Klonierung von DNA

2.9.10.1 Klonierung in Vektoren zur heterologen Expression in E. coli

Um heterologes RTP1p zur Proteinanalyse und als Antigen für die Antikörperproduktion zu erhalten, wurde entweder die komplette RTP1 Sequenz oder Teilsequenzen von RTP1 in entsprechende E. coli Plasmide kloniert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden pET28a(+) und pET32a(+) verwendet (siehe 2.5), welche die Fusion mit einem 6x His-Tag ermöglichen.

Zur Klonierung von RTP1 in einen Überexpressionsvektor, mussten Restriktionsschnittstellen an das 3` bzw. das 5` Ende der zu klonierenden Sequenz angefügt werden (Sambrook und Russell, 2001). Hierfür wurden die unten stehenden Primer entworfen (Tabelle 2-18). Bis auf pET28a::PIG7full wurde jeweils der 5’ Primer so entwickelt, dass eine für ein Fusionsprotein

ohne Signalsequenz kodierende Sequenz, „in frame“ in die Plasmidkonstrukte inseriert wurde.

Um bei der Ligation der PCR-Fragmente in den Vektor einen Einbau mit korrekter Orien-tierung zu gewährleisten, wurden an den Enden der PCR-Fragmente bevorzugt zwei verschie-dene Restriktionsschnittstellen eingeführt.

Konstrukt Insert 5’ Primer 5’ REN 3’ Primer 3’ REN

pET28a::PIG7os Uf-RTP1 28-7os-5' NcoI 28-7os-3' XhoI

pET28a::PIG7us Us-RTP1 us-PIG7-5’ NdeI us-pig7-3' EcoRI

pET28a::PIG7full Uf-RTP1 28-7f-5' NcoI 28-7f-3' NotI

pET32a::CRTP1 Uf-RTP1 (C-Terminus) 28-7cterm_5'Nco NcoI 28-7os-3' XhoI

pET32a::NRTP1 Uf-RTP1 (N-Terminus) 28-7os-5' NcoI 28-7nterm-3'Xho XhoI

Tabelle 2-18 Übersicht über die, für die Expression in E. coli hergestellten Konstrukte REN (Restriktionsendonuklease)

2.9.10.2 Klonierung in Vektoren zur heterologen Expression in P. pastoris

Zur Herstellung ausreichend hoher Konzentrationen an rekombinantem RTP1p, in funktio-neller Form, wurde RTP1p heterolog in P. pastoris exprimiert. Da P. pastoris sowohl eine intrazelluläre als auch eine sekretorische Expression erlaubt, wurden sowohl der Vektor pPIC3.5 (bei Verwendung des RTP1p-eigenen Sekretionssignals) als auch der Vektor pPIC9 (Sekretionssignal des α-Faktors von S. cerevisiae) verwendet (siehe 2.5). Zur Klonierung von RTP1 in den entsprechenden Vektor mussten, wie für die Konstrukte in E. coli, Restriktions-schnittstellen an das 3` bzw. das 5` Ende der zu klonierenden Sequenz angefügt werden (Sambrook und Russell, 2001). Hierfür wurden die unten stehenden Primer entworfen (siehe Tabelle 2-19). Bei Integration in der „Multiple Cloning site“ steht das ligierte RTP1 unter Kontrolle des P. pastoris AOX1 Promotors, der durch Methanol induziert und durch Glycerin oder Glucose reprimiert wird. Die Transkriptionsterminationssequenz des P. pastoris AOX1 Gens führt zu effizienter 3’ Prozessierung und Polyadenylierung. Zudem tragen die Vektoren pPIC3.5 und pPIC9 das P. pastoris HIS4 Gen für die Selektion von Transformanten, bei Transformation in HIS4 defiziente KM71 Zellen.

Über die Primer 35-RTPosneu3', Pig7-f-his3’, 35usrtp1fh3', 35-7nterm-3'Avr, 35-7n2term-3'Avr wurde zusätzlich ein 6x His-Tag eingeführt, der die Aufreinigung des Proteins ermöglichen sollte.

Für die über Linker-Scanning Mutagenese hergestellten Konstrukte pPIC3.5::N78Q, pPIC3.5::N127Q, pPIC3.5::N78/127Q sind die Primer angegeben, welche zur Klonierung in den Vektor pPIC3.5 dienten.

Konstrukt Insert 5’ Primer 5’ REN 3’ Primer 3’ REN

pPIC3.5::PIG7full-5 Uf-RTP1 PIG7-full-5 EcoRI PIG7-full-3 NotI

pPIC3.5::RTP1osh Uf-RTP1 35-RTPosneu5' EcoRI 35-RTPosneu3' NotI

pPIC3.5::ΠRTP1 Uf-RTP1 PIG7-full-5 EcoRI Pig7-f-his3’ AvrII

pPIC3.5::usRTP1fullh Us-RTP1 35usRTP1fh5' EcoRI 35usrtp1fh3' AvrII

pPIC3.5::N78Q Uf-RTP1 PIG7-full-5 EcoRI Pig7-f-his3’ AvrII

pPIC3.5::N127Q Uf-RTP1 PIG7-full-5 EcoRI Pig7-f-his3’ AvrII

pPIC3.5::N78/127Q Uf-RTP1 PIG7-full-5 EcoRI Pig7-f-his3’ AvrII

pPIC3.5::NRTP1 Uf-RTP1 (N-Terminus) PIG7-full-5 EcoRI 35-7nterm-3'Avr AvrII pPIC3.5::N2RTP1 Uf-RTP1 (N-Terminus) PIG7-full-5 EcoRI 35-7n2term-3'Avr AvrII

pPIC9::PIG7-ss Uf-RTP1 PIG7-ss-5 EcoRI PIG7-full-3 NotI

pPIC9::CRTP1 Uf-RTP1 (C-Terminus) 9-7cterm_5'Eco EcoRI Pig7-f-his3’ AvrII pPIC9::C2RTP1 Uf-RTP1 (C-Terminus) 9-7c2term-5'Eco EcoRI Pig7-f-his3’ AvrII pPIC9::C3RTP1 Uf-RTP1 (C-Terminus) 9-7c3term-5'Eco EcoRI Pig7-f-his3’ AvrII pPIC9::C4RTP1 Uf-RTP1 (C-Terminus) 9-7c4term-5'Eco EcoRI Pig7-f-his3’ AvrII

Tabelle 2-19 Übersicht über die für die Expression in P. pastoris hergestellten Konstrukte REN (Restriktionsendonuklease)

2.9.10.3 Herstellung von Uf-RTP1p-GFP Fusionskonstrukten im heterologen System P. pastoris

Zur Herstellung von Uf-RTP1p-GFP Fusionskonstrukten im Pichia pastoris pPIC3.5 Vektor wurden die von Prof. Dr. M. Hahn (Kaiserslautern) hergestellten Plasmide pUKMH1*, pUKMH2 und pUKMH3 verwendet, welche zur Funktionalitätsanalyse des Uf-RTP1p-NLS nach transienter Expression in Tabakprotoplasten verwendet wurden. Die Sequenzen für GFP, Uf-RTP1-NLS-GFP und Uf-RTP1-GFP wurden durch einen BamHI/NotI Verdau in BamHI/NotI verdaute pPIC3.5 Plasmide umkloniert. Für die Fusionskonstrukte wurde ein synthetisches GFP, sGFP-S65T-H231L, verwendet, welches in seiner „codon usage“ auf pflanzliche Systeme abgestimmt wurde (Haseloff et al., 1997), und dessen Anregungs-maximum sich auf Grund der S65T Mutation auf einen einzigen Peak (Optimum bei 489 nm) verschiebt (Stewart, 2001).

2.9.10.4 DNA Verdau durch Restriktionsenzyme

Zur Klonierung von PCR-Fragmenten, zur Exzision von bestimmten Sequenzabschnitten, zur Linearisierung von Plasmiden sowie zur Kontrolle von Plasmidkonstrukten wurde die DNA mit Restriktionsenzymen verdaut (Sambrook und Russell, 2001). Hierbei wurde nach den jeweiligen Herstellerangaben zu den Restriktionsenzymen vorgegangen (siehe Tabelle 2-20).

Je nach Enzym wurde ein optimaler Verdau nach 2 - 12 h Inkubation bei 37 °C erreicht.

Je nach Restriktionsenzym wurden die Ansätze bei 65 °C oder 80 °C für 20 min inaktiviert und die Ansätze mit Hilfe des E.Z.N.A. Cycle-Pure Kits II (Peqlab, Erlangen, Deutschland) aufgereinigt. Um ein Religieren von Plasmiden zu verhindern, wurde mit Hilfe von Shrimp

Alkalischer Phosphatase (1 u/µl, USB Europe GmbH, Staufen, Deutschland) für 1 h bei 37 °C dephosphoryliert. Die Phosphatase wurde für 15 min bei 65 °C inaktiviert und der Ansatz gereinigt.

Enzym Hersteller Puffer [u/µl Ansatz]

AvrII New England Biolabs GmbH, Frankfurt/M., Deutschland NEB2-Puffer 0,4 BamHI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland Puffer B 0,5 EcoRI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland Puffer H 0,5 EcoRV Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland Puffer B 1,0 HindIII Stratagene, Amsterdam, Niederlande Puffer B 1,0 MunI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland Puffer M 1,0 NcoI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland Puffer H 0,8 NdeI New England Biolabs GmbH, Frankfurt/M., Deutschland Puffer H 1,0 NotI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland Puffer H 1,0 SacI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland Puffer A 1,0

SspI Stratagene, Amsterdam, Niederlande Puffer H 1,0

XhoI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland Puffer H 0,8 Tabelle 2-20 Verwendete Restriktionsenzyme

Bis auf den NEB2-Puffer (New England Biolabs GmbH, Frankfurt/M., Deutschland) stammten alle anderen verwendeten Puffer von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland.

2.9.10.5 Ligation

Die Ligation von Vektoren und Inserts erfolgte durch eine T4-DNA-Ligase (1 Weiss-Unit/µl, Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) nach Herstellerangaben bei 14 °C über Nacht. Die Ligase wurde bei 65 °C für 20 min hitzeinaktiviert. Zur Kontrolle dienten immer ein Ansatz ohne Ligase und ohne Insert sowie ein Ansatz mit Ligase und ohne Insert.

2.9.10.6 Herstellung kompetenter Zellen für Transformationen

Herstellung CaCl2-kompetenter E. coli Zellen für eine Hitzeschock Transformation (Cohen et al., 1972)

LB Medium wurde 1:100 mit einer Übernachtkultur eines E. coli TG1 oder BL21 Stamms angeimpft und bei 37 °C und 270 rpm bis zu einer OD600 von 0,5 kultiviert. Die Zellen wurden bei 4 °C und 5.000 rpm für 10 min im SS34 Rotor abzentrifugiert. Das Pellet wurde in einem dem Ausgangsvolumen entsprechenden Volumen eiskaltem 100 mM CaCl2 re-suspendiert und für 30 min auf Eis gekühlt. Nach anschließender Zentrifugation für 10 min bei 4.000 rpm, 4 °C im SS34 Rotor wurde das Pellet in 1/10 des Ausgangsvolumens aufge-nommen. Nach einer Inkubation von 12 h auf Eis hatten die Zellen die beste Kompetenz.

Herstellung SEM kompetenter Zellen E. coli Zellen für eine Hitzeschock Transformation (Inoue et al., 1990)

SOB Medium (siehe 2.3.1) wurde 1:50 mit einer Übernachtkultur eines E. coli DH5α Stamms angeimpft und bei 18-24 °C und 180 rpm bis zu einer OD600 von 0,6 kultiviert. Die Kultur wurde anschließend 10 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden bei 4 °C und 4.000 rpm für

10 min im GSA Rotor abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 0,32x vol eiskaltem TB (10 mM Pipes-Na2, 15 mM CaCl2, 250 mM KCl, 55 mM MnCl2, pH 6,7) resuspendiert und 10 min auf Eis inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation bei 4 °C und 4.000 rpm für 10 min im GSA Rotor wurde das Pellet in 0,25x vol TB resuspendiert und 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von DMSO auf eine Endkonzentration von 7% wurden die Zellen für 10 min auf Eis inkubiert und anschließend aliquotiert bei -70 °C eingefroren.

Herstellung kompetenter P. pastoris Zellen für die Elektrotransformation (Scorer et al., 1994) YPD Medium (siehe 2.3.2) wurde 1:2.000 mit einer P. pastoris KM71 Übernachtkultur angeimpft und bei 30 °C bis zu einer OD600 von 1,4 kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4 °C und 5.000 rpm für 5 min im GSA Rotor geerntet und die Pellets in 1x vol H2O Millipore^® resuspendiert. Die Zellen wurden erneut bei 4 °C und 5.500 rpm für 5 min im GSA Rotor abzentrifugiert und die Pellets in 0,5x vol H2O Millipore^® resuspendiert.

Nach einer weiteren Zentrifugation bei 4 °C und 5.500 rpm für 5 min im GSA Rotor wurden die Pellets in 0,1x vol 1M Sorbitol aufgenommen, aliquotiert und bei -70 °C eingefroren.

2.9.10.7 Transformation von Bakterien und Hefen Hitzeschock Transformation

Die Hitzeschock Transformation erfolgte nach einem veränderten Protokoll von Cohen et al.

(1972). Zu 100 µl gekühlten CaCl2-kompetenten Zellen wurden 5 µl Ligationsansatz (siehe 2.9.10.5) oder 0,2-0,5 µl intakte Plasmid DNA pipettiert. Die Ansätze wurden für 15 min auf Eis gehalten. Anschließend erfolgte der Hitzeschock für 90 sec bei 42 °C. Nach einer 5 minütigen Inkubation auf Eis wurden pro Ansatz 900 µl LB hinzugegeben. Zur phäno-typischen Expression der Antibiotikaresistenz wurden die transformierten Zellen für 1h bei 37

°C inkubiert. Anschließend wurden 100 - 300 µl der Ansätze auf Selektivplatten ausplattiert und bei 37 °C inkubiert.

Elektroporation von P. pastoris

Die Transformation von P. pastoris erfolgte mittels Elektroporation (Scorer et al., 1994). Zur Transformation wurden 100 ng linearisiertes Plasmid (siehe 2.9.10.4) mit 40 µl kompetenten P. pastoris Zellen in einer vorgekühlten Elektroporationsküvette (Spaltbreite: 2mm, VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland) gemischt. Mit Hilfe eines Biorad Elektro-porationsgerät (Gene Pulser, Bio-Rad, München, Deutschland) erfolgte bei 1,5 kV, 200Ω, 25 µF die Elektroporation. Zu den Zellen wurde 1 ml eiskaltes 1 M Sorbitol gegeben und gemischt. Anschließend wurden 100 - 500 µl der Ansätze auf RD-Selektivplatten ausplattiert und bei 30 °C inkubiert.

2.9.11 Transfer von Nukleinsäuren auf Trägermembranen