Charakterisierung des 30 kDa Proteins mit Antiseren gegen Calponin und Troponin I

Um die Identität des dünnen Filament Proteins mit dem Molekulargewicht von 30 kDa zu klären, wurden Antikörper eingesetzt, die spezifisch gegen regulatorische Proteine des dünnen Filaments im Molekulargewichtsbereich von 30 kDa gerichtet sind. In Crustaceen Muskeln liegen in diesem Molekulargewichtsbereich verschiedene Isoformen des regulatorischen Proteins Troponin I (TnI), welches mit dem dünnen Filament assoziiert ist (Mykles, 1985a, 1985b). Aus der glatten Muskulatur von Vertebraten ist ein dünnes Filament Protein mit dem Molekulargewicht von 34 kDa bekannt, welches ebenfalls regulatorische Funktion hat und aufgrund einer Calcium-, Calmodulin-Bindefähigkeit als Calponin bezeichnet wird (Winder & Walsh, 1990).

3.1.2.1. Westernblot mit einem Antiserum gegen Vertebraten Calponin

Nach elektrophoretischer Auftrennung der Muskelproteine von Idotea und Durchführung eines Westernblots mit einem polyklonalen Antiserum, welches gegen das Protein Calponin aus der glatten Muskulatur des Muskelmagens des Huhns (M. Gimona, pers. Mitteilung) hergestellt wurde, zeigte sich bei 41 kDa ein spezifisches Bindungssignal des Antiserums (Abb. 3). An keinem weiteren Protein des Muskelhomogenats von Idotea war eine spezifische Bindung des Calponin Antiserums zu erkennen. Auch das 30 kDa Protein wurde nicht durch das Calponin Antiserum gebunden.

Abb. 3 Elektrophoretische Auftrennung der Extensormuskulatur von Idotea auf einem 15 %igen SDS-Gel und Westernblot mit einem polyklonalen Antiserum gegen Calponin aus dem Muskelmagen des Huhns. Das Antiserum färbte ein Protein mit dem Molekulargewicht von 41 kDa aus der Extensormuskulatur von Idotea. Bei 30 kDa zeigte sich mit diesem Antiserum keine Immunreaktivität. Molekulargewichtsmarker (in kDa) sind durch Pfeilspitzen gekennzeichnet.

3.1.2.2. Westernblots mit einem Antiserum gegen Hummer TnI3 und einem Antikörper gegen phosphoryliertes Serin

Da in verschiedenen Crustaceen Muskeln Isoformen des Troponin I im Molekulargewichtsbereich von 30 kDa identifiziert werden konnten (Mykles, 1985a; Nishita & Ojima, 1990; Miegel et al.,

der abdominalen Muskulatur des Hummers (Sohn et al., 2000) an elektrophoretisch aufgetrennten Muskelproteinen aus der Extensormuskulatur von Idotea durchgeführt (Abb. 4A, B). Das TnI3

Antiserum band in der Extensormuskulatur spezifisch ein 30 kDa Protein und etwas schwächer ein 31 kDa Protein. Auch das 30 kDa Protein der dünnen Filament Präparation (Abb. 4A) wurde durch das TnI3 Antiserum in einem Westernblot an den dünnen Filament Proteinen spezifisch erkannt (Abb. 4B). Das TnI3 Antiserum markierte keine weiteren Muskelproteine. Somit ist das 30 kDa Protein des Extensormuskels, wie auch das 30 kDa Protein des dünnen Filaments der Extensormuskulatur von Idotea TnI3 immunreaktiv.

Abb. 4 (A) Elektrophoretische Auftrennung der Extensormuskulatur von Idotea und der dünnen Filament Präparation des Muskels auf einem 15 %igen SDS-Gel. Das 30 kDa Protein ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. (B) Westernblot mit einem polyklonalen Antiserum gegen Troponin I3 aus der Abdominalmuskulatur des Hummers. Das TnI3 Antiserum erkannte spezifisch in der Extensormuskulatur von Idotea ein Protein bei 30 kDa und ein Protein bei 31 kDa. In der dünnen Filament Präparation des Muskels wurde das 30 kDa Protein spezifisch durch das Antiserum markiert. (C) Westernblot mit einem monoklonalen Antikörper gegen phosphoryliertes Serin. Das 30 kDa Protein des dünnen Filaments der Extensormuskulatur von Idotea wurde durch den anti P-Serin Antikörper erkannt. Das 30 kDa Protein des dünnen Filaments war somit an der Aminosäure Serin phosphoryliert. Molekulargewichtsmarker (in kDa) sind durch Pfeilspitzen gekennzeichnet.

Um zu zeigen, dass das 30 kDa Protein des dünnen Filaments an der Aminosäure Serin phosphorylierbar ist und somit ein Zielprotein für die durch Proctolin induzierte Phosphorylierung darstellen könnte, wurde ein weiterer Westernblot mit einem monoklonalen Antikörper gegen phosphoryliertes Serin durchgeführt. Dieser Antikörper wurde zuvor dazu verwendet, die verstärkte Phosphorylierung des 30 kDa Muskelproteins aus der Extensormuskulatur von Idotea zu untersuchen (Brüstle, 1998). In der dünnen Filament Präparation erkannte der Antikörper gegen phosphoryliertes Serin neben weiteren Proteinen das dünne Filament Protein mit dem Molekulargewicht von 30 kDa (Abb. 4C). Folglich war das 30 kDa Protein des dünnen Filaments an der Aminosäure Serin phosphoryliert.

3.1.2.3. Westernblot mit dem Antiserum gegen Hummer TnI3 an Muskeln verschiedener Arten Nach elektrophoretischer Auftrennung von Proteinen aus Muskeln verschiedener Arthropoden in einem 15 %igen SDS-Gel und anschließender Silberfärbung wurden zahlreiche Proteinbanden sichtbar (Abb. 5A). Auch die Auftrennung des Troponin-Komplexes aus einem Kaninchen-Muskel (Sigma) ergab mehrere Banden im Bereich von 19 bis 26 kDa (Abb. 5A, rechts).

Wurde mit dem Antiserum gegen Hummer TnI3 ein Westernblot an den aufgetrennten Proteinen dieser Muskeln durchgeführt, so erhielt man bei den Arthropoden-Muskeln spezifische Bindungssignale des Antiserums im Molekulargewichtsbereich von 29,5 bis 32,4 kDa (Abb. 5B).

Das Antiserum erkannte im Beinmuskel der Krabbe Eriphia spinifrons zwei Isoformen bei 30 und 31,2 kDa, im tiefen Extensormuskel des Flußkrebses Orconectes limosus zwei Isoformen bei 29,5 und 32,4 kDa, im superfiziellen Extensormuskel des Flußkrebses Procambarus clarkii zwei Isoformen bei 30 und 31,6 kDa, in der Extensormuskulatur der Meeresassel Idotea emarginata zwei Isoformen bei 30 und 31 kDa und im Laufmuskel M93 der Heuschrecke Locusta migratoria eine Isoform bei 30 kDa. Nach elektrophoretischer Auftrennung von Kaninchen Troponin und Westernblot mit dem Antiserum gegen Hummer TnI3 ergab sich jedoch kein Bindungssignal (Abb.

5B, rechts außen). Das Antiserum gegen Hummer TnI3 erkannte somit das TnI des Kaninchen Muskels nicht.

Abb. 5 (A) 15 %iges SDS-Gel mit aufgetrennten Protein-Extrakten aus dem Beinmuskel der Krabbe Eriphia spinifrons, dem tiefen Extensormuskel des Flußkrebses Orconectes limosus, dem superfiziellen Extensormuskel des Flußkrebses Procambarus clarkii, der Extensormuskulatur von Idotea, dem Laufmuskel M93 der Heuschrecke Locusta migratoria und dem Troponin-Komplex aus einem Kaninchen Muskel (Sigma). (B) Westernblot mit einem Antiserum gegen Hummer TnI3 an den in (A) gezeigten Muskel-Extrakten. Das Antiserum markierte spezifisch im Beinmuskel von Eriphia sp. Proteine bei 30 und 31,2 kDa, im Extensormuskel von Orconectes li. Proteine bei 29,5 und 32,4 kDa, im Extensormuskel von Procambarus cl. Proteine bei 30 und 31,6 kDa, im Extensormuskel von Idotea em. Proteine bei 30 und 31 kDa und im Laufmuskel von Locusta mi. ein Protein bei 30 kDa. Im aufgetrennten Troponin-Komplex des Kaninchens gab es kein Bindungssignal des Hummer TnI3 Antiserums. Molekulargewichtsmarker (in kDa) sind durch Pfeilspitzen gekennzeichnet.