RTP1p-RTP1p Interaktion Multimerisierung und Filamentbildung

angereichertem Zustand schon nach kurzer Inkubation. Dies wurde als Hinweis gewertet, dass neben den unter 4.3.1 geschilderten potentiellen Partnern, RTP1p eine Interaktion mit sich selbst eingeht. Die unter 3.10.1 beschriebene Aggregationsdomäne könnte durch die Ausbildung einer cross β-Faltblattstruktur für die beobachtete Aggregation verantwortlich sein. Über CD Spektroskopie eines synthetischen Peptids RTP1p135-155 konnte die Ausbildung antiparalleler β-Faltblätter in der Aggregationsdomäne bestätigt werden (Kemen, 2006). Die Aneinanderlagerung antiparalleler β-Faltblattstrukturen kann sowohl die Aneinanderlage-rungsenergie als auch die Anordnung und Ausrichtung der gestapelten β-Faltblätter beein-flussen (Gazit, 2002). Die generelle Struktur amyloid-ähnlicher Fibrillen wird als cross β-Struktur charakterisiert, die aus sukzessiven β-Faltblättern, stabilisiert durch

Wasserstoff-brückenbindungen entlang der Fibrillenachse, zusammengesetzt ist (Saiki et al., 2005). Als Strukturmodell wird von Saiki et al. (2005) eine Faltblatt-Faltblatt Interaktion zwischen linksgängigen cross β-Strukturen vorgeschlagen, so dass eine leicht rechtsgängige Drehung des β-Faltblattstapels des Protofilaments resultiert.

Zur Untersuchung des Multimerisierungsverhaltens von RTP1p wurden Cross-Linking Experimente mit den beiden Cross-Linkern Glutaraldehyd und Sulfo-EGS sowohl im nativen, als auch im heterologen System durchgeführt. Die in allen Fällen beobachteten Dimere und größeren Multimere, die sich zum Teil zwischen Sammel- und Trenngel befanden, zeigen, dass sowohl im nativen als auch im heterologen System RTP1p aggregiert. Damit wurde der erste Beweis erbracht, dass RTP1p nicht nur als Monomer eine Funktion bei der Etablierung der Rostinfektion spielt, sondern auch als Multimer.

In den von Kemen (2006) durchgeführten elektronenmikroskopischen Analysen mit aufge-reinigtem, ankonzentriertem ΠRTP1p, konnte nach Negativkontrastierung beobachtet werden, dass es sich bei den beobachteten Multimeren um amorphe Aggregate handelt. Diese ließen sich durch ein von Lee und Eisenberg (2003) für Prionproteine beschriebenes Red-Ox-Experiment in filamentöse Strukturen überführen. Mit Hilfe von Thioflavin T konnte gezeigt werden, dass diese Filamente durch cross β-Strukturen aufgebaut werden (Kemen, 2006).

Über einen Immunnachweis mit anschließender Negativkontrastierung wurde auch im nativen System das Vorkommen filamentartiger Strukturen bestätigt (Kemen, 2006). Amorphe Aggregate konnten im nativen System nicht gefunden werden. Dies könnte mit im heterologen System fehlenden Interaktionspartnern mit strukturgebender Funktion oder einer veränderten posttranslationalen Modifikation gegenüber dem nativen Protein erklärt werden.

Aber auch ein selteneres Auftreten von amorphen Aggregaten unter nativen Bedingungen sowie die gleiche Antigenizität von Monomeren und Plaques könnten eine Detektion im nativen System erschweren.

Die amorphen Aggregate werden im Rahmen des Red-Ox-Experiments (Lee und Eisenberg, 2003) durch stark denaturierende und reduzierende Bedingungen sowie das Absenken des pHs in Filamente umgeformt (siehe 3.10.5 und (Kemen, 2006)). Damit geht der Filament-bildung von RTP1p eine Auf- und Rückfaltung voraus, an welcher scheinbar Disulfidbrücken beteiligt sind. Auch bei der für Prionproteine beschriebenen Fibrillenbildung, wird das Protein für den Übergang in die fibrilläre Struktur erst aufgefaltet und anschließend rückgefaltet (Nelson und Eisenberg, 2006). Bei RTP1p steht die multimere, filamentbildende Form in einem Gleichgewicht zur monomeren Form, da auch im Überstand, nach der Pelletion der Filamente, RTP1p nachgewiesen werden kann. Im Unterschied zu den von Lee und Eisenberg

(2003) beschriebenen Versuchen scheint bei RTP1p die Umformung in den filamentbildenden Zustand ohne Zugabe von aggregiertem, kurz vor der Inokulation sonifiziertem Protein möglich zu sein. Eine spontane Konversion in den polymeren Zustand wurde für die beiden Hefeprionen Ure2p und Sup35p sowie für das HET-s Prionprotein des filamentösen Pilzes P. anserina beobachtet (Dos Reis et al., 2002).

Intermolekulare Disulfidbindungen scheinen nur eine untergeordnete Rolle für die Stabili-sierung der Multimere zu spielen, da in SDS und DTT behandelten, aufgekochten ΠRTP1p Proben immer noch Dimere und größere Multimere zu erkennen sind (Abbildung 3-10, Abbildung 3-22). Die sehr stabile Aggregation könnte daher durch die oben beschriebene cross β-Struktur der Aggregationsdomäne hervorgerufen werden, die Beteiligung inter-molekularer Disulfidbrücken kann jedoch nicht komplett ausgeschlossen werden. Auch bei den amyloid-ähnlichen Strukturen, welche durch das Hydrophobin Mpg1 von M. grisea ausgebildet werden, scheinen die Disulfidbrücken für die Sekretion, wichtig zu sein, nicht jedoch für die Aggregation (Kershaw et al., 2005).

Neben posttranslationalen Modifikationen und Red-Ox Zustand wirkt sich der pH Wert des umgebenden Mediums auf die Aggregationseigenschaften von RTP1p aus. Laut Vorhersage mit dem Algorithmus TANGO (Fernandez-Escamilla et al., 2004) steigt die Aggregetions-tendenz bei Absenken des pH Wertes. Das Ergebnis der Vorhersage wurde mittels Pelletions-versuchen bei unterschiedlichen pH Werten bestätigt. Die Sedimentationstendenz, und damit der Anteil des aggregierten Proteins stieg im sauren pH Bereich deutlich gegenüber dem neutralen an. Allerdings konnte im Unterschied zu den in silico Analysen auch im basischen Bereich, welcher jedoch nicht physiologisch ist, eine starke Bande in der Pelletfraktion sowie eine starke Dimerbildung beobachtet werden. Damit scheint RTP1p nur in einem sehr engen Bereich löslich zu sein. Ein weiterer Hinweis auf die Bedeutung des pH Werts für die Aggregationseigenschaft von RTP1p war die Beobachtung, dass Titration des angesäuerten P. pastoris Minimalmediums in den neutralen Bereich die Ausbeute an ΠRTP1p deutlich ver-bessert. Auch für Prionproteine wird die Variation des pH Wertes als einer der Faktoren gedeutet, der an der Umwandlung in die filamentausbildende PrP^Sc Form beteiligt ist (Bosques und Imperiali, 2003). Der pH bei welchem die maximale Fibrillenbildung für amyloide Proteine beobachtet wurde liegt nahe dem pI, an welchem das Protein am wenigsten löslich ist (Schmittschmitt und Scholtz, 2003). Das vollständig prozessiert Uf-RTP1p hat einen pI von 5,0. Damit korreliert bei RTP1p die beobachtete Aggregation im sauren Bereich mit der Löslichkeit des Proteins. Wurde Vollmedium mit einer erhöhten Salzkonzentration gegenüber dem Minimalmedium verwendet, nahm die ΠRTP1p Konzentration im Medium

deutlich ab. Damit konnte die mit Hilfe von in silico Analysen vorhergesagte erhöhte Aggre-gation in Folge reduzierter Löslichkeit bei erhöhter Osmolalität bestätigt werden.

Die Aggregation von RTP1p scheint, wie die Fibrillenbildung bei amyloiden Proteinen (Harper und Lansbury, 1997), konzentrationsabhängig zu sein, denn beim Ankonzentrieren von ΠRTP1p-haltigem Kulturüberstand konnte beobachtet werden, dass etwa die Hälfte des ΠRTP1p durch Multimerisierung verloren ging. Damit scheint beim Ankonzentrieren die kri-tische Konzentration, bei welcher die Aggregatbildung ausgelöst wird, überschritten zu werden. Bei der Ankonzentration von aufgereinigtem ΠRTP1p über Ultrazentrifugation er-reichte man den gewünschten Ankonzentrationseffekt ebenfalls nicht, da wohl auch hier die kritische Konzentration überschritten wurde.

Limitierte Proteolyse kann bei amyloiden Peptiden zur Identifizierung protektiver Regionen mit β-Faltblattstrukturen dienen (Dos Reis et al., 2002). Sowohl das native Uf-RTP1p als auch ΠRTP1p zeigen eine ausgeprägte Resistenz gegenüber Proteinase K Konzentrationen bis 40 µg/ml. Damit zeigt RTP1p eine vergleichbare Proteinase K Resistenz wie das humane Prionprotein huPrP (23-231) (Swietnicki et al., 2000) oder HET-s von P. anserina (Dos Reis et al., 2002). Eine deutlich erhöhte Resistenz gegenüber Proteinase K zeichnet β-faltblatt-reiche Oligomere aus (Swietnicki et al., 2000). Damit kann postuliert werden, dass auch RTP1p reich an protektiven β-Faltblattstrukturen ist. Jedoch im Unterschied zu Prion-proteinen aus Maus (MoPrP23-231) (Qin et al., 2000; Dos Reis et al., 2002) oder P. anserina (HET-s) (Dos Reis et al., 2002) kann bei der Proteinase K Behandlung von RTP1p kein resistentes Fragment beobachtet werden. Da sowohl beim nativen als auch beim heterologen Protein keine Größenabnahme festgestellt wurde, ist nicht davon auszugehen, dass ein kleines, stabiles Fragment auf den 12% SDS Gelen nicht mehr detektiert werden konnte.

Damit scheint bei RTP1p nicht nur der β-Faltblattbereich gegenüber einer Proteolyse resistent zu sein, vielmehr ist das gesamte Protein durch die protektive β-Faltblattstruktur geschützt.

Für das native Protein konnte beobachtet werden, dass die 26 kDa Glykoform resistenter zu sein scheint als die 24 kDa Isoform. Diese Beobachtung sowie die verminderte Protease K Resistenz des ΠRTP1p gegenüber dem nativen Protein legen den Schluss nahe, dass die Glykosylierung von RTP1p einen Einfluss auf die Quartiärstruktur des Proteins und damit dessen proteolytisches Verhalten hat. N-Glykosylierung verhindert bei Prionproteinen zwar nicht komplett die Fibrillenbildung, führt aber zu einer signifikanten Verzögerung der Fibrillogenesis (Bosques und Imperiali, 2003). Die strukturelle Rolle der N-Glykane liegt darin, dem Prionprotein Stabilität zu verleihen (Rudd et al., 2002). Die Konversion von PrP^C in die aggregierende PrP^Sc Form wird durch das Fehlen der Glykosylierung begünstigt (Rudd

et al., 2002). Auch bei RTP1p könnte in der extrahaustoriellen Matrix die beobachtete N-Gly-kosylierung die Filamentbildung verlangsamen. Wie bei PrP könnten die Glykane zur Homodimerbildung einen Beitrag leisten indem sie zur Exposition der für eine Dimerisierung nötigen Aminosäuren führen (Rudd et al., 2002). Damit könnte in der extrahaustoriellen Matrix über die Glykosylierung die Konzentration der für den Transfer zur Verfügung stehenden RTP1p-Monomere und Dimere gesteuert werden. Die Aggregatbildung wäre bei der komplett deglykosylierten 18 kDa Form von RTP1p begünstigt. Die für RTP1p im Zuge des ERAD durch die PNGase postulierte komplette Deglykosylierung würde damit die beob-achtete Filamentbildung im pflanzlichen Cytoplasma fördern. Es könnten damit in vivo zwei verschiedene Formen von Filamenten vorliegen: in der extra-haustoriellen Matrix Filamente, die aus glykosylierten RTP1p aufgebaut sind und im Cytoplasma Filamente die aus nicht glykosyliertem Protein bestehen.