Die Immunofluoreszenzmikroskopie in pflanzlichen Schnitten wurde von Prof. Dr. K. W.
Mendgen und Dipl. Ing. H. Vahlenkamp durchgeführt.
2.11.1.1 Chemische Fixierung von pflanzlichem Material
Zur chemischen Fixierung und Entwässerung von U. fabae infiziertem V. faba Blattmaterial, bzw. von mit U. striatus infiziertem M. sativa Blattmaterial, wurden Scheibchen mit 1,6 mm Durchmesser ausgestanzt und in ein Gemisch aus Essigsäure und Ethanol (1:3 (v/v)) überführt (Clarke, 1851). Die Fixierung erfolgte 4 h bei RT. Es wurde zweimal für 15 min, und an-schließend zweimal für 1 h mit 100% Ethanol gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde in Ethanol bei 4 °C über Nacht inkubiert. Anschließend wurden die Proben in Acryl-harz eingebettet.
2.11.1.2 Formaldehydfixierung von P. pastoris Zellen
P. pastoris Zellen mit welchen eine Immunlokalisation durchgeführt werden sollte, wurden einer Formaldehydfixierung (Lucocq et al., 2001) unterzogen.
Hierfür wurde mit 37% Formaldehyd in den P. pastoris Kulturen (siehe 2.10.3) eine End-konzentration von 2% eingestellt. Die Kulturen wurden abzentrifugiert und mit MM-Medium (2.3.2) mehrfach gewaschen. Anschließend wurden die Zellen über eine aufsteigende Ethanolreihe entwässert, wofür die Proben jeweils 15 min in 10%, 30%, 50%, 70% und 95%
und 100% Ethanol inkubiert wurden. Zur vollständigen Entwässerung wurde einmal 15 min und anschließend über Nacht in wasserfreiem 100%igem Ethanol inkubiert. Das wasserfreie 100%ige Ethanol wurde noch einmal ausgetauscht bevor die Zellen in Acrylharz eingebettet werden konnten.
2.11.1.3 Harzeinbettung, Polymerisation und Mikrotomie
Das mit Essigsäure-Ethanol fixierte, infizierte Pflanzenmaterial (2.11.1.1) sowie die Form-aldehyd fixierten P. pastoris Zellen (2.11.1.2) wurden in einer Acrylharzmischung (80% (v/v) Butylmethacrylat; 20% (v/v) Methylmethacrylat, 40 mM Benzoylperoxid, 10 mM DTT) ein-gebettet (Erben, 1997). Hierfür wurde das entwässerte Material in einer Konzentrationsreihe mit 10% und 25% für 1 h, 50% für 2 h, 75% für 3 h und 100% für 30 min sowie über Nacht
inkubiert. Die 100% Schritte wurden zweimal wiederholt, bevor die Polymerisation durch Zugabe von 0,15 mM N,N- Dimethylaniline gestartet wurde (Lal und Green, 1955). Die Polymerisation erfolgte zunächst 24 h auf Eis, bevor bei RT für 48 h nachpolymerisiert wurde.
Serielle Schnitte wurden mit einem Reichert OmU3-Ultramikrotom (Reichert, Wien, Öster-reich) und Glasmessern hergestellt, wobei eine Schnittdicke von 0,5 µm gewählt wurde. Die Schnitte wurden auf mit BioBondTM (BBInternational, Cardiff, UK) beschichtete Objekt-träger überführt.
2.11.1.4 Präadsorption der verwendeten Seren
Die Präadsorption erfolgte, um unspezifische Bindungen der Antikörper an Pflanzen und Pilzmaterial zu reduzieren (Kemen, 2006). Für die Präadsorption wurde ein Blatthomogenat aus infizierten und nicht infizierten Pflanzen hergestellt, für welches bei Lokalisationen von Uf-RTP1p auf V. faba ein V. faba-Homogenat und für Lokalisationen von Us-RTP1p auf M. sativa ein M. sativa-Homogenat verwendet wurde.
Für das Homogenat, aus infiziertem Blattmaterial wurde dieses in Stickstoff gemörsert und 0,6:1 (w/v) in TE+SDS Puffer (10 mM Tris/HCl, Na2-EDTA, 0,5% (w/v) SDS, pH 8,0 nach (Lorkovic et al., 2004)) suspendiert. Das Homogenat wurde viermal bei 20 kHz und 100 Watt mit 40 Impulsen pro Minute für 2 min mit einer Microtip (0,5 cm) sonifiziert und anschlie-ßend das Restprotein mit 200 µg/ml Proteinase K für 18 h bei 30 °C inkubiert. Durch einen Zentrifugationsschritt bei 16.000 rpm im SS34 Rotor, wurden die nicht löslichen Kompo-nenten pelletiert und das Pellet in TBS (150 mM NaCl; 10 mM Tris/HCl pH 7,5) resuspendiert. Um die Proteinase K vollständig zu deaktivieren wurde das Homogenat auto-klaviert.
Nicht infiziertes Blattmaterial wurde unter Stickstoff gemörsert und durch Ultraschall wie das infizierte Material in TBS homogenisiert. Das Homogenat wurde 15 min bei 16.000 rpm, bei RT, in einem SS34-Rotor abzentrifugiert und das Pellet zweimal in TBS gewaschen. Nach den Waschschritten wurde das Pellet in der Hälfte des Ausgangsvolumens durch eine weitere Ultraschallbehandlung resuspendiert und vor der Verwendung autoklaviert. Für die Prä-adsorption wurde der Puffer aus infizierten und nicht infizierten Blättern 1:1 gemischt.
Die Präadsorption erfolgte, indem Inkubationspuffer (2.11.1.5), Blockpuffer (2.11.1.5), 1:1 Homogenat aus infizierter und nicht infizierter Pflanze sowie das jeweilige gereinigte Serum (40/10/49/1 (v/v/v/v)) durch Invertieren 10 min gemischt wurden. Durch 10 min Zentri-fugation bei 10.000 g in der Tischzentrifuge wurden unspezifisch gebundene Antikörper
pelletiert. Der Überstand konnte nun als präadsobierter, primärer Antikörper für den immuncytologischen Nachweis auf Schnitten eingesetzt werden (siehe 2.11.1.5).
2.11.1.5 Immunocytochemie
Die Schnitte auf den beschichteten Objektträgern (2.11.1.3) wurden zum Ätzen für 2,5 min in Aceton inkubiert. Anschließend wurden sie mehrere Minuten mit H2O gewaschen. Für alle weiteren Inkubationsschritte wurden jeweils 100 µL der entsprechenden Lösungen und Puffer auf die Objektträger pipettiert, welche während den Inkubationszeiten in feuchten Kammern auf einem Polymax 1040-Schüttler (Heidolph Instruments, Schwabach, Deutschland) bei 40 rpm inkubiert wurden. Um Hintergrundmarkierungen so gering wie möglich zu halten wurden die Schnitte für 10 min mit Blockpuffer (TBS, 5% BSA, 5% Ziegenserum (Serotec GmbH, Düsseldorf, Deutschland)) inkubiert (Hahn und Mendgen, 1997). Nach einem Äqui-librierungsschritt für 3x 10 min mit Inkubationspuffer (TBS pH 7,5, 1% BSA-C (Aurion, Wageningen, Niederlande)) folgte die Behandlung mit dem präadsorbierten, primären Anti-körper (siehe 2.11.1.4). Die Inkubation der Schnitte in präadsorbierten Antiseren erfolgte für 2 h, gefolgt von 6 Waschschritten zu je 5 min in Inkubationspuffer. Als Sekundärantikörper wurde für S805p, S844p, S849p, S894p und S907p ein Cy3-markierter Ziege-anti-Kaninchen Antikörper, für S746p ein Ziege-anti-Meerschweinchen Antikörper verwendet. Die Markie-rung der Primärantikörper durch die 1:400 in Inkubationspuffer verdünnten, fluoreszenz-markierten Sekundärantikörper erfolgte für 60 min. Zum Abschluss wurden 3 Waschschritte zu je 10 min in TBS durchgeführt. An die Inkubation mit dem Sekundärantikörper schlossen sich verschiedene Gegenfärbungen mit Fluoreszenzfarbstoffen zur besseren Identifikation von Organellen oder Kompartimenten an. Die Kernfärbung wurde mit einer 0,001%igen bisBenzimide Lösung in TBS durchgeführt (Schmued et al., 1982). Die Inkubationszeit betrug 10 min bei RT. Als Gegenfärbung zur Darstellung von Zellwänden des Pilzes sowie der Pflanze wurden die Schnitte 30 sec in einer 1 µM DIOC6(3)-Lösung (Kodak, Rochester, USA) in TBS inkubiert (Kemen, 2006). Zum Abschluss erfolgten 3 Waschschritte zu je 10 min in TBS sowie ein Einbetten der Schnitte in DABCO pH 8,5 (81,9 mM 1,4-Diaza-bicyclo[2.2.2]octan, 50% Glycerin in H2O).
Die markierten Schnitte konnten nun mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops (Axioplan2 imaging, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen, Deutschland) ausgewertet werden. Für die Cy3-Markierung wurde ein Cy3 HQ-Filtersatz (ex.: 545/30; split.: 565 LP; em.: 610/75) (AF Analysentechnik, Tübingen) verwendet. Für die Kernfärbung wurde ein DAPI-Filtersatz (ex.: 360/50; split.: 400 LP; em.: 460/50) verwendet. Die DIOC6(3)-Gegenfärbung konnte mit
Hilfe eines FITC-Filtersatzes (ex.: 480/40; split.: 505 LP; em.: 510 LP) (AF Analysentechnik, Tübingen) ausgewertet werden.
Die Bilder wurden mit einer AxioCam high-resolution Digitalkamera (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen, Deutschland) aufgenommen, welche wie das Mikroskop mit dem Programm AXIOVISION 4.0 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen, Deutsch-land) bedient wurde. Die Bildbearbeitung erfolgte mit AdobePhotoshop® 6.0 (Adobe Systems, Mountain View, CA, USA).
Für jedes Serum wurden jeweils zwei Kontrollen der Spezifität der Antikörper durchgeführt:
Zum einen wurden die Schnitte unmittelbar nach dem Ätzen mit Proteinase K behandelt, zur Abklärung ob das in den Schnitten erhaltene Signal von Proteinen herrührt; zum anderen erfolgte ein chemischer Abbau von Zuckern, um unspezifische Bindungen an diese auszu-schließen.
Für die Proteinase K-Behandlung (verändert nach Urbanczyk-Wochniak et al. (2002)) wurden 50 µg/ml Proteinase K in TE+SDS-Puffer (siehe 2.11.1.4) gelöst und auf die geätzten Schnitte überführt. Nach einer Inkubation bei 37 °C für 30 min erfolgte die Deaktivierung der Proteinase K in kochendem Wasser für 5 min. Um Restaktivitäten der Proteinase K auszu-schließen erfolgten 3 Waschschritte zu je 5 min in 0,1 M Glycin in TBS, pH7,5. Alle weiteren Schritte der Immunlokalisation wurden wie oben beschrieben ausgeführt.
Die Deglykosylierung erfolgte jeweils mit einer frisch angesetzten gesättigten Lösung Natriumperiodat (verändert nach Newman und Hobot (2001)). Hierzu wurde die Lösung auf die Schnitte überführt und für 20 min bei RT inkubiert. Das Entfernen der Lösung erfolgte durch 3maliges Waschen in TBS.
2.11.2 Fluoreszenzmikroskopie RTP1p–GFP–Fusionsprotein expri-mierender P. pastoris Zellen
Die Fluoreszenzmikroskopie in Hefen wurde mit Unterstützung durch E. Kemen durchge-führt.
Zur Untersuchung der RTP1p-GFP-Fusionsproteine exprimierenden P. pastoris Zellen wurden 10 µl einer 72 h Kultur (siehe 2.10.3) auf Objektträger aufgetropft und mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops (Axioplan2 imaging, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen, Deutschland) ausgewertet. Sowohl für die Betrachtung als auch für die Digitalfotografie der GFP-Markierung wurde ein E-GFP-Filtersatz (ex.: 470/40; split.: 495 LP; em.: 525/50) (AF Analysentechnik, Tübingen, Deutschland) verwendet.