durchgeschleust und schließlich in die extrahaustorielle Matrix über Exocytose abge- geben zu werden (Kemen et al., 2005; Catanzariti et al., 2006). Die Aufnahme in die Pflanze erfolgt über einen noch unbekannten Mechanismus (Ellis et al., 2006).
Bei den cytoplasmatischen Effektorproteinen der RxLR Proteinfamilie von Oomyceten, wie zum Beispiel ATR1 und ATR13 von Hyaloperonospora parasitica (Allen et al., 2004) (Rehmany et al., 2005) sowie Avr3a und Avr1b-1 von P. infestans und P. sojae (Shan et al., 2004) (Armstrong et al., 2005), könnte das Aminosäuremotiv RxLR wichtig für den Übertritt in die pflanzliche Zielzelle sein (Kamoun, 2006). Das RxLR Motiv ist remineszent zu einem Sequenzmuster bei sekretierten Virulenzfaktoren des tierischen Pathogens, Plasmodium falciparum (Birch et al., 2006; Ellis et al., 2006) und dort für den Übertritt aus der parasitären Vakuole in den menschlichen Erythrocyten essentiell (Hiller et al., 2004; Marti et al., 2005).
Bei pilzlichen cytoplasmatischen Effektorproteinen konnte bisher kein entsprechendes Motiv gefunden werden (Ellis et al., 2006).
Bei AVR-Pita, einem vom Reisbranderreger Magnaporthe grisea sekretierten Protein, handelt es sich um das erste pilzliche sekretierte Effektorprotein für das auf Grund der Bindung an sein entsprechendes intrazelluläres Resistenzprotein Pi-ta eine cytoplasmatische Lokalisation postuliert wurde (Jia et al., 2000). AVR-Pita kodiert für eine Metalloprotease, weist eine N-terminale Signalsequenz auf und wird als Preproprotein translatiert. Es löst in den pflanz- lichen Zielzellen eine Pi-ta vermittelte Abwehrreaktion aus.
Erst kürzlich konnten beim Flachsrost M. lini vier cytoplasmatische Effektorproteine, AvrL567, AvrM, AvrP4 und AvrP123, identifiziert werden, die abhängig vom Vorhandensein der entsprechenden cytoplasmatischen NBS-LRR Resistenzproteine eine hypersensitive Reaktion induzieren (Dodds et al., 2004) (Catanzariti et al., 2006). Diese Avirulenzproteine sind relativ klein und zeigen keine Homologie zu bestehenden Datenbankeinträgen (Catanzariti et al., 2006). Außer für AvrP123, das ein Sequenzcharakteristikum der Kazal Serin Protease Inhibitoren aufweist (Catanzariti et al., 2006), gibt die Aminosäuresequenz dieser Polypetide keinen Hinweis auf ihre biochemische Funktion.
Um ein ebenfalls in die Wirtspflanze Weizen internalisiertes Effektorprotein handelt es sich bei Ptr ToxA, welches von Pyrenophora tritici-repentis sekretiert wird (Tuori et al., 2000).
Eine Prozessierung des Preproproteins ist essentiell für die korrekte Faltung des Proteins (Tuori et al., 2000). Das Zielkompartiment dieses Toxins scheint nicht nur das Cytoplasma sondern auch der Chloroplast zu sein, wo es immunocytologisch lokalisiert werden konnte (Manning und Ciuffetti, 2005).
Es scheint, dass jedes dieser cytoplasmatischen Effektorproteine auf ein enges phylo- genetisches Spektrum beschränkt ist und entweder Art- oder Gattungsspezifisch auftritt (O'Connell und Panstruga, 2006). Schnelle Koevolution der entsprechenden Avirulenz und Resistenzgenpaare in kompatiblen Interaktionen könnte das in einem engen phylogenetischen Spektrum beobachtete Auftreten der cytoplasmatischen Effektoren erklären (Rep, 2005).
Nicht alle der cytoplasmatischen Effektorproteine weisen eine Signalsequenz auf. Zwei Mitgliedern der Erysiphe graminis Avr Genfamilie (Avrk1 und Avra10) fehlt die typische N-terminale Signalsequenz, sie weisen aber Eigenschaften, wie z.B. ein potentielles Amino- säuremotiv (RMLLR) oder eine Interaktion mit dem entsprechenden R Protein auf, die für einen Übertritt über „lipid bilayers“ sprechen (Ridout et al., 2006).
Da die Anzahl der von Pilzen und Oomyceten sekretierten Proteine, wie zum Beispiel bei M. grisea mit 700 sekretierten Proteinen, oder bei Phytophthora spec. mit über 100 sekre- tierten, potentiell transferierten Proteinen, recht hoch ist, wird vermutet, dass das Effektor-
repertoir der pilzlichen Pathogene und der Oomyceten komplexer ist als das phytopathogener Bakterien (O'Connell und Panstruga, 2006).
1.5 Pilzliche Amyloide
Amyloide sind filamentöse Proteinstrukturen mit ~ 10 nm Breite und 0,1 – 10 µm Länge, welche als Gemeinsamkeit cross β-Strukturen aufweisen (Gebbink et al., 2005). Diese Fibrillen werden für gewöhnlich mit degenerativen Krankheiten bei Säugetieren in Ver- bindung gebracht (Prusiner et al., 1998). Es zeigte sich aber, dass diese Proteine auch auf bakteriellen und pilzlichen Oberflächen zu finden sind (Gebbink et al., 2005). Ein filamentöses Bakterium Streptomyces coelicolor sowie filamentöse Pilze sind in der Lage, durch die Sekretion hydrophober amyloid-ähnlicher Fibrillen an einer Wasser-Luft Grenzfläche zu wachsen (Stefani, 2004). Eine Gruppe dieser hydrophoben, amyloid- ähnlichen, Fibrillen bildenden Proteine wird bei filamentösen Pilzen Hydrophobine genannt (Hakanpää et al., 2004). Sie stellen eine auf Pilze beschränkte Proteinfamilie mit niedrigem Molekulargewicht dar, die polymere, wasserabweisende Monolayer auf der Sporen-, Hyphen- oder Fruchtkörperoberfläche ausbilden (Wösten, 2001). Hydrophobine weisen kaum Sequenz- ähnlichkeiten auf, außer einem charakteristischen Muster an acht Cysteinen, die intra- molekulare Disulfidbrücken ausbilden (Wösten et al., 1999). Diese Proteine haben bemer- kenswerte biophysikalische Eigenschaften und fungieren durch Zusammenlagerung in amphi- pathische Oberflächenfilme (Wösten, 2001). Für eine Subklasse der Hydrophobine besteht der Film aus zylindrischen „rodlets“, deren Außenfläche eine extrem niedrige Benetzbarkeit aufweist (Wösten, 2001). Die Morphologie der isolierten „rodlets“ erinnert an aus krankhaftem Gewebe isolierte, oder in vitro erzeugte, amyloide Fibrillen (Kwan et al., 2006).
Die „rodlets“ weisen ausgedehnte β-Strukturen auf, was nahe legt, dass „rodlets“ und amyloide Fibrillen strukturelle Gemeinsamkeiten aufweisen (Mackay et al., 2001).
Das derzeitige Dogma lautet, dass amyloide Fibrillen durch die Stabilisierung eines teil- gefalteten Konformers eines Proteins entstehen und durch einen Aggregationskeim-abhängi- gen Polymerisierungsprozess gebildet werden (Tuite und Koloteva-Levin, 2004). Unter den amyloid-bildenden Proteinen, stellen Prionen eine Unterklasse dar, da sie das veränderte Amyloid-Konformer durch die Bildung neuer Keime replizieren können. Das veränderte Amyloid-Konformer kann dann in andere Zellen übertragen werden und dort den Keim für die weitere Polymerisation darstellen, wodurch sich die infektiöse Prionform fortpflanzt (Tuite und Koloteva-Levin, 2004).
Prionproteine konnten bei Hefen und dem filamentösen Pilz Podospora anserina identifiziert werden (Wickner et al., 1999). Die nicht-mendelnden genetischen Elemente URE3 und PSI
aus Hefe entsprechen den Prionformen der Proteine Ure2p und Sup35p. Ure2p und Sup35p sind lösliche, intrazelluläre Proteine mit normaler Konformation, aber aggregieren in vivo durch Konversion in die Prionform (Patino et al., 1996) (Edskes et al., 1999). In vitro gehen gereinigtes Ure2p und Sup35p durch eine „self seeded“ Konversion in den amyloid- ähnlichen, fibrillären Zustand über (Glover et al., 1997). Obwohl URE3 ein langsameres Wachstum der Hefen verursacht, scheinen die Prionaggregate nicht generell toxisch für die Hefen zu sein (Jung und Jones, 2003).Es wurde sogar postuliert, dass das PSI Prion unter bestimmten Umständen für die Hefen nützlich ist, denn es vermittelt bei einigen Hefen einen Schutz gegen verschiedene Arten von Stress, z.B. gegen Hitzeschock (Eaglestone et al., 1999).
Die Beobachtung, dass ein Prion kein Krankheitsauslöser sein muss sondern ein Vermittler normaler zellulärer Funktionen sein kann, wird durch das [Het-s] Prion des filamentösen Pilzes P. anserina verdeutlicht. Das [Het-s] Prion, ein ebenfalls intrazelluläres Protein, ist an der zellulären Erkennung, die auch als Heterokaryon Inkompatibilität bekannt ist, beteiligt (Dos Reis et al., 2002). Der het-s Lokus hat zwei als hets und hetS bezeichnte polymorphe Varianten. [Het-s] stellt die Prionform des HET-s Proteins dar und der Prion-freie Zustand wird [Het-s*] genannt (Coustou et al., 1999). [Het-s] Stämme unterscheiden sich von [Het-s*]
Stämmen durch ihre Reaktivität gegenüber Stämmen, die das HET-S Protein exprimieren.
Vegetative Zellfusionen zwischen [Het-s*] und [HET-S] Stämmen sind möglich, aber ein Zelltod (Heterokaryon Inkompatibilität) tritt auf wenn [Het-s] und [HET-S] Zellen fusionieren (Maddelein et al., 2002). Der [Het-s*] Stamm konvertiert zu einem reaktiven [Het-s]
Phänotyp bei Kontakt mit einem [Het-s] Stamm (Dos Reis et al., 2002). HET-s Aggregate können im Elektronenmikroskop als amyloid-ähnliche Fibrillen beobachtet werden. In der aggregierten Form ist ein HET-s Fragment Proteinase K resistent (Dos Reis et al., 2002).
Damit zeigen die Arbeiten an pilzlichen Prionen, dass Prionen nicht nur Anomalien bei der Proteinfaltung, sondern weit verbreitet und in einigen Fällen auch für den pilzlichen Organismus nützlich sind (Osherovich und Weissman, 2002).
1.6 Zielsetzung dieser Arbeit
Die differentielle Hybridisierung einer haustorienspezifischen cDNA Bibliothek des Acker- bohnenrostes U. fabae identifizierte verschiedene in planta induzierte Gene (PIGs), von denen einige speziell im Haustorium exprimiert werden (Hahn und Mendgen, 1997). Die Sequenzierung dieser PIGs zeigte, dass einige dieser Gene für offene Leseraster potentiell sekretierter Proteine kodieren (Hempel, 2006). Im Rahmen der Analyse dieser präferentiell im Haustorium exprimierten, in die extrahaustorielle Matrix sekretierten Proteine, die auf Grund fehlender Homologie zu Datenbankeinträgen keine bekannte Funktion erkennen lassen, wurde ein Protein, PIG7p, identifiziert, das scheinbar in die pflanzliche Zelle aufgenommen wird.
Die vorliegende Arbeit untersucht die molekularbiologischen und biochemischen Eigenschaften dieses Proteins, das auf Grund seiner außergewöhnlichen Lokalisation in Rost Transferiertes Protein 1 (RTP1p) umbenannt wurde. Die Untersuchungen an RTP1p erfolgten in Zusammenarbeit mit E. Kemen, dessen Arbeit sich vor allem mit den cytologischen und strukturellen Aspekten von RTP1p beschäftigt (Kemen, 2006).
Die Ziele der vorliegenden Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen:
• Untersuchung der Struktur und Regulation von RTP1p Homologen aus verschiedenen Rostpilz-Leguminosen Pathosystemen
• Herstellung verschiedener RTP1p spezifischer Antikörper zur Untersuchung der subzellulären Lokalisation von RTP1p, zur Identifikation weiterer RTP1p Homologen in verschiedenen Pathosystemen sowie zur Klärung der Bedeutung posttranslationaler Modifikationen von RTP1p
• Untersuchung biochemischer Eigenschaften, die die Struktur, die Lokalisation und die Funktion von RTP1p beeinflussen
• Identifizierung potentieller Interaktionspartner von RTP1p
• Analyse der Quartiärstruktur von RTP1p
2 Material und Methoden
2.1 Verwendete Computerprogramme und Onlinedatenbanken
Programm Quelle/Referenz Anwendung
AdobePhotoshop® CS Adobe Systems, Mountain View, CA, USA Bildbearbeitung AdobeReader®7.0 Adobe Systems, Mountain View, CA, USA Textbearbeitung
AxioVision 4.0 Zeiss, Göttingen, Deutschland Bilddokumentation
Chromas 2.3 Technelysium Pty Ltd, Helensvale, Queensland,
Australien Sequenzbearbeitung
Corel Draw 12 Corel Corporation, Unterschleißheim, Deutschland Bildbearbeitung
DNAstar* Paket DNAstar Inc., Madison, WI, USA Sequenzbearbeitung
EndNote6.0 Thomson ISI Research Soft, Berkeley, CA, USA Literaturrecherche Eppendorf Biophotometer
online 1.01
Eppendorf, Hamburg, Deutschland Photometrie
Gene Runner 3.05 Hastings Software, Inc., Hastings on Hudson, NY, USA, nun erhältlich unter
http://www.genelink.com/tools/gl-downloads.asp
Sequenzbearbeitung
Microsoft®Excel 2003 Microsoft Corporation, Unterschleißheim, Deutschland Berechnungen Microsoft®Power Point
2003
Microsoft Corporation, Unterschleißheim, Deutschland Bildbearbeitung Microsoft®Word 2003 Microsoft Corporation, Unterschleißheim, Deutschland Textbearbeitung Multi Analyst 1.1 BioRad Laboratories GmbH, München, Deutschland Geldokumentation pDraw32 1.0 AcaClone Software, http://www.acaclone.com/ Sequenzanalyse UNICORN 4.12 GE Healthcare Europe GmbH, München, Deutschland FPLC-Steuerung Tabelle 2-1 Verwendete Computerprogramme für in silico Analysen
Programm Quelle/Referenz In silico Analyse
BETApro http://www.ics.uci.edu/~baldig/betasheet.html
(Cheng und Baldi, 2005) Sekundärstrukturanalyse
DiANNA1.1 http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/
(Ferre und Clote, 2005) Analyse der Disulfidbrücken
DIpro 2.0 http://contact.ics.uci.edu/bridge.html
(Cheng et al., 2006) Analyse der Disulfidbrücken
DisEMBL http://dis.embl.de/
(Linding et al., 2003b)
Analyse unstrukturierter Regionen
DISOPRED2 http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/disopred/disopred.html
(Ward et al., 2004) Analyse unstrukturierter
Regionen DISULFIND http://disulfind.dsi.unifi.it/
(Vullo und Frasconi, 2004) Analyse der Disulfidbrücken
ELM http://elm.eu.org/
(Puntervoll et al., 2003) Analyse funktioneller Motive
FUGUE http://www-cryst.bioc.cam.ac.uk/fugue/
(Shi et al., 2001)
Homologiesuche durch Sequenz-Strukturvergleich NCBI BLAST® http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/
(Altschul et al., 1997) Suche von
Sequenzhomologen Net N-Glyc 1.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/
(Blom et al., 2004) Analyse des
N-Glykosylierungsmusters Net O-Glyc 3.1 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/
(Julenius et al., 2005) Analyse des
O-Glykosylierungsmusters PredictNLS http://cubic.bioc.columbia.edu/predictNLS/
(Cokol et al., 2000)
NLS Analyse PSIPRED http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/psiform.html
(McGuffin et al., 2000) Sekundärstrukturanalyse
PSORT II http://psort.nibb.ac.jp/form2.html
(Nakai und Horton, 1999) Analyse der subzellulären
Lokalisation SignalP V3.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
(Bendtsen et al., 2004) Signalpeptidanalyse
TANGO 1.1 http://tango.embl.de/
(Fernandez-Escamilla et al., 2004)
Analyse aggregierender Regionen
WoLF PSORT http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/
(Horton et al., 2006) Analyse der subzellulären
Lokalisation CSS-Palm http://bioinformatics.lcd-ustc.org/css_palm/
(Zhou et al., 2006) Analyse der Palmitoylierung
MEROPS http://merops.sanger.ac.uk/
(Rawlings et al., 2006) Analyse auf Ähnlichkeiten zu
Peptidaseinhibitorsequenzen Tabelle 2-2 Verwendete Onlinedatenbanken (Stand November 2006)
2.2 Chemikalien
Die Herkunft der verwendeten Chemikalien und Geräte wird im Text angegeben.
Chemikalien die nicht näher erläutert werden, waren von analytischem Reinheitsgrad und wurden von folgenden Firmen bezogen:
Firma Firmenstandort
BD Biosciences Heidelberg, Deutschland
Carl Roth GmbH & Co. Karlsruhe, Deutschland
GE Healthcare München, Deutschland
Merck Eurolab GmbH Darmstadt, Deutschland
PeqLab Biotechnologie GmbH Erlangen, Deutschland
Riedel deHaen (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) Taufkirchen, Deutschland SERVA Feinbiochemica GmbH & Co.KG Heidelberg, Deutschland
Sigma-Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen, Deutschland
Tabelle 2-3 Herkunft verwendeter Chemikalien
2.3 Kulturmedien
2.3.1 Medien zur Kultivierung von Bakterien
LB-Medium (Luria-Bertani-Medium) (Sambrook und Russell, 2001) 1,0 % (w/v) Trypton Peptone
0,5 % (w/v) Select Yeast Extract
171,1 mM NaCl
Der pH wurde mit 1 M NaOH auf 7,5 eingestellt.
Zur Herstellung von Selektivmedien wurde nach dem Autoklavieren zusätzlich noch 100 µg/ml Ampicillin bzw. 50 µg/ml Kanamycin zugegeben.
NZY-Medium (Sambrook und Russell, 2001)
1,0 % (w/v) Casein Hydrolysate enzymatic (N-Z-Amine A)
85,6 mM NaCl
0,5 % (w/v) Select Yeast Extract Der pH wurde mit 1 M NaOH auf 7,5 eingestellt.
8,1 mM MgSO4 wurde nach dem Autoklavieren zugesetzt.