2.10.1 Proteinextraktion aus infizierten Pflanzen
2.10.1.1 Proteinextraktion unter denaturierenden Bedingungen
Zum Nachweis der RTP1p Homologen in infiziertem Blattmaterial, zur Untersuchung des Glykosylierungsmusters sowie für Far Western Blot Analysen, wurde eine Proteinextraktion aus infiziertem und nicht infiziertem Pflanzenmaterial unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt (Kemen et al., 2005).
Zur denaturierenden Proteinextraktion wurden mehrere Blätter infizierter (8 dpi) bzw. nicht infizierter V. faba, V. unguiculata, P. vulgaris, M. truncatula und N. benthamiana Pflanzen für 15 min in flüssigem Stickstoff sehr fein gemörsert. Das homogenisierte Pflanzenmaterial wurde in 60 °C warmen Extrationspuffer (125 mM Tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 200 µM PMSF, 100 mM DTT) überführt, gemischt und für 10 min bei 100 °C inkubiert. Danach
wurde das Extrakt für 15 min bei 13.200 rpm und RT in einer Eppendorf Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 4x vol eiskaltem 100% Aceton bei -20 °C 60 min präzipitiert. Nach Zentrifugation wurden die Pellets mit kaltem 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 1% Extraktionspuffer aufgenommen. Nach der Zugabe von 4x Probenpuffer (2.10.15) konnten die Extrakte auf einem SDS-Gel analysiert werden.
2.10.1.2 Proteinextraktion unter schwach denaturierenden Bedingungen (ohne SDS und DTT)
Für die Immunoaffinitätschromatographie zur Aufreinigung verschiedener prozessierter Uf-RTP1p Formen sowie zur Aufreinigung potentieller Partner mittels Affinitätschromato-graphie, wurde eine schwach denaturierende Proteinextraktion mit Blattmaterial von U. fabae infizierten (8 -10 dpi) und nicht infizierten V. faba Pflanzen durchgeführt. Hierfür wurde ca.
9 g gefrorenes Pflanzenmaterial für 15 min in flüssigem Stickstoff unter Zugabe von Seesand zerstoßen. Anschließend wurde das Pflanzenmaterial in 25 ml 80 °C warmen Extraktions-puffer (10 mM NatriumphosphatExtraktions-puffer pH 7,4, 2,5 mM PMSF, 1 mM EDTA) aufgenommen und für 15 min bei 100 °C inkubiert. Optional wurden dem Extraktionspuffer vor der Zugabe des Pflanzenmaterials 100 µl Proteinase Inhibitor Cocktail VI (Calbiochem, Darmstadt, Deutschland) zugesetzt. Die aufgekochten Extrakte wurden 2 h bei Raumtemperatur inkubiert und regelmäßig invertiert. Nach Zentrifugation für 10 min bei 5.000 rpm im SS34 Rotor wurde der Überstand bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert.
2.10.1.3 Proteinextraktion unter nicht denaturierenden Bedingungen
Zur Gewinnung von nativem Protein für Cross-Linking Versuche, für Immuno-Co-Präzipi-tationsstudien und eine DTT-Reihe wurden 2-3 Blätter U. fabae infizierter (8 -10 dpi) und nicht infizierter V. faba Pflanzen in den entsprechenden Extraktionspuffern (siehe Tabelle 2-21) fein zerschnitten und das Pflanzenmaterial leicht ausgepresst.
Extraktionspuffer für Puffer
Immuno-Co-Präzipitationsstudien 50 mM Tris/HCl pH 7,2 0,05 % (v/v) NP40
200 µM PMSF Cross-Linking mit Glutaraldehyd,
DTT-Reihe
2,5 mM Tris/HCl pH 7,2 0,1 % (v/v) TritonX 100 200 µM PMSF Cross-Linking mit Sulfo-EGS 136 mM NaCl
2,7 mM KCl 4,3 mM Na2HPO4
1,8 mM KH2PO4
0,1 % (v/v) TritonX 100 200 µM PMSF pH 7,4
Tabelle 2-21 Extraktionspuffer für nicht denaturierende Proteinextraktion
Bei einigen Extraktionen wurde dem Extraktionspuffer 5 mg/ml Polyvinylpolypyrrolidone (PVP) zugesetzt, um phenolische Bestandteile des Extraktes zu quenchen (Bernardi et al., 2001). Der entstandene Extrakt wurde vorsichtig abgenommen und weiter verarbeitet.
2.10.2 Heterologe Expression in E. coli BL21(DE3)
Für eine Überexpression von RTP1p Fragmenten mit 6x His-Tag, z.B. für die Antikörper-herstellung, wurden die für diese Bereiche kodierenden Sequenzen in die Vektoren pET28a oder pET32a kloniert (siehe 2.9.10.1), welcher anschließend in einen E coli-Überexpressions-stamm, transformiert wurde (siehe 2.9.10.7). Die Expression der Proteine mit 6x His-Tag erfolgte laut den Herstellerangaben (The QIAexpressionistTM, 06/2003, QIAGEN, Hilden, Deutschland).
Für eine Überexpression wurde LB-Selektivmedium 1:100 mit einer Übernachtkultur des transformierten Überexpressionsstamms angeimpft. Bei einer OD600 von 0,5 wurden die Kulturen mit 1 mM IPTG induziert (Studier und Moffatt, 1986). Anschließend wurden in regelmäßigen Abständen Proben genommen um die Überexpression zu kontrollieren. Je nach überexprimiertem Protein lag nach 1 - 4 h genügend Protein für eine Reinigung vor.
Für eine Proteinreinigung über Ni-NTA-Affinitätschromatographie wurden 250 ml Kultur abzentrifugiert (8 min, 8.000 rpm, RT, GSA-Rotor) und in 5 ml Puffer B (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris/HCl, 8 M Harnstoff, pH 8,0) resuspendiert. Zur Zelllyse wurde die Suspension 1 h unter Rühren bei RT inkubiert und anschließend 2 min mit 50 Impulsen/min sonifiziert.
Nach Zentrifugation für 10 min bei 11.000 rpm, im GSA-Rotor, bei RT, wurde der Überstand abgenommen.
2.10.3 Heterologe Proteinexpression in P. pastoris
RTP1p Gesamt-, Fragment-, Fusions- und Mutationskonstrukte wurden im heterologen eu-karyontischen System P. pastoris überexprimiert. Hierfür wurden die entsprechenden RTP1 Sequenzbereiche in die Vektoren pPIC3.5 bzw. pPIC9 kloniert (siehe 2.9.10.2) und an-schließend in Zellen des Stammes KM71 transformiert (siehe 2.9.10.7). Die Überexpression der Proteine wurde nach einem modifizierten Protokoll nach Stratton et al. (1998) durch-geführt.
Für gleichmäßige Kultivierungsbedingungen wurden 25 ml Vor-Vor-Kulturen in MGY-Medium (2.3.2) in einem 300 ml Kolben mit 5 bis 6 Kolonien von MD-Agar angeimpft und über Nacht bei 360 rpm und 30 °C in einem KS10 Rotationsschüttler (Edmund Bühler, Tübingen, Deutschland) inkubiert. 200 ml Vor-Kultur wurde mit den Vor-Vor-Kulturen auf eine OD600 von 0,25 in MGY-Medium eingestellt und in 1 l Schikanekolben 12 h bei 360 rpm
und 30 °C inkubiert. Das Abernten der Vorkulturen erfolgte bei 2.000 rpm für 5 min, bei RT, in einem GSA-Rotor. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet mit H2Odest
gewaschen, bevor die Zellen erneut bei 2.000 rpm für 5 min, bei RT, im GSA- Rotor pelletiert wurden.
Für die Überexpression wurde das Pellet in MD-Medium resuspendiert, wobei die Kultur in 300 ml Schikanekolben auf eine OD600 von 30 eingestellt wurde. Zur Überexpression wurden die Zellen bei 360 rpm und 30 °C kultiviert und nach 24 h der pH mit 24%iger Ammoniak-lösung auf 6 titriert sowie die Kultur mit 0,5% Methanol reinduziert.
72 h nach Erstinduktion wurden die Kulturen bei 6.000 rpm für 10 min im GSA-Rotor pelletiert. Das in den Überstand sekretierte, überexprimierte Protein wurde mittels Western Blot Analysen untersucht. Für die Aufreinigung des heterologen ΠRTP1p, über Affinitäts-chromatographie, wurde der Überstand durch einen 0,45 µm Filter sterilfiltriert.
2.10.4 Proteinreinigung über Ni-NTA Affinitätschromatographie 2.10.4.1 Proteinreinigung unter denaturierenden Bedingungen
Die Reinigung 6x His-getaggter Proteine zur Antikörperproduktion aus einem E. coli Zell-lysat erfolgte laut den Herstellerangaben (The QIAexpressionistTM, 06/2003, QIAGEN, Hilden, Deutschland) unter denaturierenden Bedingungen, wobei das Protein durch Absenken des pHs eluiert wurde.
Vor der Reinigung wurde 1 ml des Säulenmaterials (Ni-NTA Superflow, Qiagen, Hilden, Deutschland) mit Puffer B (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris/HCl, 8 M Harnstoff, pH 8,0) gewaschen und in eine Säule (Poly-Prep Chromatography Columns, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) überführt. Der pH, der in Puffer B lysierten Proben (2.10.2) wurde auf 8,0 eingestellt. Die Proteinprobe wurde auf die Säule aufgetragen, das Eluat aufgefangen, und erneut auf die Säule aufgebracht. Der Beladungsschritt wurde dreimal wiederholt. Anschlie-ßend wurde 2x mit 4 ml Puffer C (analog zu Puffer B, pH 6,3) und 4x mit 0,5 ml Puffer D (analog zu Puffer B, pH 5,9) gewaschen. Die Elution erfolgte mit 4x 0,5 ml Puffer E (analog zu Puffer B, pH 4,5). Nach der Elution wurde die Säule mit Puffer B wieder auf pH 8,0 eingestellt und konnte für eine weitere Reinigung desselben Proteins genutzt werden. 4,5 µl der eluierten Fraktionen wurden anschließend zur Kontrolle der Reinigung auf einem SDS-Gel analysiert.
2.10.4.2 Proteinreinigung unter nativen Bedingungen über FPLC
Die Aufreinigung des 6x His-getaggten ΠRTP1p aus P. pastoris KM71 pPIC3.5::ΠRTP1 Kulturüberständen unter nativen Bedingungen war Grundlage vieler weiterer, zur
Charak-terisierung von RTP1p durchgeführter Versuche. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Reinigungsprotokoll etabliert, bei welchem das Protein durch steigende Imidazolkonzen-tration eluiert wurde.
Die Aufreinigung des Proteins erfolgte mit Hilfe der ÄKTAFPLC® (GE Healthcare, München, Deutschland). Hierfür wurde das erstellte Programm „Affi mit 2step“ (siehe Tabelle 2-22) angewandt.
Reinigungsschritt Puffer/Auftrag Flussrate Volumen
Äquilibrieren Puffer A 1 ml/min 5 ml
Auftragen P. pastoris Kulturüberstand 1 ml/min 9,5 ml
Waschen Puffer A 1 ml/min 4 ml
Eluieren Stufe 1
Stufe 2 85% Puffer A + 15% Puffer B
70% Puffer A + 30% Puffer B 1 ml/min
1 ml/min 5 ml
5 ml
Delay Puffer A 1 ml/min 5 ml
Äquilibrieren Puffer A 1 ml/min 5 ml
Tabelle 2-22 FPLC-Programm zur Aufreinigung von 6x His getaggtem ΠRTP1p
Wurde zur Aufreinigung eine HiTrap Chelating HP 1ml Säule (GE Healthcare, München, Deutschland) verwendet, musste diese mit 100 mM NiSO4-Lösung vor der Aufreinigung beladen werden. HisTrap Chelating HP 1ml Säulen (GE Healthcare, München, Deutschland) konnten direkt verwendet werden.
Puffer A
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
45 mM Imidazol
1 mM L-Glutathion reduziert
Der pH wurde mit 5 M NaOH auf 8,0 eingestellt und die Lösung anschließend sterilfiltriert und entgast.
Puffer B
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
500 mM Imidazol, kristallin 5 mM L-Glutathion reduziert
Der pH wurde mit 5 M NaOH auf 8,0 eingestellt und die Lösung anschließend sterilfiltriert und entgast.
Für den Auftrag auf die mit Nickel beladene Säule wurde der sterilfiltrierte KM71 pPIC3.5::ΠRTP1 Kulturüberstand zunächst mit 1 mM reduziertem L-Glutathion (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) sowie mit 45 mM Imidazol (Acros Organics, Geel, Belgien) versetzt und der pH mit 1 M NaOH auf 6,5 eingestellt. Imidazol wurde bereits beim Auftrag zugesetzt, um so die Spezifität zu erhöhen. Die Elution erfolgte unter Verwendung eines Stufengradienten, dessen erste Stufe (85% Puffer A + 15% Puffer B) eine Imidazolend-konzentration von 113 mM und die zweite Stufe (70% Puffer A + 30% Puffer B) von
181 mM hatte. Durch die Messung der Absorption bei 280 nm und über Western Blot Analysen wurde ermittelt, dass die 1 ml Fraktionen 8, 9 und 10 die höchste ΠRTP1p Konzentration aufweisen. Diese Fraktionen wurden gepoolt und konnten für weitere Versuche verwendet werden.
2.10.5 Säulenherstellung zur Affinitätschromatographie
Zur Aufreinigung von RTP1p aus Pflanzenextrakten, zur Aufreinigung potentieller Interaktionspartner sowie zur Reinigung Antigen-spezifischer Antikörper aus Seren wurden Affinitätschromatographien durchgeführt, für welche Säulen nach einem veränderten Protokoll von Voegele et al. (2001) hergestellt wurden.
Pro Säule wurde 1 g CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Antikörperaufreinigung siehe 2.10.8) oder 1 g CNBr-aktivierte Sepharose 6MB (RTP1p- bzw. Interaktionspartneraufreinigung siehe 2.10.6 und 2.10.7) (GE Healthcare, München, Deutschland) in 1 mM HCl imbibiert. Die Sepharose wurde über eine gesinterte Glasfritte (Porengröße 3) mit 1 mM HCl gewaschen.
2 mg der zu koppelnden Antigene (Antikörperaufreinigung), 5 ml ungereinigtes Serum S844 (RTP1p-Aufreinigung), oder 2 ml gereinigtes ΠRTP1p (Interaktionspartneraufreinigung) wurden mit Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3) gemischt. Das Säulenmaterial wurde mit der jeweiligen vorbereiteten Proteinlösung gemischt und 1 h rollend bei RT oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Das Säulenmaterial wurde anschließend über eine Glasfritte abgenutscht, um nicht gebundene Proteine zu entfernen. Anschließend wurde mit 0,2 M Glycinpuffer pH 8,0 gewaschen. Das Säulenmaterial wurde für 2 h in diesem Puffer rollend bei RT inkubiert, um die noch freien reaktiven Gruppen der Matrix abzusättigen. Die nicht kovalent gebundenen Komponenten wurden mit Hochsalzpuffern und alternierenden pH Schritten ausgespült, indem 3x abwechselnd mit Acetatpuffer (0,1 M NaAcetat, 0,5 M NaCl, pH 4,0) und Kopplungspuffer gewaschen wurde. Das Säulenmaterial wurde in Kopplungs-puffer aufgenommen und in Poly- Prep Chromatography-Säulen (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland) gefüllt.
Zur Serenaufreinigung wurden zwei Säulen hergestellt: eine Säule, an welche das zur Immunisierung verwendeten Antigen gekoppelt wurde sowie eine, an die ein beliebiges ebenfalls 6x His-getaggtes Protein gebunden wurde.
2.10.6 Aufreinigung von RTP1p aus Pflanzenextrakten durch Affinitäts-chromatographie
Zur Isolierung verschiedener Prozessierungs- und Glykosylierungsformen von Uf-RTP1p (siehe 3.5.2) wurde eine Aufreinigung durch Immunoaffinitätschromatographie durchgeführt,
wobei nach einer leicht modifizierten Methode des Herstellers des Säulenmaterials (GE Healthcare, München, Deutschland) vorgegangen wurde. Das mit S844 gekoppelte Säulen-material wurde mit 15 ml Kopplungspuffer (2.10.5) gewaschen. Anschließend wurde der unter schwach denaturierenden Bedingungen gewonnene Proteinextrakt, aus U. fabae infi-zierten V. faba Pflanzen (2.10.1.2), insgesamt fünfmal auf die Säule aufgetragen. Beim ersten Auftragen wurde das Totvolumen der Säule bestimmt. Anschließend wurde die Säule mit 35 ml 10 mM Tris/HCl pH 8,0 gewaschen, bis das Eluat klar war. Die Elution erfolgte mit 3,6 ml 0,05 M Glycinpuffer pH 2,2. Nach einem dem Totvolumen der Säule entsprechenden Volumen wurde das Eluat in Eppendorf Reaktionsgefäßen aufgefangen, in welchen je 65 µl 1 M Tris/HCl pH 8,0 vorgelegt worden waren. Mit einem dem Totvolumen der Säule ent-sprechenden Volumen an 10 mM Tris/HCl pH 8,0 wurde das noch auf der Säule verbliebene Uf-RTP1p verdrängt. Der Erfolg der Reinigung wurde anschließend über SDS-PAGE (2.10.15) und Western Blot (2.10.18) analysiert.
2.10.7 Aufreinigung von Partnern durch Affinitätschromatographie
Potentielle Interaktionspartner von Uf-RTP1p wurden durch Immunoaffinitätschromato-graphie aufgereinigt. Hierfür wurde mit ΠRTP1p gekoppeltes Säulenmaterial verwendet, welches vor dem Auftrag von unter schwach denaturierenden Bedingungen gewonnenem Proteinextrakt, aus nicht infizierten V. faba Pflanzen (2.10.1.2), mit Kopplungspuffer (2.10.5) gewaschen wurde. Die weiteren Schritte der Aufreinigung erfolgten wie unter 2.10.6 beschrieben. Der Erfolg der Reinigung wurde anschließend über Silbergele (2.10.17) und Far Western Blot Analysen (2.10.20) kontrolliert.
2.10.8 Antikörperreinigung aus Seren mittels CNBr-aktivierter Sepharose 4B
Bei der Antikörperreinigung aus Seren wurden zuerst durch Negativabsorption, die Anti-körper, die gegen den Vektoranteil gerichtet waren, entfernt. In einem zweiten Reinigungs-schritt wurden durch Positivabsorption die spezifischen Antikörper von den sonstigen Bestandteilen des Serums getrennt (Voegele et al., 2001).
Für die zur Negativabsorption verwendeten Proteine sei auf Tabelle 2-8 verwiesen. Für die Positivabsorption wurde das zur Immunisierung eingesetzte Antigen an das Säulenmaterial gekoppelt.
5 ml der ungereinigten Seren wurden wiederholt (5 x) auf die Säule mit der Matrix für die Negativabsorption (INVn2/Thioredoxin) gegeben, um vektorspezifische Antikörper aus dem Serum zu entfernen. Der Durchlauf wurde auf die Säule mit der Matrix zur Positivabsorption
aufgetragen. Die Positivabsorption wurde insgesamt 5 x wiederholt. Vor der Elution wurde die Säule mit 5 ml 10 mM Tris/HCl pH 8 gewaschen. Die Elution erfolgte mit 3,6 ml 50 mM Glycinpuffer pH 2,2. Die Elution der RTP1p-spezifischen Antikörper erfolgte in Sarstedt-röhrchen, in welchen 500 µl 1 M Tris/HCl, pH 8,0 vorgelegt worden waren. Der Erfolg der Reinigung wurde über Western Blot Analysen kontrolliert.
2.10.9 Proteinkonzentrationsbestimmung
Zur Proteinkonzentrationsbestimmung wurde ein BioRad Protein Assay (BioRad GmbH, München, Deutschland) durchgeführt. Diese Messung der Totalproteinkonzentration basiert auf einem Farbumschlag des Coomassie Brilliant Blue G-250 von 465 nm nach 595 nm, wenn es an Protein bindet (Bradford, 1976).
Die zu quantifizierenden Proteinlösungen wurden mit H2O verdünnt und ein Volumen von 800 µl eingestellt. Anschließend wurden 200 µl BioRad-Lösung (BioRad GmbH, München, Deutschland) hinzugegeben und die Ansätze gemischt. Die Ansätze wurden für 10-30 min inkubiert und dann bei 595 nm gemessen. Es wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt.
Als Referenz dienten BSA-Verdünnungen mit folgenden Konzentrationen: 100 µg/ml, 50 µg/ml und 0 µg/ml. Die Messungen für die Eichgerade wurden ebenfalls im Triplikat durchgeführt.
2.10.10 Cross-Linking Assays
Die Cross-Linking Experimente, mit Glutaraldehyd oder Sulfo-EGS als Cross-Linker, wurden mit unter nicht denaturierenden Bedingungen extrahierten Proteinextrakten, aus mit U. fabae infizierten V. faba Pflanzen (siehe 2.10.1.3), oder mit aufgereinigtem ΠRTP1p (siehe 2.10.4.2) durchgeführt. Für die Cross-Linking Experimente mit Glutaraldehyd (Lei und Hu, 1997) wurde für die Proteinextrakte eine Glutaraldehyd-Endkonzentration von 0,05%, (v/v) und für das gereinigte ΠRTP1p eine Endkonzentration von 0,1% (v/v) eingesetzt. Für die Cross-Linking Experimente mit Sulfo-EGS (durchgeführt laut Herstellerangaben, Instructions for EGS, Sulfo-EGS, Pierce, Rockford, IL, USA) wurde für die Proteinextrakte 1,5 mM Sulfo-EGS und für das gereinigte ΠRTP1p 5 mM Sulfo-EGS eingesetzt. Die Proben wurden für 1 bis 60 min inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Reaktion bei den mit Glutaraldehyd vernetzten Proben mit 10 mM Glycine für 5 min gequencht. Bei den mit Sulfo-EGS vernetzten Proben wurde 66 mM Tris/HCl pH 6,8 zum Quenchen verwendet. Die Proben wurden über Immunoblots analysiert.
2.10.11 Pelletionsversuch
Mit Hilfe von Pelletionsversuchen wurde das Aggregationsverhalten von aufgereinigtem ΠRTP1p (siehe 2.10.4.2) bei den pH Werten pH4, pH6 und pH8 untersucht. Hierfür wurde gereinigtes ΠRTP1p 1:10 (v/v) mit 20 mM Citratpuffer pH4 bzw. pH6, oder 20 mM Tris/HCl pH8 gemischt und für 15 min bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Proben bei 16.110 g und Raumtemperatur abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und mit 4x Proben-puffer (siehe 2.10.15) gemischt. Das Pellet wurde in einem dem Ausgangsvolumen entspre-chenden Volumen 1x Probenpuffer aufgenommen. Die Proben wurden über eine Western Blot Analyse auf ihren ΠRTP1p Gehalt untersucht.
2.10.12 „Conversion“
Eine „Conversion“ zur Umwandlung amorpher Proteinaggregate in Filamente wurde in abge-änderter Form nach einer von Lee und Eisenberg (2003) publizierten „Seeded Conversion“
durchgeführt.
18 ml des aufgereinigten ΠRTP1p (siehe 2.10.4.2) wurden mit Hilfe einer Vivaspin 15R Ultrafiltrationseinheiten (Vivascience AG, Hannover, Deutschland) bei 1.000 g und 20 °C in der Heraeus Multifuge3 S-R-Zentrifuge auf 5 ml eingeengt und in Monomerisierungspuffer (50 mM Tris-HCl pH7,6, 2,5 M Guanidine-HCl, 3 M NaCl, 1 M DTT) umdialysiert. Es folgte eine Inkubation bei RT über Nacht, um die komplette Monomerisierung des Proteins zu ge-währleisten. Vor dem Überführen der Proteinlösung in 1 ml Dialyseeinheiten (Float-A-Lyzer, Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe, Deutschland) wurde diese auf ein Volumen von 1 ml ankonzentriert (Stufe 1). Für 24 h wurde die Proteinlösung von Monomerisierungspuffer in Oxidationspuffer (50 mM Na-Acetat, 1 M Guanidine-HCl, pH 3,8) (Stufe 2) und anschließend für 48 h in Aggregationspuffer (50 mM Na-Acetat, pH 3,8) (Stufe3) umdialysiert. Von allen drei Stufen der „Conversion“ wurden 30 µl Proben abgenommen. Nach dem letzten Dialyse-schritt wurden 30 µl der Proteinlösung bei 15.800 g, bei RT, für 15 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 30 µl Aggregationspuffer aufgenommen.
Alle Proben wurden zur Monomerisierung der Filamente für 24 h 1:1 (v/v) mit 5 M Guanidin-HCl, 0,05 M EDTA behandelt. Die Proben wurden anschließend einer Proteinfällung mit Methanol unterzogen, wofür sie mit 4x Vol eiskaltem Methanol versetzt und über Nacht bei -20 °C gefällt wurden. Es folgte ein Zentrifugationsschritt für 30 min bei 4.000 g und 4 °C. Die Pellets wurden getrocknet und in 1x Probenpuffer (siehe 2.10.15) resuspendiert. Die Proben wurden über eine Western Blot Analyse auf ihren ΠRTP1p Gehalt untersucht.
2.10.13 Proteinase K Versuche
Da die unlöslichen Aggregate vieler amyloid-bildender Proteine eine hohe Resistenz gegen-über Proteinase K aufweisen (Swietnicki et al., 2000), wurde die Proteinase K Resistenz von RTP1p untersucht.
2.10.13.1 Proteinase K Behandlung von heterologem ΠRTP1p
Aufgereinigtes ΠRTP1p (siehe 2.10.4.2) wurde für 10 min bei 16.110 g, bei RT, abzentri-fugiert. Das Pellet wurde in 1x Ausgangsvolumen 70% Puffer A + 30% Puffer B (siehe 2.10.4.2) aufgenommen und für 5 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min und 120 min mit Proteinase K (Endkonzentration 2 µg/ml) bei 37 °C behandelt. Nach dem Verdau wurden die Proben mit einem entsprechenden Volumen 4x Probenpuffer (siehe 2.10.15) gemischt und über einen Immunoblot analysiert.
2.10.13.2 Proteinase K Behandlung von nativem Uf-RTP1p
Gefrorenes Blattmaterial von U. fabae infizierten V. faba Pflanzen (8-10 dpi) wurde für 15 min in flüssigem Stickstoff zerstoßen. Anschließend wurde das Pflanzenmaterial in Ex-traktionspuffer (10 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4, 1 mM EDTA) aufgenommen und für 60 min mit Proteinase K (Endkonzentrationen 0, 1, 10, 20, 40, 80, 100 µg/ml) bei 50 °C verdaut. Nach dem Verdau wurden die Proben für 24 h 1:1 (v/v) mit 5 M Guanidin-HCl, 0,05 M EDTA behandelt, und anschließend einer Proteinfällung mit Methanol, wie unter 2.10.12 beschrieben, unterzogen. Es folgte eine Analyse über Immunoblot.
2.10.14 Deglykosylierung von Proteinproben
Zur Untersuchung des Glykosylierungsmusters von nativem RTP1p sowie von heterologem ΠRTP1p wurden diese mit verschiedenen Exoglucosidasen und Endoglucosidase Hf be-handelt. Für die Untersuchung der N-glykosydisch gebundenen Oligosaccharide wurden denaturierend gewonnene Proteinextrakte (siehe 2.10.1.1) oder aufgereinigtes ΠRTP1p (siehe 2.10.4.2) verwendet. Die Analyse der endständigen Zucker mit den in Tabelle 2-23 aufgeführten Exoglucosidasen erfolgte mit aufgereinigtem ΠRTP1p (siehe 2.10.4.2). Die Proben für den Endoglucosidase Hf Verdau wurden vor dem Verdau in einem entsprechenden Volumen 4x Probenpuffer (2.10.15) aufgenommen und 10 min bei 95 °C denaturiert. Bei den anderen Ansätzen erfolgte die Denaturierung durch Erhitzen im jeweiligen Puffer. Nach Zugabe des entsprechenden Puffers und Enzyms (siehe Tabelle 2-23) wurden die Proben über Nacht bei 37 °C inkubiert und anschließend im Fall des Exoglucosidase-Verdaus mit 4x
Pro-benpuffer (2.10.15) versetzt. Eine Veränderung des Molekulargewichts wurde über Western Blot Analysen kontrolliert.
Enzym Puffer [u/µl Ansatz]
Endoglucosidase Hf 10x G5 83,0
β-N-Acetyl-hexosaminidasef 10x G2 0,4
Neuraminidase 10x G1 4,1
α1-2,3 Mannosidase 10x G3 0,2 α1-6 Mannosidase 10x G2 0,2 α–N-Acetyl-galactosaminidase 10x G7 1,7 Tabelle 2-23 Übersicht über die zur Deglykosylierung verwendeten Enzyme
Alle Enzyme und Puffer stammten von New England Biolabs GmbH, Frankfurt/M., Deutschland.
2.10.15 SDS-PAGE
Es wurde ein diskontinuierliches Lämmli-System mit Tris-Glycin-Puffern verwendet (Laemmli, 1970). Das Sammelgel diente zur Aufkonzentration der Proteinproben an der Trenngelfront und damit zu einer Schärfung der aufgetrennten Banden auf dem Trenngel. Es wurden Trenngele mit einem Polyacrylamidanteil von 10%, 12% und 15% verwendet. Die Sammelgele hatten eine Konzentration von 2%. Beispielhaft sollte hier die Zusammensetzung eines 12% Polyacrylamidgels wiedergegeben werden (siehe Tabelle 2-24). Die anderen Trenngele unterschieden sich nur im Verhältnis H2O zu Acrylamid-Bisacrylamid.
Reagenzien Trenngel Sammelgel
H2O 1,70 ml 1,5 ml
1,5 M Tris/HCl (pH 8,8) 1,25 ml
0,5 M Tris/HCl (pH 6,8) 0,63 ml
30% Acrylamid-/2,6% Bisacrylamid
(Rotiphorese Gel30, Carl Roth GmbH, Karlsruhe)
2,00 ml 0,33 ml
10% SDS 50,0 µl 25,0 µl
TEMED 2,5 µl 2,5 µl
10% APS 25,0 µl 12,5 µl
Tabelle 2-24 Zusammensetzung eines 12% Polyacrylamid-Mini-Gels
Die Proteinproben wurden vor dem Auftragen auf das Gel mit 4x Probenpuffer (65 mM Tris/HCl pH 6,8, 9% (v/v) Glycerol, 2% (v/v) SDS, 1 M DTT, 1 Spsp Bromphenolblau) auf-genommen und für 5 min bei 95 °C erhitzt und abzentrifugiert.
Die Gele liefen bei einer Spannung von 170 V für 50 min in 1x Laufpuffer (10x Laufpuffer:
14,4% (w/v) Glycin, 3% (w/v) Tris base, 1% (w/v) SDS) in einer Mini PROTEAN®II Cell (BioRad Laboratories GmbH, München, Deutschland).
Zur Bestimmung des Molekulargewichts wurde für Coomassie-Gele der Unstained Protein Molecular Weight Marker (SM0431, Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) verwendet.
Wurde an den Gellauf ein Western Blot angeschlossen, wurde der Prestained Protein Molecular Weight Marker (SM0441, Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) verwendet.
2.10.16 Coomassie-Färbung
Sollte mit einer SDS-PAGE eine Überexpression oder ein Proteinspektrum kontrolliert werden, wurde an den Gellauf eine Färbung des Gels mit Coomassie-Färbelösung (45% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Eisessig, 0,25% (v/v) Coomassie Brilliant Blue R250) für 15 min angeschlossen (Meyer und Lambert, 1965). Das Gel wurde anschließend für 20 min in Entfärbelösung (35% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Eisessig, 0,3% (v/v) Glycerol) entfärbt.
2.10.17 Silberfärbung
Sollte eine über SDS-PAGE aufgetrennte Probe mit geringer Proteinkonzentration kontrolliert werden, so wurde eine Silberfärbung angeschlossen (Blum et al., 1987).
Nach dem Gellauf wurden die Gele mindestens 60 min in Fixierlösung (50% (v/v) Methanol, 12% (v/v) Eisessig, 0,018% Formaldehyd) fixiert. Anschließend wurde das Gel dreimal für
Nach dem Gellauf wurden die Gele mindestens 60 min in Fixierlösung (50% (v/v) Methanol, 12% (v/v) Eisessig, 0,018% Formaldehyd) fixiert. Anschließend wurde das Gel dreimal für