Messung von cAMP und cGMP

Die cAMP- und cGMP-Messungen an Muskelhomogenaten der Extensormuskulatur von Idotea wurden mit dem cAMP bzw. cGMP Biotrak cellular communication assay der Firma Amersham Pharmacia Biotech durchgeführt. Dabei handelt es sich um Enzym-gekoppelte Immunoassays, bei denen die Messplatten mit einem anti-Kaninchen IgG Antikörper beschichtete sind. An diesen bindet ein aus dem Kaninchen hergestelltes anti-cAMP bzw. anti-cGMP Antiserum. Bringt man nun das Muskelhomogenat, welches die zu bestimmende Menge an cAMP bzw. cGMP enthält, auf die Platten, werden die zyklischen Nucleotide von dem Antiserum gebunden. Anschließend wird Meerettich-Peroxidase gekoppeltes cAMP bzw. cGMP auf die Platten gebracht. Dieses cAMP bzw. cGMP lagert sich an die noch freien Bindeplätze des Antiserums an. Durch den spezifischen Substrat-Umsatz der gekoppelten Peroxidase kann festgestellt werden, wieviel cAMP bzw. cGMP in der Probe des Muskelhomogenats enthalten war.

Freilegen und Stimulation der Muskelfasern

Die Präparation der zweisegmentalen Extensormuskelfasern Nr. 5 von Idotea erfolgte zu anfangs wie unter 2.5.1.1. beschrieben, jedoch wurden die freigelegten Fasern nicht aus dem Tier herauspräpariert, sondern in situ stimuliert.

Um Präparationsartefakte zu vermeiden, wurden die Präparate vor der Stimulation der Fasern in eine Präparierschale mit kaltem ASW überführt und darin für 10 min inkubiert. Bei einer Stimulationszeit von 15 min fand keine vorherige Inkubation in ASW statt.

Zur eigentlichen Stimulation der Fasern mit den entsprechenden Neuromodulatoren [10^-5, 10^-6, 10^-9 M Proctolin, 10^-5 M Octopamin, 10^-4 M 3-Morpholinosydnonimin (SIN-1)/30 mM KCl] oder

Bisindolylmaleimid I GF 109203X (BIM-1)] wurden die Präparate schließlich für die entsprechende Stimulationszeit (0,5 min, 1 min, 3 min, 5 min, 15 min) in eine Präparierschale mit Stimulationslösung gelegt. In der Stimulationslösung war der Neuromodulator bzw. der Enzym-Hemmstoff in der entsprechenden Konzentration in ASW gelöst. Wurden die gemeinsamen Effekte eines Neuromodulators und eines Enzymhemmstoffs auf die Konzentration der zyklischen Nukleotide der Fasern untersucht, wurden die Substanzen gleichzeitig in die Stimulationslösung appliziert. Bei den Kontroll-Messungen wurde genau gleich verfahren wie bei den Stimulationsmessungen, jedoch wurde ausschließlich ASW ohne einen Stimulator eingesetzt.

Die eingesetzten Neuromodulatoren und der spezifische PKC Hemmstoff Bisindolylmaleimide I (BIM-1) lagen als Aliquote gelöst in H2Omillipore vor. Der Phosphodiesterase-Hemmstoff IBMX wurde als einzige Substanz in 100 % DMSO gelöst, so dass in der Stimulationslösung als Endkonzentration 0,5 mM IBMX und 0,5 % DMSO in ASW vorlagen. Bei den entsprechenden Kontroll-Messungen wurde ebenfalls 0,5 % DMSO in ASW eingesetzt.

Bei den cGMP-Konzentrationsmessungen nach Stimulation der Fasern mit dem NO-Donor SIN-1 wurden die Fasern für 5 min in ASW mit 30 mM KCl und 10^-4 M SIN-1 inkubiert. Dabei wurde zuvor die entsprechende Konzentration an NaCl gegen KCl im ASW ausgetauscht. Bei den Kontroll-Messungen wurden die Fasern ebenfalls für 5 min in verändertem ASW mit 30 mM KCl stimuliert, um sie in einen kontrahierten Zustand zu überführen.

Isolierung der Muskelfasern

Die Stimulation der Muskelfasern wurde durch eisgekühlte Perchlorsäure (0,1 M, in ASW) abgestoppt. Die individuell identifizierten, zweisegmentalen Extensormuskelfasern (Nr. 5) wurden aus den Pereion Segmenten 2 und 3, 3 und 4, 4 und 5, 5 und 6 beidseitig herauspräpariert und sogleich, verpackt in Aluminiumfolie, in flüssigen Stickstoff überführt. Aus einem Tier konnten somit jeweils 8 identifizierte Muskelfasern isoliert werden, die von Tier zu Tier identisch waren.

Probenvorbereitung

Zur Vorbereitung einer Probe wurden 20 Muskelfasern aus dem flüssigen Stickstoff entnommen und in ein Eppendorfgefäß mit 100 µl eisgekühlter Perchlorsäure (0,1 M in H2Omillipore) gebracht.

Die Probe wurde dann, zur Zersetzung der Fasern, für 30 min in ein Ultraschallbad im Kühlraum gestellt. Nach einer Zentrifugation der Probe von 20 min bei 2000 g (4°C) wurde der Überstand (85 µl) abgenommen und das Pellet für die anschließende Proteinbestimmung eingefroren. Zum

Überstand wurde 9 µl KOH (1 M) und 10 µl Natriumphosphatpuffer (1 M, pH 5,8) dazugegeben, um die Probe zu neutralisieren. Die Probe wurde schließlich über Nacht im Kühlraum aufbewahrt.

Am nächsten Morgen wurde die Probe für 20 min bei 2000 g (4°C) abzentrifugiert, der Überstand (96 µl) abgenommen und in einem Vakuumrotationsverdampfer (2 h) bei RT eingedampft. Die eingedampfte Probe konnte so bei -20°C gelagert werden, bis die eigentliche Messung von cAMP bzw. cGMP durchfgeführt wurde.

Durchführung der Messung

Die eingedampften Proben wurden aufgetaut und in jeweils 150 µl des mitgelieferten Natriumacetat-Puffers (0,05 M, pH 5,8, Assay-Puffer) gelöst. Von den 150 µl Probenvolumen wurden 50 µl und 100 µl mit dem Natriumacetat-Puffer auf 1 ml aufgefüllt.

Die Messung von cAMP bzw. cGMP wurde genau nach Anleitung des Herstellers durchgeführt.

Um auch geringe Konzentrationen von cAMP bzw. cGMP in den Proben nachweisen zu können, wurde die Acetylierungs-Methode gewählt. Bei jeder Messung wurde gleichzeitig eine Eichmessung mit bekannten cAMP bzw. cGMP Standards durchgeführt. Jeder einzelne Messwert der Proben und der Standards geht aus mindestens einer Doppelbestimmung hervor.

Stimulation von isolierten Einzelfasern

Um die Extensormuskelfasern von Idotea für eine sehr kurze Zeit in vitro stimulieren zu können, wurden sie vor der Stimulation, wie unter 2.5.1.1. beschrieben, aus dem Tier herauspräpariert.

Acht isolierte Fasern (Nr. 5) pro Tier wurden in ein Eppendorfgefäß mit 45 µl ASW (+ 0,5 mM IBMX) überführt und für 15 min bei 18°C belassen. Danach wurden 5 µl ASW mit gelöstem Neuromodulator (10^-6 M Proctolin, 10^-5 M 5-HT) bzw. Gemischen aus Neuromodulatoren (10^-6 M Proctolin+10^-6 M CCAP) + 0,5 mM IBMX bzw. 5 µl ASW + 0,5 mM IBMX bei den Kontrollen dazugegeben, für 1 sec gemischt und für 20 sec, für 45 sec oder für 90 sec stimuliert.

Nach der entsprechenden Stimulationszeit wurde die Reaktion mit 50 µl 1 M Perchlorsäure (in H2Omillipore, eisgekühlt) abgestoppt. Die Proben wurden für 1 min gemischt, dann für 15 min bei 2000 g abzentrifugiert (4°C) und der Überstand (95 µl) abgenommen. Der Überstand wurde anschließend mit etwa 10 µl K2CO3 (1 M) neutralisiert und bis zur Durchführung der Messung (siehe oben) eingefroren. Das Pellet wurde für die Proteinbestimung bei -20°C aufbewahrt. Mit dieser Methode wurden ausschließlich cAMP-Konzentrationen gemessen.