Wirtspflanze Herkunft des Saatguts Inokulum
Vicia faba L. ’Con Amore’ Nickerson- Zwaan, Edemissen Uromyces fabae (PERS.) SCHROETER (Rasse I2)
Medicago sativa L. ’Europe’ Kleinwanzlebener Saatzucht AG, Einbeck
Medicago truncatula GAERTN.
’Jemalong’ A17
Medicago truncatula GAERTN. F11.0008
INRA- Montpellier, Montpellier, Frankreich
U. striatus SCHROETER (Rasse KN1)
Vigna unguiculata ’California Black
Eye’ Monsanto Company, St Louis,
MO, USA U. vignae CPRI
Phaseolus vulgaris ’Primel’ Enza Zaden Deutschland GmbH & Co. KG, Dannstadt-Schauernheim
U. appendiculatus SWBRI
Tabelle 2-7 Übersicht über verwendetes Pflanzenmaterial sowie Herkunft und Inokulum
2.7.1 Kultivierung und Inokulation von V. faba, V. unguiculata und P. vulgaris
Jeweils vier Samen von V. faba, V. unguiculata oder P. vulgaris wurden in einem Topf (∅
14 cm) mit gedämpfter Einheitserde ausgelegt und für 21 Tage in Phytokammern (Heraeus Vötsch Typ VVZPHQ 200/S) bei 21 °C und einer Tag- Nacht- Periode von 16/8 h angezogen.
Die für die Inokulation verwendeten Uredosporen des entsprechenden Rostes (Tabelle 2-7) wurden in einer Uredosporen-Milchpulversuspension (25 mg Uredosporen + 35 mg Milch-pulver + 50 ml H2Odest) mit einer Druck-Pump-Sprühflasche auf die Pflanzen aufgebracht.
Die Pflanzen wurden für 24 h bei 100% Luftfeuchtigkeit im Dunkeln inkubiert und danach im Gewächshaus bei einer Tag-Nacht-Periode von 16/8 h für sechs bis 14 Tage kultiviert. Sollten infizierte bzw. nicht infizierte Blätter für eine RNA-Extraktion (2.9.2.1) gewonnen werden, erfolgte die Blatternte 28 Tage nach Bohnenaussaat (7dpi). Die Ernte von Uredosporen für weitere Inokulationen erfolgte in einem Zeitraum zwischen 7-15 Tage nach der Inokulation.
Die Sporen wurden bei –80 °C gelagert.
2.7.2 Kultivierung und Inokulation von M. sativa und M. truncatula
Die Samen von M. sativa oder M. truncatula `Jemalong´ A17 wurden auf gedämpfter Einheitserde ausgesät und nach einer Woche pikiert. Die Anzucht erfolgte in Phytokammern (Heraeus Vötsch Typ VVZPHQ 200/S) bei 21 °C und einer Tag-Nacht-Periode von 16/8 h.
Drei Wochen nach dem Pikieren konnten die Pflanzen mit Uredosporen von Uromyces striatus inokuliert werden. Für die Inokulation wurden die Sporen in Kerosin suspendiert (10 mg Sporen pro ml Kerosin) und mit Hilfe einer Sogolee HP-200 Airbrush- Pistole mit 0,2 mm Sprühdüse (Conrad, Hirschau, Deutschland) auf die Pflanzen aufgebracht.
Mit einer Druck-Pump-Sprühflasche wurden die Pflanzen nach Abdampfen des Kerosins leicht befeuchtet und für 16 h im Dunkeln bei 20 °C inkubiert. Nach dieser Behandlung wurden die infizierten Luzernen für 8 bis 14 Tage im Gewächshaus kultiviert. Uredosporen konnten in einem Zeitraum zwischen 10 bis 14 Tage nach Inokulation geerntet und bis zu ihrer Verwendung bei -80 °C eingelagert werden.
2.7.3 Keimung von Uredosporen von Uromyces fabae
Die DNA-Präparationen wurden nach einem Protokoll von Hahn und Mendgen (1997) durchgeführt. Die Uredosporen wurden mit 0,01% Tween20 für 30 min gewaschen. Die gewaschenen Sporen wurden in 0,01% Tween20 (0,5 Liter pro g Sporen) suspendiert und die Sporensuspension wurde anschließend bei 20 °C und 300 rpm inkubiert. Nach 3 h lag die
Keimungsrate bei mindestens 70%. Die gekeimten, abgefilterten Sporen wurden mit flüssigem Stickstoff und Seesand gemörsert.
2.7.4 Kultivierung von Sporen auf Polyethylenfolien
In vitro differenzierte Rostinfektionsstrukturen wurden auf gekratzten Polyethylenfolien erzeugt (Deising, 1991). Die Polyethylenfolien (300 x 0,1 mm) wurden im Inokulationsturm mit jeweils 400 mg Sporen bestäubt. Hierzu wurden die Sporen mit Druckluft verwirbelt und nach 10 min Sedimentationszeit wurden die Folien mit einem Chromatographiesprüher leicht befeuchtet und in Kunststoffkisten bei 20 °C sowie einer relativen Luftfeuchtigkeit von über 80% im Dunkeln inkubiert. Die Dauer der Inkubation wurde den gewünschten Differenzierungsstadien angepasst: 6 h (Appressorien), 12 h (Substomatäre Vesikel), 18 h (Infektionshyphen) und 21 h (Haustorienmutterzellen).
2.7.5 Haustorienisolierung aus U. fabae bzw. U. striatus infizierten Blättern
Haustorien konnten über ConA Affinitätschromatographie nach einem veränderten Protokoll von Hahn und Mendgen (1997) aus infizierten Blättern isoliert werden.
Infizierte Blätter wurden sieben Tage nach Inokulation abgeerntet und im Verhältnis 1:8 (w/v) mit Homogenisierungsmedium (0,3 M Sorbitol, 20 mM MOPS pH 7,2, 0,1% (w/v) BSA, 0,2% β-Mercaptoethanol, 0,2% PEG 6000) gemischt und 20 sec in einem Mixer (Bender &
Hobein, Bruchsal, Deutschland) bei maximaler Leistung homogenisiert. Erfolgte im An-schluss an die Haustorienpräparation keine RNA-Extraktion sondern eine Proteinextraktion wurde statt 0,2% β-Mercaptoethanol dem Homogenisierungsmedium 0,2 mM PMSF zuge-setzt.
Um grobe Blattrückstände und Hyphen zu entfernen, wurde die Suspension durch eine Nylon-Gaze (PA-20/14 Nybolt, Franz Eckert GmbH, Waldkirch, Deutschland) mit einer Maschenweite von 20 µm gefiltert. Der Filtrationsschritt wurde wiederholt und das Filtrat für 5 min bei 6.500 rpm und 4 °C in einem SS34 Rotor zentrifugiert. Die Pellets wurden in insgesamt 6 ml Suspensionsmedium (0,3 M Sorbitol, 10 mM MOPS, pH 7,2, 0,2% BSA, 0,1 mM PMSF, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2) resuspendiert.
Für die anschließende ConA Affinitätschromatographie wurde eine ConA-gekoppelte Säule hergestellt. 2,5 g CNBr-aktivierte Sepharose 6MB® (GE Healthcare, München, Deutschland) wurden in 1 mM HCl unter ständigem Rühren imbibiert. Das gequollene Säulenmaterial wurde anschließend mit dem 10fachen Volumen 1 mM HCl für etwa 15 min über eine ge-sinterte Glasfritte (Porengröße 3) gewaschen. 53 mg des Lectins ConcanavalinA (Serva,
Heidelberg, Deutschland) wurden in 12 ml Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3) gelöst. 12 ml des in Kopplungspuffer resuspendierten, gequollenen Säulenmaterials wurde mit dem gelösten ConcanavalinA in ein 50 ml Greiner Röhrchen überführt und bei 8 °C auf einem Roller über Nacht inkubiert. Um Reste des nicht gebundenen Lectins zu entfernen, wurde über eine Glasfritte mit Kopplungspuffer gewaschen. Hierauf folgte ein kurzer Waschschritt mit 0,2 M Glycin, pH 8,0. Noch freie reaktive Gruppen der Säulenmatrix konnten durch 2 h Inkubation des Säulenmaterials bei RT in 0,2 M Glycin, pH 8,0 abgesättigt werden. Nicht kovalent gebundenes ConcavalinA wurde durch alternierende Waschschritte mit jeweils gleichen Volumina an Acetatpuffer (0,1 M NaAcetat, 0,5 M NaCl, pH 4,0) und Kopplungspuffer, welche dreimal wiederholt wurden, entfernt. Das Säulenmaterial wurde in Suspensionsmedium aufgenommen und in Poly-Prep Chromatography-Säulen (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland) gefüllt, bei welchen zuvor die gesinterte Scheibe gegen eine etwa 0,5 cm hohe Schaumstoffscheibe ausgetauscht worden war. Die Säule wurde mit Suspensionsmedium gespült, welches vor dem Auftragen der Blattsuspen-sion entfernt wurde.
Die Blattsuspension wurde tropfenweise aufgetragen und 15 min mit dem Säulenmaterial inkubiert. Die Suspension wurde langsam abgelassen und die Säule so lange mit Suspen-sionsmedium gespült, bis das Eluat frei von Chloroplasten war. Bei geschlossener Klemme wurden 2 ml Suspensionsmedium auf die Säule gegeben und durch kräftiges Auf- und Abpipettieren des Säulenmaterials mit einer 3 ml Kunstoff-Einmalpipette die an die Säule gebundenen Haustorien durch Scherkräfte abgelöst. Mit einer 1 ml Automatikpipette wurde die Haustoriensuspension über der Schaumstoffscheibe abgenommen und in Eppendorf-reaktionsgefäße überführt. Der Schritt zum Abscheren der Haustorien wurde einmal wieder-holt. Um Verunreinigungen mit Säulenmaterial zu vermeiden wurde nach einer Sedimenta-tionszeit von 5 min der Überstand aus den Eppendorfreaktionsgefäßen in neue überführt. Die Probe wurde für 5 min bei 4 °C und 14.000 rpm abzentrifugiert und das Pellet entweder in flüssigem Stickstoff eingefroren oder für eine RNA Isolation sofort in 250 µl PeqGOLD RNAPureTM (Peqlab, Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland) aufgenommen. Wurde die Präparation zur RNA-Extraktion genutzt, wurde das gesamte Extraktionsprotokoll bei 8 °C durchgeführt. Die RNA-Extraktion aus den Haustorien erfolgte wie unter 2.8.7.3 beschrieben.
Die in flüssigem Stickstoff eingefroren Haustorienpellets wurden zur Proteinanalyse in 100 µl 4x Probenpuffer (siehe 2.10.15) aufgenommen.