Aufgrund ihrer Eigenschaften können Proteine in Polyacrylamidgelen nach verschiedenen Kriterien aufgetrennt werden. Ihre Mobilität in diesen Gelen ist nicht nur von ihrer Größe und Form, sondern auch von ihrer Nettoladung abhängig. Will man eine Auftrennung ausschließlich nach Größe und Form erreichen, müssen die Ladungen der Proteine mit einem Detergens (SDS) überdeckt werden. Liegen die Molekulargewichte zweier Proteine sehr nahe beieinander, stößt diese ein-dimensionale SDS-Gelelektrophorese jedoch an ihre Grenzen. Die isoelektrische Fokussierung, die sich Unterschiede in der Nettoladung der Proteine zunutze macht, ermöglicht noch eine weitere Auftrennung der Proteine in einem pH-Gradienten nach ihren isoelektrischen Punkten.
2.5.7.1. Ein-dimensionale SDS-Gelelektrophorese
Die ein-dimensionale (1-D) SDS-Gelelektrophorese nach Laemmli (1970) trennt Proteine und Proteinuntereinheiten im elektrischen Feld nach ihren relativen molekularen Massen auf. Dabei werden die Ladungen der Proteine mithilfe des anionischen Detergens SDS gleichmäßig überdeckt. Der Vernetzungsgrad im Polyacrylamindgel bestimmt die Laufgeschwindigkeit der Proteine. Um eine gute Auflösung bei dem Molekulargewicht von 30 kDa zu erhalten, wurden ausschließlich 15 %ige SDS-Gele verwendet.
Die 1-D Gelelektrophorese wurde mit der Mini-Protean II Kammer der Firma Biorad nach Anleitung des Herstellers (instruction manual, Mini-Protean II Electrophoresis Cell) durchgeführt.
Lösungen
15 % Gel (15 % T, 2,5 % C): Trenngel Sammelgel
Acrylamid (30 %) 4,8 ml 14,62 % 1,15 ml 3,45 % Bisacrylamid (2 %) 1,9 ml 0,38 % 1,65 ml 0,33 % Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) 2,5 ml 375 mM
Tris-HCl (0,5 M, pH 6,8) 2,5 ml 125 mM
H2Omillipore 0,65 ml 4,54 ml
SDS (10 %) 0,1 ml 0,1 % 0,1 ml 0,1 %
TEMED 0,005 ml 0,05 % 0,01 ml 0,1 %
APS (10 %) 0,05 ml 0,05 % 0,05 ml 0,05 %
Die Mengen sind ausreichend für jeweils 2 Gele.
Laemmli-Probenpuffer (mod. nach Laemmli, 1970):
60 mM Tris-HCL pH 6,8
10 % (v/v) Glycerin
5 % (w/v) SDS
0,4 M MESNA
0,04 % (w/v) Bromphenolblau
mit H2Omillipore auf 10 ml auffüllen
Der Probenpuffer wurde bei 30°C gelöst, à 250 µl aliquotiert und bei -20°C aufbewahrt.
Im Laemmli-Probenpuffer wurde die Substanz Mercaptoethansulfonat (MESNA) anstatt von 2-Mercaptoethanol verwendet. Ebenso wie 2-Mercaptoethanol spaltet MESNA Schwefelbrücken und kann in gleicher Konzentration eingesetzt werden. Der große Vorteil des MESNA besteht darin, dass es weitgehend geruchslos ist.
Laufpuffer (Stammlösung): 75 mM Tris-BASE
576 mM Glycin
0,3 % (w/w) SDS
mit H2Omillipore auf 2 l auffüllen
Diese Stammlösung wurde bei RT aufbewahrt und für jeden Elektrophorese-Lauf 1:7 mit H2Omillipore verdünnt.
Gießen der Gele
Die Glasplatten, die Probenkämme und die Abstandshalter („spacer“) der Gelelektrophorese-Apparatur wurden vor dem Ansetzen der Gele gründlich mit Ethanol und H2Omillipore gereinigt.
Anschließend wurden die Glasplatten nach Angaben des Herstellers zusammengesetzt und im Gießständer befestigt. Zuerst wurde das Trenngel, dann das Sammelgel gegossen. Es wurden alle Gellösungen, außer SDS und den Polymerisationskatalysatoren TEMED und APS, gemischt und für 10 min entgast. Dann wurde SDS, TEMED und APS zugegeben, die Lösung vorsichtig vermischt und nach 3 min mit einer Pasteur-Pipette luftblasenfrei zwischen die Glasplatten gefüllt.
Die Trenngellösung wurde bis zu einer Höhe von 5,3 cm eingefüllt, um eine Trenngellänge von 5,0 cm zu erreichen. Diese Länge hat sich als optimal für die gewünschte Auftrennung erwiesen.
Um eine glatte Trennfläche zu erhalten, wurde die Trenngellösung mit unvergälltem Ethanol überschichtet. Nach der Polymerisation des Trenngels (nach ca. 1½ h) wurde der Alkohol abgesaugt, die Geloberfläche mehrmals mit H2Omillipore gespült und die Flüssigkeitsreste wurden mit einem Filterpapier aufgenommen. Nun konnte die ebenfalls entgaste Sammelgellösung zwischen die Glasplatten eingefüllt werden. Der Probenkamm wurde so weit in die Gellösung eingeführt, bis dass ein Sammelgel der Länge 1 cm entstand. Die auspolymerisierten Gele wurden in einer Plastiktüte luftdicht verschlossen und über Nacht bei 4°C aufbewahrt.
Maße der Gele: Sammelgel: 1x8 cm
Trenngel : 5x8 cm
Dicke : 0,75 mm
Probenvorbereitung
Die vorliegenden Homogenate wurden vor Auftragung auf das Gel mit dem Laemmli-Probenpuffer im Verhältnis 1:1 gemischt. Zusätzlich wurden zu den vorbereiteten Proben Proteaseinhibitoren (Pefabloc, 5 mM) und DTT (12 mM) zugegeben. Die Proben wurden anschließend für 10 min gekocht, nochmals mit 5 mM Pefabloc versetzt und 3 min bei 12 000 g abzentrifugiert.
Je Probentasche wurde 10 µl des Probenüberstandes auf das Gel aufgetragen. Die Gele wurden zuvor in die Elektrophoresekammer eingesetzt und mit Laufpuffer bedeckt. Die Vorbereitung der Markerproteine (Biotinylierte SDS-PAGE Standard, Low Range, Biorad; 1:20 in Probenpuffer verdünnt) wurde nach dem gleichen Schema durchgeführt.
Elektrophorese
Die Elektrophorese wurde bei RT wie folgt durchgeführt:
Spannung: 180 V
Stromstärke: zu Beginn: ca. 50 mA gegen Ende: ca. 25 mA
Laufzeit: ca. 1 h 15 min (jedoch variabel, entsprechend der Lauffront)
2.5.7.2. Zwei-dimensionale Gelelektrophorese
Mithilfe der zwei-dimensionalen (2-D) Gelelektrophorese werden Proteine und Proteinuntereinheiten im elektrischen Feld nicht nur nach ihrem Molekulargewicht, sondern auch nach ihrer Nettoladung aufgetrennt. Dabei werden die Proteine zuerst in einem pH-Gradienten isoelektrisch fokussiert und anschließend nach ihrem Molekulargewicht in einer 1-D SDS-Gelelektrophorese getrennt (O´Farell, 1975). Der große Vorteil der isoelektrischen Fokussierung besteht darin, dass im Vergleich zur 1-D SDS-Gelelektrophorese, ein Vielfaches von Proteinen aus einem komplexen Proteingemisch aufgetrennt werden kann. Zusätzlich können jedoch auch geringe Veränderungen eines Proteins identifiziert werden, da die Nettoladung von
Phosphorylierungen, Acetylierungen und Glykosylierungen des Proteins beeinflußt wird (Rabilloud, 2000).
Die isoelektrische Fokussierung wurde mit einer IPGphor Kammer der Firma Amersham Pharmacia Biotech nach Anleitung des Herstellers (Berkelman & Stenstedt, 1998) durchgeführt.
Die Proteine der Extensormuskulatur von Idotea wurden über einen Bereich von pH 3-10 und über einen Bereich von pH 6-11 fokussiert.
Lösungen
Probenpuffer: 8 M Harnstoff
4 % (w/v) CHAPS
40 mM Tris-BASE
Aliquote können bei -20°C aufbewahrt werden.
Rehydrationspuffer: 8 M Harnstoff
2 % (w/v) CHAPS
0,5 % (v/v) IPG Puffer (pH 3-10) bzw. 0,5 % (v/v) IPG Puffer (pH 6-11)
Bei der isoelektrischen Fokussierung im Bereich pH 3-10 wurde der Rehydrationspuffer mit dem IPG Puffer (pH 3-10) eingesetzt, bei einer Fokussierung im Bereich pH 6-11 der Puffer mit dem IPG Puffer (pH 6-11). Aliquote des Rehydrationspuffers können bei -20°C aufbewahrt werden.
SDS-Equilibrierungspuffer: 50 mM Tris-HCl pH 8,8 6 M Harnstoff
30 % (v/v) Glycerin 2 % (w/v) SDS
wenige Körner Bromphenolblau
Aliquote können bei -20°C aufbewahrt werden. Vor Gebrauch wird zum SDS-Equilibrierungspuffer 16 mM DTT hinzugefügt.
Agarose-Stammlösung: 14 % (v/v) SDS Laufpuffer
1 % (w/v) Agarose (NA)
wenige Körner Bromphenolblau
Die Agarose-Stammlösung muß kurz erhitzt werden, bis sich die Agarose vollständig löst.
Aliquote können bei RT aufbewahrt werden.
Gele
Die Gele für die isoelektrische Fokussierung wurden gebrauchsfertig bei der Firma Amersham Pharmacia Biotech gekauft. Dabei handelt es sich um Immobiline DryStrip Gele, die 7 cm lang und 3 mm breit sind und einen linearen pH Gradienten von pH 3-10 bzw. pH 6-11 haben. Sie können bei -20 °C aufbewahrt werden, sollten aber vor Gebrauch bei RT sein.
Probenvorbereitung
Die Muskelhomogenate von Idotea wurden, wie unter 2.5.2. beschrieben, vorbereitet. Je Probe wurden 3 µl Homogenat und 27 µl Probenpuffer eingesetzt. In den 3µl Homogenat waren etwa 10 µg Muskelprotein enthalten. Die Probe (3 µl Homogenat + 27 µl Probenpuffer) wurde gut gevortext und 1 h bei RT aufbewahrt. Anschließend wurde je Probe 95 µl Rehydrationspuffer dazu gegeben, kurz gevortext und das Gemisch luftblasenfrei in einen leeren Gelhalter („Schiffchen“) überführt. Dabei sollte die Flüssigkeit gleichmäßig im Gelhalter verteilt sein.
Die hohe Konzentration an Harnstoff und das Detergenz CHAPS im Probenpuffer und im Rehydrationspuffer ermöglichen die vollständige Entfaltung der Proteine und verhindern eine Aggregation von Proteinkomplexen. Dies ist sehr wichtig, um Proteine in einem pH-Gradienten isoelektrisch fokussieren zu können. Der IPG Puffer, welcher die entsprechenden Ampholyte für den pH Gradienten beinhaltet, erhöht ebenfalls die Löslichkeit der Probe und bewirkt zusätzlich eine gleichmäßig verteilte Leitfähigkeit über den gesamten pH Bereich während der Fokussierung.
Die Probenvorbereitung und die isoelektrische Fokussierung des 2-D SDS-PAGE Standards (Biorad) im Bereich pH 3-10 wurde in gleicher Weise durchgeführt, wie die Fokussierung der Proteine aus dem Crustaceen-Muskelhomogenat. Dabei wurden 3,5 µl des Standards eingesetzt, welche mit 26,5 µl Probenpuffer vermischt wurden. Der 2-D SDS-PAGE Standard (Biorad) beinhaltet die Proteine Conalbumin (76 kDa, pI 6,0, 6,3, 6,6), Albumin (66,2 kDa, pI 5,4, 5,6), Aktin (43 kDa, pI 5,0, 5,1), GAPDH (36 kDa, pI 8,3-8,5), Carbonische Anhydrase (31 kDa, pI
Rehydration und isoelektrische Fokussierung
Vor der eigentlichen isoelektrischen Fokussierung der Proteine müssen die Gele rehydriert werden. Dazu wurde das Gel nun ebenfalls luftblasenfrei in den Gelhalter, der bereits die Probe mit Rehydrationspuffer enthielt, gelegt, so dass das Gel Kontakt mit den zwei Elektroden des Gelhalters hat. Damit das Gel während der Fokussierung nicht austrocknet, wurde es mit 180 µl Dry Strip Cover Fluid (Amersham Pharmacia Biotech) überdeckt. Der Gelhalter wurde mit einem Deckel verschlossen und in die IPGphor Kammer nach Anleitung des Herstellers gestellt.
Programm für die Fokussierung im Bereich pH 3-10:
Rehydration 10-16 h
S1: 500 V 0:30 h 250 Vh Step-n-hold
S2: 1000 V 1:00 h 1000 Vh Step-n-hold S3: 8000 V 2:00 h 16000 Vh Step-n-hold
Programm für die Fokussierung im Bereich pH 6-11:
Rehydration 10-16 h
S1: 500 V 0:30 h 250 Vh Step-n-hold
S2: 1000 V 1:00 h 1000 Vh Step-n-hold S3: 8000 V 3:45 h 27600 Vh Step-n-hold
Nach der Fokussierung wurden die Gele aus dem Gelhalter herausgehoben, in SDS-Equlibrierungspuffer überführt und darin für 15 min auf einem Schüttler inkubiert.
Der Equilibrierungspuffer enthält Substanzen, die zur Vorbereitung der Proteine für die Auftrennung in der zweiten Dimension, notwendig sind. So werden während der Equilibrierung die Ladungen der Proteine mit SDS überlagert, um die Proteine schließlich nach ihrem Molekulargewicht auftrennen zu können. Glycerin verbessert den Transfer der Proteine von der ersten auf die zweite Dimension und DTT erhält den vollständig reduzierten Status der denaturierten Proteine.
SDS-Gelelektrophorese (Zweite Dimension)
Nach der Equilibrierung wurde das Gel über einem Filterpapier abgetropft, auf ein 15 %iges SDS-Gel (ohne Sammelgel) überführt und mit Agarose überdeckt. Die Agarose fixiert das SDS-Gel der
isoelektrischen Fokussierung auf dem SDS-Gel und ermöglicht die Anfertigung von Markertaschen für der Molekulargewichtsmarker der 2. Dimension.
Um die etwa 0,75 mm dicken Gelstreifen der ersten Dimension auf das SDS-Gel aufbringen zu können, wurde das Gel der zweiten Dimension mit 1 mm dicken Abstandshaltern gegossen. Die Laufbedingungen der SDS-Gelelektrophorese der zweiten Dimension stimmen mit denen der 1-D Gelelektrophorese überein (siehe 2.5.7.1.).