Das 30 kDa Protein ist mit dem dünnen Filament assoziiert und Troponin I immunreaktiv

Die Regulation der Muskelkontraktion ist bei Arthropoden, wie auch bei Vertebraten, neben der Phosphorylierung einer leichten Kette des Myosins auch von regulatorischen Proteinen des dünnen Filaments abhängig (Winkelman & Bullard, 1980; Horowitz et al., 1996).

Phosphorylierungen der regulatorischen Proteine verändern dabei die Ca²⁺-Sensitivität des Systems, was zu einer verstärkten Kontraktion bzw. Relaxation des Muskels führen kann (Winder

& Walsh, 1990; Horowitz et al., 1996; Perry, 1999). Am dünnen Filament der Idoteen-Muskulatur ist ein Protein mit dem Molekulargewicht von 30 kDa assoziiert. Ein mit dem dünnen Filament assoziiertes Protein, welches regulatorische Funktion hat und im Molekulargewichtsbereich von 30 kDa liegt, ist das Calponin. Es ist ein Calcium-Calmodulin Bindeprotein, das im unphosphorylierten Zustand die Aktivität der Actomyosin-ATPase hemmt.

verstärkten Kontraktion (Winder & Walsh, 1990). Das aus der glatten Muskulatur von Vertebraten isolierte Calponin hat ein Molekulargewicht von 34 kDa. Auch aus Muskeln verschiedener Invertebraten konnten bisher Calponin-ähnliche Proteine identifiziert werden, deren Molekulargewichte jedoch bei 38, 40, 41,8 und 45 kDa liegen (Goetnick & Waterston, 1994;

Irvine et al., 1994; Yang et al., 1999).

Das mit dem dünnen Filament der Extensormuskulatur von Idotea assoziierte 30 kDa Protein ist jedoch nicht Calponin-immunreaktiv (Abb. 3). Das Antiserum färbt ausschließlich ein 41 kDa Protein aus der Extensormuskulatur von Idotea. Dieses 41 kDa Protein ist möglicherweise ein ähnliches Protein, da sein Molekulargewicht mit den Molekulargewichten der Calponin-ähnlichen Proteinen aus anderen Invertebraten übereinstimmt.

Bei Crustaceen befinden sich im Molekulargewichtsbereich von 30 kDa regulatorische Proteine des dünnen Filaments, die als Troponin I klassifiziert wurden, da sie die Aktivität der Actomyosin-ATPase inhibieren (Regenstein & Szent-Györgyi, 1975; Nishita & Ojima, 1990). In der langsamen und schnellen Abdominalmuskulatur des Hummers Homarus americanus konnten verschiedene Isoformen des Troponin I zwischen 27 und 32 kDa gefunden werden (Mykles, 1985a, 1985b;

Nishita & Ojima, 1990; Miegel et al., 1992; Neil et al., 1993). Weiterhin wurden in Muskelfasern der Garnele Alpheus heterochelis und in der abdominalen Muskulatur des Flußkrebses Astacus leptodactylus Troponin I Isoformen mit Moleklargewichten zwischen 23 und 26 kDa beschrieben (Quigley & Mellon, 1984; Shinoda et al., 1988).

Nach Applikation eines Antiserums, welches gegen Troponin I3 aus dem abdominalen Muskel des Hummers hergestellt wurde (Sohn et al., 2000), werden in einem elektrophoretisch aufgetrennten Muskelhomogenat der Extensormuskulatur von Idotea zwei Proteine mit 30 und 31 kDa spezifisch angefärbt (Abb. 4B). Dabei zeigt das Protein bei 30 kDa eine stärkere Immunreaktivität als das Protein bei 31 kDa. Nach elektrophoretischer Auftrennung der Proteine des dünnen Filaments wird ein 30 kDa Protein ebenfalls durch das TnI3 Antiserum spezifisch markiert (Abb.

1B). Das 31 kDa Protein, welches in der dünnen Filament Präparation in geringerer Konzentration vorliegt als im Gesamtmuskelhomogenat, zeigt nach Auftrennung der Proteine des dünnen Filaments keine Immunreaktivität mit dem anti TnI3 Antiserum (Abb. 1B). Dies kann jedoch, neben der schwachen Immunreaktivität des 31 kDa Proteins zum Antiserum, auch an der geringen Konzentration des Proteins in der dünnen Filament Präparation liegen.

Auf 2-D Westernblots bindet das TnI3 Antiserum Proteinpunkte mit den Molekulargewichten von 30 und 31 kDa in einem Bereich von pH 8,45-8,75 und pH 10,7 (Abb. 10). Diese sehr basischen

isoelektrischen Punkte der TnI3 immunreaktiven 30 und 31 kDa Proteine stimmen mit den, aus der Literatur bekannten, isoelektrischen Punkten für Troponin I überein. So wurden die isoelektrischen Punkte von Vertebraten Troponin I Isoformen bei pH 8,34 (Skelettmuskel Maus;

Sanchez et al., 2001) und bei pH 9,5 (Brustmuskel Huhn; Nakamura et al., 1989) identifiziert.

Der isoelektrische Punkt einer Troponin I Isoform aus der abdominalen Muskulatur des Hummers liegt bei pH 9,0 (Miegel et al., 1992).

Da bei den Immunfärbungen der Proteine der 2-D Gele das TnI3 Antiserum stärker konzentriert eingesetzt wurde als bei den Westernblots der 1-D Gele, bindet das TnI3 Antiserum auch unspezifisch Proteine mit den Molekulargewichten von 19 und 55 kDa (Abb. 8B). Das 19 kDa Protein ist dabei im pH Bereich von pH 4,0-4,45 fokussiert. Bei diesem Protein handelt es sich sehr wahrscheinlich um eine Isoform des Troponin C, da die Molekulargewichte der Isoformen des Troponin C in der abdominalen Muskulatur des Hummers zwischen 18,5 und 19 kDa liegen und die isoelektrischen Punkte der Isoformen bei pH 4,0-4,5 identifiziert wurden (Miegel et al., 1992). Der isoelektrische Punkt des 55 kDa Proteins kann nach der 2-D Elektrophorese und dem anschließenden Westernblot mit dem TnI3 Antiserum nicht genau ermittelt werden, da das Bindungssignal am äußeren Rand des basischen pH-Bereichs liegt. Möglicherweise handelt es sich bei dem 55 kDa Protein um ein Troponin T, da die Isoformen des Troponin T in Crustaceen-Muskeln im Molekulargewichtsbereich von 40 bis 55 kDa liegen (Regenstein & Szent-Györgyi, 1975; Mykles & Skinner, 1983; Quigley & Mellon, 1984; Mykles, 1985a; Shinoda et al., 1988;

Miegel et al., 1992).

Das Antiserum gegen TnI3 färbt auch in Muskeln anderer Arthropoden Muskelproteine in einem Molekulargewichtsbereich von 29,5 bis 32,4 kDa spezifisch an (Abb. 5B). Im Gesamtmuskelhomogenat der Extensormuskulatur von Procambarus clarkii markiert das TnI3

Antiserum zwei Proteine mit den Molekulargewichten von 30 und 31,6 kDa. Diese beiden Proteine sind ebenfalls mit dem dünnen Filament assoziiert, da sie nach Präparation des dünnen Filaments mit dem TnI3 Antiserum angefärbt werden können (Brenscheidt, 2001). Nach elektrophoretischer Auftrennung der Troponine aus einem Kaninchen-Skelettmuskel erkennt das Antiserum gegen Hummer TnI3 das Troponin I des Kaninchen-Muskels nicht (Abb. 5B). Da die Sequenzen von Crustaceen Troponin I und Vertebraten-Skelettmuskel Troponin I sehr unterschiedlich sind (Kobayashi et al., 1989), bindet das TnI3 Antiserum sehr wahrscheinlich nur ganz spezifische Sequenzabschnitte aus den Invertebraten Troponin I Isoformen.

Alle bisher aufgeführten Punkte wie das Molekulargewicht, die Assoziation mit dem dünnen Filament, die TnI3 Immunreaktivität und die isoelektrischen Punkte, sprechen dafür, dass in der Extensormuskulatur von Idotea mindestens eine Isoform des Troponin I mit dem Molekulargewicht von 30 kDa existiert.

4.1.3. Das Troponin I immunreaktive 30 kDa Protein ist an der Aminosäure Serin