Aus den Ergebnissen dieser Arbeit ergeben sich einige Fragestellungen, die im Weiteren angesprochen werden sollen:
Die molekularbiologischen und biochemischen Analysen von RTP1p zeigten, dass es sich um eine neue Proteinfamilie bei Rosten handelt. Vor dem Hintergrund der kürzlichen Identi-fizierung eines weiteren RTP1p Homologs beim Pappelrost Melampsora medusae f. sp.
deltoidae wird deutlich, dass RTP1p nicht nur auf Roste auf Leguminosen beschränkt zu sein scheint, sondern auch von Rosten auf weiteren Dicotyledonae exprimiert wird. Zur weiteren Klärung der Bedeutung von RTP1p, wäre es interessant die Suche nach RTP1p Homologen bei zusätzlichen Vertretern der Uredinales fortzusetzen, sie aber auch auf Vertreter der bio-trophen Pilze, wie z. B. Mehltaupilze, wie Blumeria graminis auszuweiten. Für die Suche auf Sequenzebene würden sich die in dieser Arbeit identifizierten Homologien im Bereiche des Phosphoserin/Phosphothreonin-Prolin Motivs und der β-Aggregationsdomäne im C-Termi-nus als aussichtsreiche Sequenzbereiche zur Primerentwicklung eignen.
Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, ist die Aggregation von RTP1p konzentrations-abhängig. Daher könnten an einer Steuerung der RTP1p Expression sowohl Faktoren auf
Transkriptions- als auch auf Translationsebene und posttranslationale Modifikationen beteiligt sein. Aufschluß über die Regulation auf Translationsebene könnte eine Analyse der 5’ un-translatierten Region bei den identifizierten RTP1 Vertretern geben. Sollten auch hier uORFs, wie bei Us-RTP1 identifiziert werden, könnte deren regulatorische Funktion mit Hilfe eines Luciferase Assays im heterologen Hefesystem analysiert werden.
Für die korrekte Faltung von RTP1p scheint eine N-terminale Prozessierung an einer von Kex2-ähnlichen Proteinasen erkannten Prozessierungsstelle von Bedeutung sein. Aus der N-terminalen Prozessierung ergeben sich folgende Fragen: Wo verbleibt das Propeptid im nativen System? Bleibt das Propeptid mit dem reifen Protein verbunden? Hat es eine Bedeutung für die Stabilität oder den Transfer? Diese Fragen könnten zum einen mit Hilfe polyklonaler Antikörper, die ausschließlich den Sequenzbereich des Propeptids erkennen, beantwortet werden. Zum anderen würde eine N-terminale Sequenzierung des reifen, nativen Uf-RTP1p, welches über eine in dieser Arbeit etablierte Affinitätschromatographie aufgereinigt werden kann, Aufschluss geben.
Wie in der vorliegenden Arbeit an Hand partieller RTP1p Fragmente sowie Glykosylierungs-mutanten gezeigt, scheint die Struktur von RTP1p eine wichtige Funktion für die Aufgaben und den Transfer von RTP1p zu spielen. Heterolog exprimiertes ΠRTP1p aggregiert und pelletiert und eignet sich daher nicht zur Strukturanalyse, da nur lösliche Proteine für NMR und Röntgenstrukturanalysen verwendet werden können. Ebensowenig eignen sich heterolog exprimierte RTP1p Teilfragmente, da sie zum Teil nicht exprimiert oder sekretiert werden.
Werden die Phenylalanine in der β-Aggregationsdomäne zu Alaninen mutiert, sinkt laut Vor-hersage mittels des TANGO Algorithmus (Fernandez-Escamilla et al., 2004) die gationsfähigkeit, jedoch die β-Faltblattstruktur bleibt erhalten. Demnach sollte in der Aggre-gationsdomäne mutiertes RTP1p löslich und damit zur Strukturanalyse geeignet sein.
Die vorliegende Arbeit gab Hinweise darauf, dass Uf-RTP1p in verschiedenen Komparti-menten mit unterschiedlichen Partnern interagiert. Die Analyse der potentiellen Partner ist im nativen Pathosystem Vicia faba-Uromyces fabae auf Grund der niedrigen Konzentrationen an RTP1p erschwert. Für weitere Interaktionsstudien könnte daher auf Medicago truncatula als Wirtspflanze ausgewichen werden. Bei Medicago truncatula handelt es sich um eine Model-leguminose, für welche die Transformation mittels Agrobacterium rhizogenes nach einer Standardprozedur (Vieweg et al., 2004) etabliert ist. Die Transformation könnte mit Us-RTP1p, mit und ohne Signalsequenz, bzw in letzterem Fall, zusätzlich ohne Propeptid er-folgen. Die anschließende Analyse von RTP1p in Assoziation mit potentiellen Interaktions-partnern könnte, über eine in dieser Arbeit etablierte Immuno-Co-Präzipitation erfolgen. Mit
Hilfe der transgenen Pflanzen könnten auch folgende Eigenschaften untersucht werden:
Welche Auswirkung hat RTP1p auf die transformierte Zelle? Wie verändert sich die Cyclose?
Gibt es eine Interaktion mit Partnern – und wenn ja mit welchen? Mit dem sekretierten RTP1p könnte die Aufnahme von RTP1p in die Zelle weiter untersucht werden. Um das aufge-nommene Protein, von dem in der Zelle exprimierten unterscheiden zu können, sollte die Lokalisation der RTP1p sekretierenden Mutanten mit Kontrollen, die RTP1p exprimieren, an welches ein ER Retentionssignal fusioniert wurde, verglichen werden. Zudem könnte unter-sucht werden wie sich die Empfindlichkeit der transformierten Pflanzen gegenüber dem Wild-typ verändert.
Da mit den Far Western Blot Analysen gezeigt werden konnte, dass es sich bei den beiden Partnern bei 28 kDa und 55 kDa nicht um Leguminosen spezifische Partner handelt, sondern sehr wahrscheinlich um bei Pflanzen verbreitete Proteine, könnte die Interaktion von RTP1p mit seinen Partnern mit Hilfe eines RTP1p transformierten Colletotrichum higginsianum auf Arabidopsis studiert werden. Bei Expression von RTP1p mit Signalsequenz wäre durch dieses pilzliche „delivery system“ eine dem nativen System ähnliche posttranslationale Modifikation möglich, was vor dem Hintergrund der in dieser Arbeit gezeigten Bedeutung von Glyko-sylierung und Prozessierung von Vorteil wäre.
5 Zusammenfassung
Bei Uf-RTP1p (U. fabae-Rost Transferiertes Protein 1) handelte es sich um das erste von Rostpilzen sekretierte Protein, welches immuncytologisch nicht nur in der extrahaustoriellen Matrix nachgewiesen werden konnte, sondern auch im Cytoplasma der infizierten Pflanzen-zelle. Neben Uf-RTP1p wurden in dieser Arbeit RTP1p Vertreter in drei weiteren Legu-minosenrosten identifiziert und molekularbiologisch und biochemisch charakterisiert.
Der molekularbiologische Teil der Arbeit umfasst die Identifizierung der genomischen Sequenzen von RTP1 in den Rostpilzen U. fabae, U. striatus und U. appendiculatus sowie der cDNA Sequenz von U. striatus, wobei ein besonderes Augenmerk auf, für diese neue Genfamilie charakteristische Sequenzeigenschaften gelegt wurde. Northern Blot Analysen zeigten, dass Uf-RTP1 ausschließlich in Haustorien exprimiert wird und damit in der bio-trophen Phase eine Rolle spielt. Bei der Regulation der Expression auf Translationsebene scheinen zwei, bei Us-RTP1 identifizierte uORF beteiligt zu sein. Da die RTP1p Vertreter zu Datenbankeinträgen keinerlei Homologie aufweisen, handelt es sich um eine neue Protein-familie, die eine „Zwei Domänen Struktur“ aufweist. Sie setzen sich aus einem variablen N-Terminus, der eine Anpassung an das jeweilige Wirtssystem darstellen könnte und dem konservierten C-Terminus, der die Funktion von RTP1p bestimmt, zusammen.
Sechs RTP1p spezifische, aufgereinigte Antikörper sowie heterologes RTP1p aus Pichia pastoris dienten zur biochemischen Charakterisierung in silico identifizierter Motive. Diese Motive wurden mit Blick auf die Funktion von RTP1p in der extrahaustoriellen Matrix, beim Transfer sowie im pflanzlichen Cytoplasma analysiert.
Die relativ kleinen Proteine (ca. 25 kDa) werden auf Grund sehr effektiver, N-terminaler Signalsequenzen in die extrahaustorielle Matrix sekretiert. Vor der exocytotischen Frei-setzung erfolgt eine weitere N-terminale Prozessierung. Diese hat für die Faltung von RTP1p eine entscheidende Bedeutung. Glykosylierungsmutanten in P. pastoris legen zudem den Schluss nahe, dass die Glykosylierung an einer, in allen Sequenzen konservierten Glyko-sylierungsstelle, essentiell für die Sekretion und Stabilität des Proteins ist. RTP1p wird in die Wirtszelle als glykosyliertes Protein internalisiert. Mit den aufgereinigten Seren konnte in vier Pathosystemen der Transfer von RTP1p in die pflanzliche Zelle bewiesen werden. Damit stellen die RTP1p Vertreter die erste Gruppe von Rostpilzproteinen dar, für welche ein Transfer auf subzellulärer Ebene in die pflanzliche Zelle bewiesen wurde. Über eine in silico identifizierte Sphingolipid-Binde-Domäne könnte der Transfer ins pflanzliche Cytoplasma er-folgen.
Um Hinweise auf potentielle Interaktionspartner zu erhalten, wurden Far Western Blot Analysen durchgeführt. Die Ergebnisse lassen auf zwei Interaktionspartner, mit einem MW von 25 bzw. 50 kDa, schließen. Partner des gleichen Molekulargewichts, wurden neben weiteren potentiellen Partnern auch in Immuno-Co-Präzipitationsstudien und Affinitäts-chromatographieanalysen wieder gefunden. Damit handelt es sich bei RTP1p um ein multifunktionales Protein, dessen Protein-Proteininteraktion auf einem, für alle RTP1p Sequenzen vorhergesagten Phophoserin/Phosphothreonin-Prolin Motiv beruhen könnte, welches Gruppe IV WW Domänen bei den Interaktionpartnern erkennt.
Eine über Cross-Linking Experimente nachgewiesene Aggregation des nativen Uf-RTP1p und des heterologen RTP1p kann auf eine in allen RTP1p Homologen konservierte β-Aggre-gationsdomäne zurückgeführt werden. Die RTP1p Aggregation ist, wie für amyloide Proteine beschrieben, konzentrations- und pH-abhängig. In Kooperation mit E. Kemen (2006) konnte gezeigt werden, dass sich die amorphen, heterologen RTP1-Aggregate über ein für Prion-proteine beschriebenes Red-Ox-Experiment in filamentöse Strukturen überführen lassen, wie sie für Prion-ähnliche Proteine beschrieben wurden. Mit diesen teilt RTP1p zusätzlich eine hohe Proteinase K Resistenz.
Es wurde mit den in dieser Arbeit charakterisierten RTP1p Vertretern zum ersten mal eine Familie pilzlicher Proteine beschrieben, welche in glykosylierter Form in die Pflanzenzelle aufgenommen werden und durch Multimerisierung über eine Aggregationsdomäne filamentöse Strukturen ausbilden, die eine hohe Proteinase K Resistenz aufweisen. Mit diesen Eigenschaften stellt das in hohen Konzentrationen in der Matrix und im Cytoplasma vorkommende RTP1p, vor allem in älteren infizierten Zellen, einen möglichen Schutz des Pilzes vor antimikrobiellen Komponenten, wie Proteinasen, dar. RTP1p könnte damit als Virulenzfaktor die biotrophe Phase verlängern.
6 Summary
Uf-RTP1p (U. fabae-Rust Transferred Protein 1) is the first secreted protein of rust fungi that is detected by immunocytological studies not only in the extrahaustorial matrix, but also in the cytoplasm of the infected plant cell. Besides Uf-RTP1p three further RTP1p homologs could be identified in other rust-legume-pathosystems. This work includes the characterisation of the four RTP1p homologs on a molecular and a biochemical level.
The molecular part of this work comprises the identification of the genomic sequences of RTP1 in the rust fungi U. fabae, U. striatus and U. appendiculatus. Special attention was given to sequence features characteristic for this new gene family. Northern blot analysis revealed that Uf-RTP1 is exclusively expressed in haustoria and therefore plays a role during the biotrophic growth phase. Two uORFs in the 5’untranslated region of Us-RTP1 may be involved in gene regulation on a translation level.
Since no RTP1p homolog shows any similarity to database entries, they can be classified as a new protein family. These proteins have a two domain structure: the variable N-terminus which could represent an adaptation to the respective host system and a conserved C-terminus, which seems to determine the function of RTP1p.
Six RTP1p specific, purified antibodies as well as heterologously produced RTP1p, were used for the analysis of motifs identified in silico. These motifs were analysed in view of the function of RTP1p within the extrahaustorial matrix and the plant cytoplasm, as well as for the transfer of RTP1p into the host cytoplasm.
The relatively small proteins (appr. 25 kDa) are effecciently secreted into the extrahaustorial matrix. Before the exocytotic release RTP1p is processed at least twice: first the signal sequence is cleaved off and after that the preproprotein is additionally N-terminaly processed.
This has particular importance for the folding of the 18 kDa RTP1p main protein.
Glycosylation mutants in P. pastoris suggest that a glycosylation site conserved in all RTP1p sequences is essential for secretion and stability of the protein. RTP1p is internalised into the host cell in a glycosylated form. Detection of RTP1p in four pathosystems using the purified antibodies suggests a common localization of RTP1p inside the infected plant cells.
Therefore, RTP1p homologs are the first group of fungal proteins for which a transfer into the plant cell has been proven on a subcellular level. A sphingolipid binding domain identified in silico is the most likely candidate responsible for the transfer into the host cytoplasm.
To gain information about potential interaction partners Far-Western-Analyses were performed. Two interaction partners with a molecular weight of 25 kDa and 50 kDa were
identified. Proteins with the same molecular weight were also found in immuno-co-precipitation and in affinity chromatography studies, besides further potential partners.
Therefore, RTP1p represents a multifunctional protein whose protein-protein interaction could be due to a phosphoserin/phosphothreonin-prolin motif, conserved in all RTP1p sequences, which recognizes group IV WW domains of potential partners.
With the aid of cross-linking experiments the aggregation of Uf-RTP1p and heterologous RTP1p could be demonstrated and can be attributed to a β-aggregation domain being conserved in all RTP1p homologs. As described for amyloid proteins, RTP1p aggregation depends on protein concentration and pH. In cooperation with E. Kemen (2006) it could be shown that the amorphous, heterologous RTP1p aggregates can be converted into filamentous structures as published for prion-like proteins. RTP1p also shares high proteinase K resistance with these proteins.
This work describes for the first time a family of fungal proteins internalized by the plant cell in a glycosylated form. This new protein family has the capability to multimerize and to form highly proteinase K resistant, stable filamentous structures. With these characteristics RTP1p, accumulating especially in elderly infected cells, represents a potential protection of the fungus against antimicrobial components, as for example proteinases. Therefore, RTP1p could be classified as a new virulence factor prolonging the biotrophic phase.
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