Regulatorische Elemente der RTP1p Expression

Die stadienspezifische, auf Haustorien beschränkte Expression, konnte mit Hilfe von Northern Blot Analysen und immunocytologischen Untersuchungen, mit verschiedenen Antikörpern, im Rahmen dieser Arbeit bestätigt werden. Auch die Expression von Us-RTP1p und Ua-RTP1p scheint auf Haustorien beschränkt zu sein, da sie immunologisch nur in diesen Strukturen nachgewiesen werden konnten (Kemen, 2006). Damit handelt es sich bei RTP1 um ein typisches PIG (In Planta Induced Gene). Eine haustorienspezifische Expression konnte bereits für mehrere Gene von U. fabae gezeigt werden, wie zum Beispiel HXT1 (Voegele et al., 2001), THI1 und THI2 (Sohn et al., 2000), PIG5 und MAD1 (Hahn und Mendgen, 1997).

Die hohe Zahl der Gene deren Expression während des Wechsels der Penetrationsphase in die parasitische Phase induziert werden, unterstreicht die Rolle des Haustoriums sowohl bei der

Nährstoffaufnahme als auch dem Signalaustausch zur Manifestierung des biotrophen Zu-stands des Rostes.

Wie von Kemen (2005) festgestellt, gibt es Unterschiede der RTP1p Konzentration in Abhängigkeit vom Alter der Haustorien. Bei jungen Haustorien ist RTP1p in geringen Kon-zentrationen in der Matrix zu finden, in älteren Haustorien wird die Proteinexpression um ein Vielfaches erhöht und RTP1p kann in hohen Konzentrationen, sowohl in der Matrix, als auch in der pflanzlichen Zelle gefunden werden. Diese Beobachtung kann mit einer hohen mRNA Stabilität erklärt werden. Zudem könnte die RTP1p Expression auf verschiedenen Ebenen reguliert werden.

Die stadienspezifische Regulation scheint auf Ebene der Transkription zu erfolgen, da erst in isolierten Haustorien RTP1 mRNA nachgewiesen werden kann. Für die Regulation auf Transkriptionsebene gibt es verschiedene Möglichkeiten, wie zum Beispiel der Einfluss der Chromatinstruktur, Faktoren die die Transkriptionsinitiation beeinträchtigen, aber auch die Prozessierung und Modifikation der mRNA sowie deren Stabilität und Transport aus dem Kern (Cooper und Hausman, 2004). Zum Beispiel könnte der Splice-Prozess der sechs Introns von RTP1p eine Auswirkung auf Expressionsstärke und -geschwindigkeit haben. Zudem könnten pflanzliche Stimuli in die Transkriptionsregulation eingreifen, da in M. truncatula GRC.098 Ökotypen eine Us-RTP1p Expression auch schon in den Stadien der Haustorienmutterzellen beobachtet wurde (Kemen, 2006). Obwohl die über Northern Blot nachgewiesene Uf-RTP1 Expression mit dem immunocytologischen Nachweis von Uf-RTP1p in Vicia faba übereinstimmt, kann nicht ausgeschlossen werden, dass auch hier pflanzliche Stimuli in die Regulation der RTP1 Transkription eingreifen, da bei den für die Northern Blot Analyse verwendeten, in vitro erzeugten Infektionstrukturen, Effekte durch pflanzliche Stimuli vernachlässigt werden.

Die Feinregulation der Expression im Stadium der Haustorien könnte auch auf Translations-ebene erfolgen. Die zwei in der cDNA Sequenz von Us-RTP1 im Rahmen dieser Arbeit identifizierten uORF könnten an der Regulation der Translation beteiligt sein. uORFs werden bei zwei Dritteln der Gene beobachtet, die für zelluläres Wachstum und Differenzierung bedeutend sind sowie bei Proteinen mit regulatorischen Funktionen (Vilela und McCarthy, 2003). Diese Form der Regulation würde gut mit der postulierten Funktion von RTP1p als regulatorischem Effektor der Biotrophie korrelieren. Mit 33 bzw. 28 Codons gehören die beiden uORF von Us-RTP1 zu den längeren uORF, welche eine Reinitiation der Ribosomen erschweren und damit die RTP1 Expression drosseln. Neben der Länge der uORF spielt auch der AUG Kontext eine wichtige Rolle. Für Eukaryonten wurde die Konsensussequenz

CCACCATGG gefunden (Kozak, 1981), wobei für eine erfolgreiche Initiation ein Adenin in Position -3 in Bezug auf das AUG von entscheidender Bedeutung ist sowie ein Guanin in Position +4 (Mignone et al., 2002). Die AUG Regionen beider uORFs von Us-RTP1 sind nicht optimal für eine Initiation, da weder in Position -3 ein Adenin noch an +4 ein Guanin auftritt. Die AUG Region des eigentlichen ORF von Us-RTP1 entspricht besser der Kozak Sequenz, da hier in Position -3 ein Adenin vorkommt. Der schlechte AUG Kontext der uORF könnte unter bestimmten Umständen die Translation von Us–RTP1p zulassen, indem die Ribosomen die AUG Region der uORF nicht als Initiationsstart erkennen und zum AUG des Us-RTP1 Gens weiter geleitet werden („leaky scanning“) (Sachs und Geballe, 2006). Damit könnte die „first-AUG Regel“ (Kozak, 1989) im Falle der uORF von Us-RTP1p umgangen werden. Eine Initiation am AUG des Us-RTP1 Gens wird zudem durch den mit 64% hohen AU Gehalt der intercistronischen Sequenz zwischen Stopcodon des uORFII und Startcodon begünstigt.

Eine weitere für uORFs nachgewiesene Wirkweise ist, die Hemmung der Translation über die durch die uORF kodierten Peptide (Morris und Geballe, 2000). Eine immuncytologische Kontrolle mit Hilfe spezifischer Antikörper könnte Hinweise geben, ob uORFI und uORFII als Peptide eine Rolle spielen.

Sowohl über die regulierende Funktion der mRNA, als auch über die der Peptide, könnte die RTP1 Expression in frühen Stadien der Haustorienentwicklung vermindert werden. Eine Feinregulation von RTP1p wird auch vor dem Hintergrund konzentrationsabhängiger RTP1p Aggregation (3.10.4) sinnvoll, denn würden gleichzeitig große Mengen von RTP1 un-kontrolliert translatiert, stiege die Wahrscheinlichkeit der Aggregation im sekretorischen Apparat der Zelle. Wird für den nach dem Prozessieren frei werdenden N-Terminus, eine Ab-wehr auslösende Funktion bei der Interaktion mit der Pflanze postuliert, so erscheint die Mög-lichkeit zur Feinabstimmung der Translation vorteilhaft für den Pilz. Allerdings muss die Bedeutung der uORF für die Expressionsregulation durch die Identifizierung der uORF bei Uf-RTP1 und Ua-RTP1 weiter untersucht werden. Es kann nicht vollkommen ausgeschlossen werden, dass es sich bei der für Us-RTP1 gefundenen cDNA um eine nicht vollständig ge-spleißte mRNA handelt. Die in den Northern Blot Analysen gefundene Größe von etwa 1.000 bp für die mRNA von Uf-RTP1 spricht gegen eine lange nicht translatierte 5’ Region.

Sollten die uORF eine wichtige Rolle für die Regulation spielen, so sind sie mit hoher Wahrscheinlichkeit auch bei den beiden anderen RTP1 Vertretern konserviert. Zhang und Dietrich (2005) beobachteten, dass in verwandten Arten die uORF konservierte Sequenzen, Längen und eine ähnliche Anordnungen im Vergleich zum Startcodon des Hauptgens

aufweisen. Eine Analyse der Transkriptgröße für Us-RTP1 würde ebenfalls Aufschluß über die Bedeutung der beiden uORF geben.