Genstruktur der RTP1 Familie

Auf genomischer Ebene spiegelt sich die „Zwei Domänen Struktur“ in Homologieunter-schieden zwischen den 5’ und 3’ Bereichen wieder. Im 5’ Bereich, der die Exons 1 und 2 sowie das erste Intron umfasst, ist die Ähnlichkeit zwischen den drei genomischen RTP1 Se-quenzen deutlich geringer als im 3’ Bereich. Exon 2 hat die geringste Ähnlichkeit zwischen den drei RTP1 Sequenzen, da es innerhalb dieses Exons einen Bereich von 37 Nukleotiden gibt (Anhang A: ch Us-RTP1: 220-257), welcher nur in den Sequenzen von Us-RTP1 und Ua-RTP1, jedoch nicht bei Uf-RTP1 vorkommt, bzw. zwischen den drei Sequenzen stark variiert. Die starke Variation auf genomischer Ebene spiegelt sich auch in der Aminosäure-sequenz wieder, so dass die Uf-RTP1p Sequenz im N-Terminus zwischen Aminosäure 46 - 53, gegenüber der von Us-RTP1p, zwei Deletionen von fünf und drei Aminosäuren aufweist. Der Verlust dieses Sequenzbereichs bei Uf-RTP1 könnte eine Anpassung von U. fabae an seine Wirtspflanze Vicia faba darstellen, um der Erkennung durch ein Resistenz-protein zu entgehen. Für pilzliche AvirulenzResistenz-proteine wurde festgestellt, dass die Erkennung durch ein entsprechendes Resistenzprotein in der Wirtspflanze evolutionär zu einer Variation der Aminosäuresequenz führt (Catanzariti et al., 2006). So wird zum Beispiel das von C. fulvum produzierte Avr4E Protein nach Veränderung von zwei Aminosäuren nicht mehr durch den Resistenzrezeptor Hcr9-4E in der Wirtspflanze erkannt (Westerink et al., 2004).

Hinweise auf eine Selektion durch Aminosäurevariation, bzw. -deletion wurde auch bei den Avirulenzproteinen AvrL567 von M. lini (Dodds et al., 2004) und den H. parasitica ATR13 und ATR1^NdWsB Proteinen (Allen et al., 2004); (Rehmany et al., 2005) festgestellt.

Bei der Exon- Intronverteilung ist ein deutlicher Unterschied zwischen 5’ und 3’ Bereich zu verzeichnen. Im für den variablen N-Terminus kodierenden 5’ Bereich, liegt nur eines der sechs bei RTP1 vorhandenen Introns. Dieser kodiert für die Hälfte des translatierten Proteins.

Die restlichen fünf Introns unterbrechen die für den konservierten C-Terminus kodierende Se-quenz. Es liegt damit eine Ungleichverteilung der Introns in Richtung des 3’ Endes des RTP1 Gens vor.

Von Mourier und Jaffares (2003) wurde in den eukaryontischen Genomen von 21 komplett sequenzierten Organismen ebenfalls eine Tendenz zur Ungleichverteilung von Introns bei Protein-kodierenden Genen beobachtet. Allerdings zeigen viele dieser Gene eine Tendenz zur Verteilung der Introns im 5’ Bereich (Mourier und Jeffares, 2003). Vermutet wird, dass der Verlust der Introns durch homolge Rekombination zwischen der genomischen Kopie eines Gens und dem revers transkribierten Produkt einer gespleissten mRNA entsteht (Lin und Zhang, 2005). Die Häufung der Introns von RTP1 im 3’ Bereich der Gene kann jedoch nicht über diese Beobachtung erklärt werden. Hier scheint eher eine von Sverdlov et al. (2004) ge-machte Beobachtung zum Tragen zu kommen, dass die Insertion von Introns gehäuft am 3’

Bereich zu finden ist.

Bei den bisher auf ihre Intronstruktur untersuchten Genen von U. fabae ließ sich für das Invertasegen INV1 eine Häufung von Introns im 5’ Bereich beobachten (Voegele et al., 2006), wobei bei BGL1 (Haerter und Voegele, 2004) und auch bei PMA1 (Struck et al., 1998) jeweils in der Mitte des Gens intronfreie Bereiche auftreten. Es lässt sich damit die Hypothese aufstellen, dass bei U. fabae eine Tendenz zur Aufgabe von Introns ohne Präferenz für 3’ oder 5’ Region besteht, um bei schnellen Antworten auf veränderte Bedingungen bei der Wirt-Parasit Interaktion weniger Zeit für den Splice-Prozess aufwenden zu müssen.

Die Ungleichverteilung der Introns kann in allen drei RTP1 Vertretern gefunden werden, da die Position der Introns innerhalb des Gens sowie deren Länge extrem konserviert ist. Damit scheinen die Positionen der Introns bei RTP1 seit der evolutionären Trennung der drei Uromyces Vertreter nicht variiert worden zu sein. Eine Konservierung der Introns stellten Ayliffe et al. (2001) ebenfalls für pilzliche β-Tubulin Gene fest, wobei die Position der Introns unter den euaskomyceten Pilzen stark konserviert ist, deren Anzahl, Größe und Se-quenz jedoch, anders als bei RTP1, variieren. Die sechs Introns von RTP1 haben eine durch-schnittliche Intronlänge von 63 - 69 Nukleotiden und sind damit gegenüber den Introns euka-ryontischer Modellorganismen relativ kurz (Deutsch und Long, 1999). Da Uromyces Spezies eine geschätzte Genomgröße von ca. 400 Mb (Leonard und Szabo, 2005) aufweisen und damit gegenüber Vertebraten und Invertebraten ein relativ kleines Genom haben, scheint die von Deutsch und Long (1999) postulierte Korrelation von Genomgröße und Intronlänge bei den Uromyces Spezies erfüllt zu werden. Mit 9,1 Introns pro kbp kodierender Region hat das RTP1 Gen gegenüber dem durchschnittlichen eukaryontischen Gen mit 3,7 Introns pro kbp

relativ viele Introns (Deutsch und Long, 1999). Basidiomyceten weisen jedoch allgemein eine höhere Anzahl an Introns pro Gen auf (Nielsen et al., 2004). Es werden im Durchschnitt sieben Introns pro Gen gefunden, womit RTP1 mit sechs Introns den Durchschnitt reprä-sentiert.

An allen Intron/Exon Grenzen der RTP1 Vertreter wird die “GT AG Regel“ für Splice-Stellen erfüllt (Saxonov et al., 2000), was bedeutet dass eine Expression von RTP1p in mit der genomischen Sequenz von RTP1 transformierten eukaryontischen Systemen möglich wäre.

Dies hätte den Vorteil, dass stabilisierende Effekte der Introns auf die cytoplasmatische mRNA, wie sie für viele eukaryontische Gene beobachtet wurde (Xu und Gong, 2003), ausge-nutzt werden könnten.

Der durchschnittliche GC- Gehalt der Exons und Introns unterscheidet sich nur unwesentlich zwischen den einzelnen RTP1 Vertretern und liegt sowohl für Introns als auch Exons, mit Ausnahme von Exon 5, bei rund 44%. Beim GC- Gehalt sind keine Unterschiede zwischen 5’-und 3’ Bereich der RTP1 Sequenzen zu finden. Der gefundene GC-Gehalt entspricht be-kannten Genen bei U. fabae, ist jedoch relativ gering für phytopathogene Pilze, welche wie Phanerochaete chrysosporium mit 57% (Martinez et al., 2004) und Colletotrichum graminicola (Randhir und Hanau, 1997) mit 52% weit über den für RTP1 gefundenen Werten liegen. Innerhalb des RTP1 Gens sticht Exon 5 bei allen Vertretern mit einem sehr geringen GC-Gehalt von durchschnittlich 33% heraus. Auf Exon 5 liegt die Sequenz, die bei Us-RTP1 und Ua-RTP1 für die zweite (Us-RTP1: N166), bzw. dritte (Ua-RTP1: N142) Glyko-sylierungsstelle kodiert (siehe Abbildung 3-19). Der durchschnittliche GC-Gehalt der Fabaceen M. truncatula und Glycine max liegt zwischen 43 und 40% (Tian et al., 2004).

Somit gleicht der GC-Gehalt der Wirtspflanzen den Werten, die für Uromyces gefunden wurden. Damit kann keine Aussage über die Herkunft von Exon 5 getroffen werden. Auch über die Herkunft des gesamten RTP1 auf Basis des GC-Gehalts lässt sich keine Aussage machen.

Projiziert man die auf Proteinebene identifizierten Sequenzmotive auf die genomische Struktur, so stellt man fest, dass das einzige Intron im 5’ Bereich (Intron 1), die Sequenz, welche für die Signalsequenz kodiert, unterteilt. Die Sequenzmotive für die Prozessierungs-stellen, das potentielle NLS, die erste Glykosylierungsstelle (N78) von Uf-RTP1p sowie das erste Phosphoserin/Phosphothreonin-Prolin Motiv und auch die auf der Homologie beruhende Grenze zwischen den beiden Domänen, liegen im Bereich des zweiten Exons und werden durch keine Introns unterbrochen. Im 3’ Bereich fällt auf, dass die komplette Aggregations-domäne, bis auf ein Nukleotid, durch Exon 4 kodiert wird. Es wird diskutiert, dass extensive

Rekombination von Exons durch Exonshuffling eine wichtige Rolle bei der genetischen Diversität spielen könnte (de Roos, 2005). Die Beobachtung, dass das Aggregationsmotiv durch ein komplettes Exon kodiert wird, könnte ein Hinweis darauf sein, dass RTP1p die Fähigkeit zur Aggregation durch „exon shuffling“ erworben hat, indem das komplette Motiv als Modul in die RTP1p Sequenz integriert wurde. Diese These schwächt jedoch der Befund, dass auch für die Aggregationsdomäne bisher keinerlei Sequenzhomologe in den Daten-banken gefunden werden konnten. Da bisher jedoch für Rostpilze wenig Sequenzinformation vorliegt, bleibt abzuwarten, ob neben Melampsora medusae f. sp. deltoidae in einem der Rost-genome das Aggregationsmotiv von RTP1p als Modul aufgefunden wird.

Durch das Intron 4 wird das offene Leseraster zwischen dem zweiten und dritten Nukleotid eines Codons unterbrochen. Damit ist Intron 4 das einzige Phase 2 Intron, in den RTP1 Se-quenzen. Bei der Mehrheit der Introns handelt es sich um Phase 0 und Phase 1 Introns. Dies entspricht der bisher bei allen Organismen beobachteten Verteilung an Intron/Exongrenzen (Long und Deutsch, 1999). Bei Exon 4, welches für die Aggregationsdomäne kodiert, handelt es sich damit um ein asymmetrisches Exon der Kategorie 1-2 (begrenzt von einem Phase1 Intron und einem Phase 2 Intron, siehe Tabelle 3-1). Die Hypothese, dass die Aggregations-domäne durch „Exon Shuffling“ als Modul in die RTP1p Sequenz aufgenommen wurde, wird mit asymmetrischen Exongrenzen zwar unwahrscheinlicher (Kolkman und Stemmer, 2001), sollte auf Grund der Konservierung zwischen den Rosten jedoch nicht ganz außer acht gelassen werden.