Charakteristika, die den Transfer vermitteln

Der Transfer von Proteinen in die Wirtszelle ist heute für bakterielle Pathogene ein gut verstandener Mechanismus (Alfano und Collmer, 1996; Büttner und Bonas, 2003). Bakterielle Effektorproteine werden direkt über ein Typ III Sekretionssystem in die Wirtszelle injiziert (Ghosh, 2004). Obwohl sich die Hinweise für verschiedene Transfermechanismen von Pilz- und Oomyceten- Proteinen verdichten, konnte für keines dieser Proteine bisher der komplette Transfermechanismus geklärt werden. So wird entweder durch Interaktion mit einem intra-zellulär gelegenen Resistenzprotein (AvrL567 von M. linii (Dodds et al., 2004), Avr-Pita von M. grisea (Jia et al., 2000)), aus der Lokalisation des Toxins ToxA in den pflanzlichen Chloroplasten der Zielzelle (Tuori et al., 2000), oder durch das Vorhandensein eines RxLR Motivs, einem Aufnahmemotiv in den Sequenzen von sekretierten Oomycetenproteinen, auf einen Transfer geschlossen. Durch die vorliegende Arbeit konnte die Lokalisation von RTP1p

im Cytoplasma der Wirtszelle abgesichert werden (siehe 3.2.4.2), und die biochemische Analyse des Proteins gab erste Hinweise auf den Transfermechanismus.

Untersucht man alle bekannten, in Pflanzenzellen sekretierte Proteine auf Sequenz-gemeinsamkeiten, so kann bei AVR Proteinen von Oomyceten das RxLR Motiv identifiziert werden, das hohe Ähnlichkeit zum PEXEL Motiv (R/KxLxE/Q) aufweist (Marti et al., 2005;

Birch et al., 2006). Offensichtlich spielt dieses Motiv eine Rolle bei der Aufnahme dieser Proteine ins Wirtscytoplasma, der genaue Aufnahmemechanismus ist bisher jedoch unbekannt (Bhattacharjee et al., 2006). Bei den von höheren Pilzen sekretierten Proteinen, für welche ein Transfer in die Pflanzenzelle vermutet wird, konnte bisher kein entsprechendes Motiv identifiziert werden (Ellis et al., 2006). RTP1p weist weder ein RxLR noch ein PEXEL Motiv auf, jedoch können bei allen drei RTP1p Vertretern verkürzte RxL Motive gefunden werden.

Das erste RxL Motiv liegt 35 Aminosäuren nach dem Sekretionssignal und damit in der für Oomyceten (32 AS nach der Signalsequenz (Birch et al., 2006)) und für Plasmodium (15-20 AS nach der Signalsequenz (Marti et al., 2005)) beschriebenen Region. Es tritt bei Uf-RTP1p und Ua-RTP1p auf, kann jedoch nicht bei Us-RTP1p identifiziert werden. Bei der Prozes-sierung durch die Kexin Protease Familie wird dieses RxL Motiv zerstört, so dass es beim vollständig prozessierten RTP1p in der extrahaustoriellen Matrix fehlt und damit nicht für den Übertritt verantwortlich sein kann. Das zweite, bei allen RTP1p Vertretern gefundene RxL Motiv liegt 158-161 AS nach dem Sekretionssignal und damit ungewöhnlich weit hinten in der C-terminalen Region, was seine Bedeutung für RTP1p in Frage stellt.

Da RTP1p keine weiteren Sequenzgemeinsamkeiten zu den anderen potentiell transferierten Proteinen zeigt, kann davon ausgegangen werden, dass der Transfermechanismus nicht auf der Erkennung eines bekannten Sequenzmotivs beruht.

Für den Transfer von RTP1p aus der extrahaustoriellen Matrix ins Cytoplasma der Zelle wäre ein Proteintransporter vorstellbar, welcher pilzlichen oder pflanzlichen Ursprungs sein könnte.

Allerdings sind zum jetzigen Zeitpunkt keinerlei Proteintransporter in der pflanzlichen Plasmamembran bekannt, welche von RTP1p zur Aufnahme in die pflanzliche Zelle genutzt werden könnten. Durch die in dieser Arbeit durchgeführten Far Western Blot Analysen sowie die Immunopräzipitationsstudien konnten verschiedene potentielle Interaktionspartner von RTP1p identifiziert werden, welche unter Umständen einen Transporter in der Plasma-membran repräsentieren könnten. Bei den meisten Transportern erfolgt der Transfer in ungefaltetem oder partiell gefaltetem Zustand (Agarraberes und Dice, 2001), so dass RTP1p im Cytoplasma mit Hilfe von Chaperonen wieder rückgefaltet werden müsste. Die im Rahmen dieser Arbeit beobachtete ausgeprägte Proteinase K Resistenz lässt vermuten, dass es

sich bei RTP1p um ein Protein mit stabiler Sekundär- und Tertiärstruktur handelt. Wird RTP1p aus Extrakten infizierter Pflanzen aufgereinigt, so beobachtet man eine vollständig deglykosylierte Form, welche RTP1p im Cytoplasma der Pflanze entsprechen könnte. Mit Ausnahme von Sec61p in der Membran des ER sind bisher keine Proteintransporter bekannt, die glykosylierte Proteine transportieren. Eine Deglykosylierung in der extrahaustoriellen Matrix ist unwahrscheinlich, da keine sekretierten Endoglucosidasen bekannt sind. Der Transfer des glykosylierten RTP1p über einen Transporter ist daher eher unwahrscheinlich.

Eine weitere Möglichkeit der RTP1p Aufnahme ist die Rezeptor-vermittelte Endocytose, welche über die Sphingolipid-Binde-Domäne (3.10.1) erfolgen könnte. Die Beobachtung, dass RTP1p bei Pelletierungsversuchen mit nativen Extrakten aus infizierten Pflanzen in den Pelletfraktionen auffindbar ist, kann als Hinweis auf die Bindung von RTP1p an Sphingo-lipide und damit auf eine Membranassoziation gewertet werden. Zudem konnte RTP1p bei ΠRTP1p exprimierenden Zellen in einem Saum um die Zelle herum lokalisiert werden, was auf die Interaktion der Sphingolipid-Binde-Domäne mit Sphingolipiden der Hefezellwand zurückgeführt werden könnte. Für das pflanzliche Toxin Ricin konnte eine endocytotische Aufnahme in Säugerzellen über die Bindung an Glykolipide, die terminale Galaktosereste aufweisen, nachgewiesen werden (Lord et al., 1994; Sandvig und van Deurs, 1994). Für Prionproteine wird ebenfalls eine Interaktion mit Sphingolipiden postuliert (Mahfoud et al., 2002; Taylor und Hooper, 2006). Fantini (2003) beschreibt, dass durch die Bindung an Sphingolipide diese Proteine nicht nur in ein „lipid raft“ dirigiert werden, sondern die Sphingolipide auch eine Art Chaperon Aktivität ausüben und dadurch die Konformation des Proteins beeinflussen. Bei RTP1p könnte die Bindung an ein Sphingolipid die Aggregation während des endocytotischen Prozesses steuern, so dass es vornehmlich in der nicht aggre-gierten Form vorliegt. Bei PrP liegt, wie bei RTP1p, die Sphingolipid-Binde-Domäne in der C-terminalen Domäne des Poteins (Heske et al., 2004; Taylor und Hooper, 2006). Bei den meisten, über die Bindung an Glykolipide aufgenommenen Toxinen handelt es sich um AB Toxine. Diese sind aus einer A und einer bzw. mehrerer, über eine Disulfidbrücke verbundene B Untereinheiten aufgebaut, welche durch proteolytische Spaltung aus einem Propeptid hervorgehen (Falnes und Sandvig, 2000), wie dies auch bei RTP1p der Fall sein könnte. Wie bei Ricin könnte auch bei RTP1p das, der B Untereinheit entsprechende reife Protein, mit der Sphingolipid-Binde-Domäne, den Transfer des Propeptids vermitteln.

RTP1p konnte von Kemen (2006) in der pflanzlichen Zelle, in vesikelartigen Strukturen und dem Golgi lokalisiert werden. Dies legt die Annahme nahe, dass RTP1p über den retrograden Transportweg das Cytoplasma der Pflanze erreicht. Der erste Schritt hierbei ist der Transport

von den frühen Endosomen in das trans-Golgi Netzwerk (Sandvig und van Deurs, 2002). Für den Transfer vom trans-Golgi Netzwerk ins ER gibt es verschiedene Möglichkeiten. Eine ist, die Bindung des zu transportierenden Proteins über eine KDEL Sequenz an einen KDEL Rezeptor, welcher das Protein über den COP1 abhängigen Weg ins Lumen des ER trans-portiert (Spooner et al., 2006). Da alle drei RTP1p Vertreter keine KDEL Sequenzen aufweisen, ist der retrograde Transport über diesen Mechanismus unmöglich. Denkbar wäre, dass RTP1p im Golgi von Protein Disulfidisomerasen (PDI) an Hand seiner Disulfidbrücken erkannt wird. PDI selbst hat eine C-terminale KDEL Sequenz, welche eine Interaktion mit KDEL Rezeptoren an der Membran des Golgi vermittelt. Der PDI^.KDEL Rezeptor Komplex wird dann ins ER zurück transportiert (Jiang et al., 1999). Sowohl Ricin als auch dem Shiga Toxin fehlen KDEL Motive, dennoch erreichen sie das ER Lumen indem sie die Golgi Cis-ternen umgehen. Hierzu nutzen beide Proteine einen schnellen retrograden Transportweg der unabhängig von Cop-I Vesikeln und KDEL Retentionssequenzen ist (Spooner et al., 2006).

Auch das Choleratoxin wird über einen Glykolipid abhängigen Weg transportiert, der den Golgi umgeht, wobei das Glykolipid als Transportvehikel von der Plasmamembran zum ER dient (Lencer und Tsai, 2003). Ein ähnlicher Weg wäre auch für RTP1p denkbar. Obwohl RTP1p mit keinem der zur Verfügung stehenden Antikörper elektronenmikroskopisch im ER der pflanzlichen Zelle lokalisiert werden konnte, ist davon auszugehen, dass RTP1p dieses er-reicht (Kemen, 2006). Denn auch im pilzlichen ER konnte RTP1p nie lokalisiert werden, ob-wohl es dieses als sekretiertes, glykosyliertes Protein passiert. Gründe für den fehlenden Nachweis im ER könnten ein schneller Transport durch dieses Kompartiment sowie eine niedrige Anzahl an RTP1p Molekülen pro Membranfläche, verglichen mit den anderen Kom-partimenten oder gar der extrahaustoriellen Membran sein. Auch Ricin konnte mikroskopisch noch nie im ER nachgewiesen werden (Sandvig und van Deurs, 2002).

Aus dem ER können falsch gefaltete Proteine über einen Prozess der ERAD genannt wird über das Sec61 Translokon ins Cytosol der Zelle transportiert werden (Spooner et al., 2006).

Hierfür müssen die Proteine aufgefaltet werden. Sowohl beim Choleratoxin als auch bei Ricin erfolgt die Reduktion der Disulfidbrücken zwischen den Untereinheiten durch eine Protein Disulfidisomerase unter Nutzung ER eigener Chaperone (Spooner et al., 2006) (Sandvig und van Deurs, 2002). Bei der Erkennung spielen bei RTP1p unter Umständen ebenfalls Disulfidbrücken im Protein eine Rolle. Die Disulfidbrücken müssten im Fall des Transfers durch das Sec61 Translokon reduziert werden, damit RTP1p als falsch gefaltet erkannt würde.

Bei den AB-Toxinen wird vermutet, dass eine Exposition hydrophober Regionen ebenfalls den Eintritt in den ERAD Weg erleichtert (Hazes und Read, 1997). RTP1p weist wie das

Choleratoxin mehrere kurze hydrophobe Subdomänen, vor allem im N-terminalen Bereich des Propeptids auf, welche nach Reduktion der Disulfidbrücken in eine exponierte Lage kommen könnten.

Für RTP1p wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass es sich um ein glykosyliertes Protein handelt, dessen Glykosylierung bei der Erkennung für die ERAD eine Rolle spielen könnte. An der Erkennung von falsch glykosylierten Proteinen ist im ER das α–Mannosidase I-like protein (EDEM) beteiligt, welches durch die Bildung von Mannose-N-acetylglucos-amine Man8GlcNAc2 Isomer B, das Signal für die ERAD schafft (Molinari et al., 2003;

Spiro, 2004; Slominska-Wojewodzka et al., 2006). RTP1p könnte auf Grund seiner im trans-Golgi Netzwerk des Rostpilzes modifizierten Glykosylierung als Zielprotein für den ERAD Weg erkannt werden. Bei dem Versuch natives RTP1p mit Hilfe von verschiedenen Exo-glucosidasen zu verdauen konnte mit keinem der verwendeten Enzyme eine Veränderung des Molekulargewichts beobachtet werden, was auf eine Modifizierung der endständigen Zuckereinheit deuten könnte, die ebenfalls als Recycling Signal verstanden werden könnte.

Falsch gefaltete Proteine werden über den Sec61p Komplex ins Cytosol transportiert, wo sie ubiquitinyliert und durch das Proteasom abgebaut werden (Sandvig und van Deurs, 2002).

Wie das Choleratoxin und Ricin (Spooner et al., 2006), könnte RTP1p dieses Translokon für seinen Transport ins pflanzliche Cytoplasma nutzen. Beide Proteine konnten mit sec61 co-immunopräzipitiert werden (Spooner et al., 2006). Auch bei den Immuno-Co-Präzipitationen mit RTP1p wurden verschiedene Partner identifiziert, die potentielle Komponenten des Sec61p Komplexes darstellen könnten.

Die ausgeschleusten Proteine werden an Lysinresten polyubiquitiniert (Spooner et al., 2006).

Die AB-Toxine scheinen dem Ubiquitin-vermittelten Proteinabbau durch eine Reduzierung der Lysinreste in der Sequenz zu begegnen (Hazes und Read, 1997; Deeks et al., 2002). Wenn Lysinreste auftreten, liegen diese entweder nahe des N- oder C-Terminus. Es wird vermutet, dass die Ubiquitinylierung an diesen Positionen weniger wahrscheinlich ist (Hazes und Read, 1997). Auch bei den einzelnen RTP1p Vertretern ist eine Häufung der Lysine im N-termi-nalen Bereich des prozessierten reifen Proteins zu beobachten.

Für Ricin wird postuliert, dass es nach der Translokation nicht mit Proteasomen, sondern mit Ribosomen interagiert, die das Protein rückfalten und es extrem stabil gegen die Proteolyse machen (Lord et al., 2003). Von Rassow et al. (1995) und Yao et al. (2001) wurde postuliert, dass die Interaktion von Phosphothreonin-Prolin Motiven mit WW Domänen eine unter-stützende Funktion bei der Proteinfaltung hat. Auch bei RTP1p könnten die vorhandenen

Phosphothreonin-Prolin Motive für eine schnelle Rückfaltung des Proteins sorgen und somit vor dem Abbau schützen.

Die Retrotranslokation des falsch gefalteten Proteins während der ERAD ist mit einer N-De-glykosylierung der Glykoproteine mit Hilfe einer Peptid:N-Glycosidase (PNGase) verbunden (Spiro, 2004). Auch bei RTP1p kann daher eine Deglykosylierung im Zuge des Transfers ins Cytoplasma postuliert werden. Nach einer Immunoaffinitätschromatographie mit dem Pflanzenextrakt infizierter Pflanzen kann eine RTP1p Isoform mit 18 kDa isoliert werden.

Diese entspricht dem vollständig prozessierten reifen Protein, welches nach Deglykosylierung durch die PNGase zudem ohne N-Glykosylierung vorliegen würde. Bei der Deglykosylierung des nativen RTP1p mit Hilfe von Endoglucosidase Hf konnte beobachtet werden, dass diese nach Denaturierung des Proteins sehr viel effektiver war als beim gefalteten Protein. Da im Zuge des ERAD die Proteine teilgefaltet vorliegen, erleichtert dies die Deglykosylierung. Das Auftreten des RTP1p ohne N-Glykosylierung, in den Extrakten aus infizierten Pflanzen, und sein Fehlen in Proteinextrakten aus isolierten Haustorien ist ein Hinweis auf die Nutzung des ERAD für die Retrotranslokation von RTP1p.

4.2.4 Lokalisation im pflanzlichen Cytoplasma bzw. in den pflanzlichen