Der Weg des RTP1p in die pflanzliche Zelle

In den letzten Jahren wurde immer deutlicher, dass phytopathogene Pilze und Oomyceten, genau wie phytopathogene Bakterien, durch Sekretion von Proteinen als Effektormoleküle Einfluss auf den pflanzlichen Wirtsorganismus nehmen können. Bei vielen dieser Proteine handelt es sich um relativ kleine Proteine unter 200 Aminosäuren, die eine Rolle für die Virulenz der Pathogene spielen (Rep, 2005). Die Ziele dieser Effektorproteine sind sehr unterschiedlich und reichen vom pflanzlichen Apoplast, dem Xylem, der pilzlichen und pflanzlichen Zellwand bis zum pflanzlichen Cytoplasma (Rep, 2005). So werden Avr2, Avr9 und ECP1-5 aus C. fulvum von entsprechenden R-Genen im apoplastischen Raum von Tomatenblättern erkannt (Kooman-Gersmann et al., 1996). Das kleine, Cystein-reiche Six1 Protein wird vom nekrotrophen F. oxysporum f. sp. lycopersici während der Kolonisierung des Xylems sekretiert und wird dort von seinem entsprechenden Resistenzprotein I-3 erkannt (Rep et al., 2005). PtrTox A, welches von einem nekrotrophen Pilz, Pyrenophora tritici-repentis, sekretiert wird, ist ein Beispiel für ein Protein, welches in der Lage ist in Toxin-sensitiven Weizenkultivaren cytoplasmatische Kompartimente und den Chloroplasten zu er-reichen (Manning und Ciuffetti, 2005). Für die Aufnahme wird rezeptorvermittelte Endo-cytose postuliert, jedoch ist der weitere Transfer aus den endocytotischen Kompartimenten unbekannt (Manning und Ciuffetti, 2005). Über Co-Expression konnte für die von den Oomyceten Phytophthora infestans und Perenospora parasitica sekretierten Proteine Avr3a (Armstrong et al., 2005) bzw. ATR13 (Allen et al., 2004), eine Interaktion mit den ent-sprechenden Resistenzproteinen im pflanzlichen Cytoplasma gezeigt werden. Dies legt einen Transfer der Proteine vom Oomyceten-Haustorium in die Wirtszelle nahe. Wenn auch bisher der genaue Transfermechanismus nicht bekannt ist, so konnte bei vielen der sekretierten Proteine von Phytophthora Spezies ein konserviertes „Wirtszell targeting signal“ (RxLR) identifiziert werden (Bhattacharjee et al., 2006). Dieses ist dem bei Plasmodium Spezies be-kannten PEXEL Motiv für die Translokation von Proteinen des Malariaparasiten in den Erythrozyten sehr ähnlich (Birch et al., 2006). In jüngster Zeit verdichten sich die Hinweise, dass auch bei höheren Pilzen die sekretierten Proteine in die pflanzliche Zelle transportiert werden. So wurde zum Beispiel für das von Magnaporthe grisea sekretierte Avr-Pita eine Bindung an das entsprechende pflanzliche, cytoplasmatische Resistenzprotein gezeigt (Jia et al., 2000). Auch das von Melampsora lini exprimierte AvrL567 wird wahrscheinlich in die Wirtszelle transportiert, denn die cytoplasmatische Co-Expression des Proteins und des

pas-senden Resistenzgens führt zu einer hypersensitiven Reaktion (Dodds et al., 2004). In allen für höhere Pilze beschriebenen Fällen wurden indirekte Beweise, wie zum Beispiel das Vor-handensein eines Sekretionssignals, ein avirulenter Phänotyp oder die Co-Expression in planta als Hinweise für einen Transfer in die pflanzliche Zelle herangezogen. Es fehlte aber der direkte Beweis für den Transfer der Proteine in die pflanzliche Zelle.

Anders bei Uf-RTP1p: Mit einem ersten Antikörper wurden Indizien für eine Lokalisation sowohl in der extrahaustoriellen Matrix als auch im Kern der Wirtspflanze gesammelt (Hempel, 2006). Um diese außergewöhnliche Lokalisation weiter zu untersuchen, und zu verifizieren, wurde die Herstellung zusätzlicher Antikörper notwendig. Der cytologische Ansatz wurde gewählt, da Rostpilze zu den obligat biotrophen Pilzen gehören, für welche bis zum jetzigen Zeitpunkt noch kein stabiles Transformationssystem existiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden sechs verschiedene RTP1p spezifische polyklonale Antikörper hergestellt, die sowohl zur Untersuchung des Transfers, als auch für die weitere Charakterisierung von RTP1p herangezogen wurden. Mit ihnen wurde die Identifizierung und Charakterisierung der drei RTP1p Homologen Us-RTP1p, Ua-RTP1p und Uv-RTP1p ermöglicht, und damit die Grundlage zur Identifikation von Proteineigenschaften geschaffen, die für den Transfer und die Lokalisation von RTP1p verantwortlich sein könnten.

Die in der Mikroskopie eingesetzten Antikörper zeigen die Akkumulation und somit indirekt die Sekretion des RTP1p in die extrahaustorielle Matrix. Diese Anreicherung könnte mit der Impermeabilität der extrahaustoriellen Membran für Proteine erklärt werden. Mit den Seren S746p, S805p, S844p, S849p und S894p ist bei der Untersuchung fortgeschrittener haustorieller Entwicklungsstadien ein Immunsignal im pflanzlichen Cytoplasma zu beob-achten, welches gradientartig ausgehend vom Haustorium abnimmt. Im Vergleich zu den anderen Seren hat S907p einen relativ niedrigen Titer, so dass das in der pflanzlichen Zelle in geringer Konzentration vorkommende RTP1p nicht mehr nachgewiesen wird. Auch die Western Blot Analysen mit den verschiedenen Antikörpern zeigen entsprechende Unter-schiede in der Signalstärke, die auf unterschiedliche Titer der Seren zurückgeführt werden können. Die von Hahn et al. (1993) beschriebene Eigenschaft, dass Antikörpertiter und -spezifität zwischen den einzelnen zur Immunisierung verwendeten Individuen stark variieren können, kann somit auch für die unterschiedlichen RTP1p Antikörper beobachtet werden.

Eine weitere Erklärung für die ausbleibende Markierung des pflanzlichen Cytoplasmas mit S907p könnte das Fehlen der Subpopulation der Antikörper sein, die das transferierte Protein erkennt. Die Unterschiede der Subpopulationen der Antikörper zwischen zwei Seren ist einer der Nachteile bei der Arbeit mit polyklonalen Antikörpern, welcher jedoch durch den Vorteil

der Kreuzreaktivität für taxonomische Studien ausgeglichen wird (Hahn et al., 1993). Durch die Verwendung von zwei verschiedenen Pathosystemen und den beschriebenen sechs Anti-körpern wurde versucht die Artefakte durch die individuelle Antigenantwort der Antikörper produzierenden Organismen zu minimieren (Sweet et al., 1991; Schecklies, 1996). Zudem wurde für die Reinigung aller Antikörper ein Doppelreinigungsprotokoll mit Negativ- und Positivadsorption angewendet, um Artefakte durch konstruktbedingte und im Antikörper-spenderorganismus schon vor der Immunisierung vorhandene Antikörper zu reduzieren (Voegele et al., 2001).

Um weitere Artefakte durch eine Kreuzreaktion der Antikörper mit Glykanen auszuschließen, wurden für den Immunnachweis mit allen Antikörpern Protease behandelte und chemisch deglykosylierte Schnitte als Kontrollen verwendet. Nach Proteasebehandlung verschwand das Immunsignal komplett, nach Deglykosylierung blieb es erhalten, was als Hinweis auf ein proteinspezifisches Signal gewertet werden kann. Bei der mit den verschiedenen RTP1p Antikörpern wiederholt gezeigten Lokalisation im pflanzlichen Cytoplasma handelt es sich um eine auf besondere Charakteristika von RTP1p zurückführbare Eigenschaft. Dies wird durch die Tatsache bekräftigt, dass unter den anderen gegen U. fabae Proteine erzeugten, ge-reinigten und immuncytochemisch in Rost-infiziertem Blattmaterial ausgetesteten Antikör-pern, keiner ein zu RTP1p vergleichbares Lokalisationsmuster aufwies (Kemen et al., 2005).

Durch die hohe Spezifität für RTP1p eigneten sich die Seren S844p und S746p auch für elektronenmikroskopische Lokalisationsstudien von RTP1p und damit für die weitere Auf-klärung des Transfermechanismus von RTP1p in die Pflanzenzelle (Kemen et al., 2005). So-wohl in den Western Blot Analysen, als auch in der Immunocytologie, ließen sich die ver-schiedenen Glykoformen von RTP1p in vier verver-schiedenen Rosten nachweisen. Die Glyko-sylierung scheint die Erkennung von RTP1p durch Antikörper nicht zu beeinträchtigen, da nach der Deglykosylierung mit Endoglucosidase Hf keine Verbesserung der Erkennung der Proteine auftrat. Die Herstellung RTP1p spezifischer Antikörper ermöglichte die direkte Lokalisation in infiziertem Blattmaterial und damit den ersten, über verschiedene Antikörper abgesicherten Beweis für den Transfer eines glykosylierten, pilzlichen Proteins in das Cytoplasma der pflanzlichen Wirtszelle. Zudem ermöglichten die oben beschriebenen Anti-körper die Analyse posttranslationaler Modifikationen sowie die nähere Charakterisierung potentieller Interaktionspartner. Es konnten wichtige Informationen über Struktur und Eigen-schaften von pilzlichen Effektorproteinen gewonnen werden, die bisher für diese Protein-gruppe nicht vorlagen.

4.2.2 Charakteristika für die Lokalisation in der extrahaustoriellen Matrix