des Neuropeptids Proctolin auf die Muskelkontraktion und intramuskuläre
Signalketten bei der Meeresassel Idotea emarginata (Crustacea, Isopoda)
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften
an der Universität Konstanz, Fachbereich Biologie
vorgelegt von
Berit Brüstle
Konstanz, im Juni 2002
Tag der mündlichen Prüfung: 26.08.2002 1. Gutachter: Prof. Dr. W. Rathmayer 2. Gutachter: Prof. Dr. D. Malchow
Unser Kopf ist rund,
damit das Denken die Richtung wechseln kann.
(Francis Picabia)
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG 1
1.1. Regulation der Muskelkontraktion 2
1.1.1. Muskelaufbau 2
1.1.2. Mechanismen der Muskelkontraktion 3
1.2. Das Neuropeptid Proctolin: Ein Modulator der Muskelkontraktion 6 1.3. Einfluss von Proctolin auf intrazelluläre Signalwege 8
1.4. Zielsetzung der Arbeit 10
2. MATERIAL UND METHODEN 11
2.1. Versuchstiere 11
2.2. Physiologische Lösungen 12
2.3. Chemikalien und Antikörper 12
2.4. Geräte, Materialien und Computerprogramme 13
2.5. Biochemische Charakterisierung des 30 kDa Proteins 14
2.5.1. Muskelpräparation 14
2.5.1.1. Idotea emarginata 14 2.5.1.2. Procambarus clarkii 15 2.5.1.3. Orconectes limosus, Eriphia spinifrons, Locusta migratoria 15
2.5.2. Herstellung der Muskelhomogenate 15
2.5.3. Myosinaufreinigung 16
2.5.4. Extraktion der leichten Ketten des Myosins 16
2.5.5. Präparation des Actomyosins 17
2.5.6. Isolierung dünner Filamente 18
2.5.7. Protein-Auftrennung durch SDS-Gelelektrophorese 18
2.5.7.1. Ein-dimensionale SDS-Gelelektrophorese 19
2.5.7.2. Zwei-dimensionale Gelelektrophorese 21
2.5.8. Silbernitratfärbung von Proteinen im Gel (nach Heukeshoven & Dernick, 1988) 25
2.5.9. Übertragung von Proteinen auf eine Nitrocellulose-Membran (Westernblot) 26
2.5.10. Immunfärbung der Proteine 28
2.5.11. Immunpräzipitation 30
2.5.12. Molekulargewichtsbestimmung 33
2.6. Untersuchung der Proctolin-induzierten Signalketten 34
2.6.1. Kontraktionsmessungen 34
2.6.2. Messung von cAMP und cGMP 35
2.6.3. Messung der Inositolphosphate 38
2.6.4. Messung der ADPribosyl-Zyklase Aktivität 42
2.7. Proteinbestimmung 43
2.8. Statistik 44
3. ERGEBNISSE 45
3.1. Charakterisierung des 30 kDa Proteins 45
3.1.1. Zuordnung des 30 kDa Proteins zu Muskelfilamenten 45
3.1.1.1. Die leichten Ketten des Myosins 45
3.1.1.2. Die Proteine des dünnen Filaments 47
3.1.2. Charakterisierung des 30 kDa Proteins mit Antiseren gegen Calponin und Troponin I 48 3.1.2.1. Westernblot mit einem Antiserum gegen Vertebraten Calponin 49 3.1.2.2. Westernblots mit einem Antiserum gegen Hummer TnI3 und einem Antikörper gegen
phosphoryliertes Serin 49
3.1.2.3. Westernblot mit dem Antiserum gegen Hummer TnI3 an Muskeln verschiedener Arten 51
3.1.3. Immunpräzipitation mit dem Antiserum gegen Hummer TnI3 52
3.1.3.1. Immunpräzipitation des 30 kDa Proteins aus der Extensormuskulatur von Idotea 53 3.1.3.2. Immunpräzipitation des 30 kDa Proteins aus der Extensormuskulatur von Procambarus 54 3.1.4. Auftrennung der Muskelproteine aus der Extensormuskulatur von Idotea in der 2-D
Gelelektrophorese 56
3.1.4.1. 2-D Gelelektrophorese im Bereich pH 3-10 57
3.1.4.2. 2-D Gelelektrophorese im Bereich pH 6-11 59
3.2. Proctolin-induzierte Signalketten in der Muskelzelle 62
3.2.1. Messung der cAMP-Konzentration 62
3.2.1.2. cAMP-Konzentrationen nach unterschiedlichen Stimulationszeiten 64 3.2.1.3. Auswirkungen des Phosphodiesterase-Hemmstoffs IBMX auf die cAMP-Konzentrationen 66 3.2.1.4. Messung der cAMP-Konzentrationen in Einzelfaserpräparten nach sehr kurzen
Stimulationszeiten 67
3.2.2. Auslösung von Kontrakturen durch Koffein 69
3.2.3. Messung der Inositolphophate 72
3.2.4. Messung der ADPribosyl-Zyklase Aktivität 76
3.2.5. Messung der cGMP-Konzentration 79
4. DISKUSSION 84
4.1. Charakterisierung des 30 kDa Proteins 84
4.1.1. Das 30 kDa Protein ist keine leichte Kette des Myosins 84 4.1.2. Das 30 kDa Protein ist mit dem dünnen Filament assoziiert und Troponin I immunreaktiv 85 4.1.3. Das Troponin I immunreaktive 30 kDa Protein ist an der Aminosäure Serin phosphoryliert 88
4.1.4. Bedeutung der Troponin I Phosphorylierung 89
4.2. Intrazelluläre Signalwege der proctolinergen Modulation 91
4.2.1. Der Adenylatzyklase-cAMP-PKA-Weg 92
4.2.2. Der Phospholipase C-InsP3-Ca2+-Weg 95
4.2.3. Der Phospholipase C-DAG-PKC-Weg 99
4.2.4. Modell zur Wirkung von Proctolin auf die Extensormuskulatur von Idotea 102
5. ZUSAMMENFASSUNG 106
6. LITERATUR 108
7. ABKÜRZUNGEN 120
1. Einleitung
Bewegungen von Menschen und Tieren werden durch Arbeit von Muskelzellen ermöglicht. Die Aktivität der Muskelzellen wird ihrerseits durch Signale induziert und gesteuert, die sie von Nervenzellen oder von anderen Muskelzellen empfangen. Diese Signale werden im motorischen System von Vertebraten und Invertebraten über elektrische und chemische Synapsen vermittelt.
Der weitaus größte Anteil der Synapsen wirkt durch chemische Übertragung, bei welcher Neurotransmitter durch Aktivierung eines spezifischen Rezeptors physiologische Effekte in der postsynaptischen Zelle auslösen.
Bei der chemischen Übertragung von Signalen gibt es zwei unterschiedliche Kategorien: Die schnelle und die langsame synaptische Transmission (Greengard, 2001).
Die schnelle synaptische Transmission erfolgt in weniger als einer Millisekunde und wird durch klassische exzitatorische und inhibitorische Neurotransmitter bewirkt. Dabei öffnen die klassischen Transmitter Liganden-gesteuerte Ionenkanäle der postsynaptischen Membran und beeinflussen somit direkt deren Ionenpermeabiltät.
Die zweite Art der Kommunikation zwischen Nervenzelle und Nachbarzelle, die langsame synaptische Transmission, erfolgt über einen Zeitraum von hunderten von Millisekunden bis zu mehreren Minuten und ist bei weitem komplexer als die schnelle synaptische Transmission. Bei dieser langsamen Übertragung spielt eine große Anzahl von biogenen Aminen, Peptiden und Aminosäuren, die parallel zu den klassischen Transmittern aus der Nervenzelle ausgeschüttet werden, eine wichtige Rolle. Sie modulieren die Wirkung der klassischen Transmitter, in dem sie die Effizienz der Übertragung beeinflussen. Derartige Substanzen werden daher auch als Neuromodulatoren bezeichnet (Florey, 1967). Präsynaptisch verändern Neuromodulatoren z.B.
die Menge der freigesetzten klassischen Transmitter und postsynaptisch die Ruheleitfähigkeiten von Ionenkanälen, die Öffnungswahrscheinlichkeit von spannungsabhängigen Kanälen und die Phosphorylierungszustände intrazellulärer Proteine und Ionenkanalproteine (Rathmayer et al., 2002b). Dabei wirken sie über komplizierte biochemische Regulationsmechanismen, in deren Verlauf sekundäre Botenstoffe, Proteinkinasen und Proteinphosphatasen beteiligt sind (Cohen, 1982; Greengard, 2001). Durch die vielfältigen Modulationsmechanismen werden die Leistungsfähigkeit des Nervensystems und die Effizienz der über klassische Transmitter
gesteigert. Komplexe und fein regulierte Verhaltensmuster und Bewegungsabläufe werden somit ermöglicht.
Bei Invertebraten findet man neben den biogenen Aminen wie 5-Hydroxytryptamin (5-HT, Serotonin), Dopamin und Octopamin eine Vielzahl von Peptiden wie das Crustacean Cardioactive Peptide (CCAP), die Allatostatine, FMRFamide und Proctolin, die alle an der Modulierung motorischer Steuervorgänge beteiligt sind. Das Hauptinteresse der vorliegenden Arbeit liegt auf den intrazellulären postsynaptischen Wirkungsmechanismen des Neuropeptids Proctolin.
1.1. Regulation der Muskelkontraktion
Um zu verstehen, wie das Neuropetid Proctolin die Kontraktionen von Muskeln moduliert, ist es von Bedeutung, die Mechanismen zu kennen, die zu einer Muskelkontraktion führen. In Vertebraten und Invertebraten wird die Muskelkontraktion neben der Regulation über energieliefernde Stoffwechselwege und über unterschiedliche intrazelluläre Ca2+-Konzentrationen auch durch Veränderungen der an der Kontraktion beteiligten Proteine reguliert. Dabei spielen Proteine des Myosinfilaments, aber auch regulatorische Proteine des dünnen Filaments des Muskels eine wichtige Rolle (für eine Übersicht siehe z.B. Eckert et al., 2000).
1.1.1. Muskelaufbau
Bei Vertebraten unterscheidet man zwischen der quergestreiften Skelett- und Herzmuskulatur und der glatten Muskulatur der Gefäße und inneren Organe, wobei die Skelettmuskeln der Arthropoden im Aufbau den Skelettmuskeln der Vertebraten gleichen.
Der Skelett- und auch der Herzmuskel der Vertebraten ist aus einer Vielzahl von Muskelfasern aufgebaut, die wiederum aus einigen hundert Myofibrillen bestehen. Jede Myofibrille ist durch die Z-Scheibe in Abschnitte, die Sarkomere, unterteilt. An der Z-Scheibe befestigt sind die dünnen Filamente, die hauptsächlich aus dem Protein Aktin und aus regulatorischen Proteinen, wie dem Tropomyosin und dem Troponinmolekül, bestehen. Das Troponinmolekül ist aus den drei Untereinheiten Troponin C (Ca2+-bindende Untereinheit), Troponin I (inhibierende Untereinheit) und Troponin T (Tropomyosin-bindende Untereinheit) aufgebaut. Zwischen den dünnen Filamenten liegen innerhalb des Sarkomers die Myosinfilamente, die fast ausschließlich aus dem Protein Myosin bestehen und über das Protein Titin (bei Arthropoden Projektin genannt) an der Z-Scheibe befestigt sind. Ein Myosinmolekül wird aus zwei schweren Polypeptidketten und vier
leichten Polypeptidketten gebildet. Die schweren Ketten des Myosins tragen die Myosinköpfchen, die die Querverbindungen zu den dünnen Filamenten herstellen. Im Köpfchen enthalten ist auch eine Myosin-ATPase, die die Umwandlung von ATP zu ADP und Pi katalysiert und somit die Energie für die Kontraktion liefert. Jedem Kopfteil angelagert sind jeweils zwei leichte Ketten des Myosins, eine essentielle und eine regulatorische Kette.
In der glatten Muskulatur der Vertebraten fehlt der geordnete Aufbau der Filamente, wie er in der Skelettmuskulatur vorliegt. Jedoch sind in der glatten Muskulatur auch Myosinfilamente, Aktinfilamente und regulatorische Proteine vorhanden, wobei der glatten Muskulatur das Troponin fehlt. Wichtige Regulatorproteine des glatten Muskels sind das Caldesmon und das Calponin (für eine Übersicht siehe z.B. Klinke & Silbernagel, 2001).
1.1.2. Mechanismen der Muskelkontraktion
Zur Kontraktion der Muskeln ist neben Aktin, Myosin und den regulatorischen Proteinen im Allgemeinen die Anwesenheit von Ca2+, Mg2+, ATP und Myosin-ATPase notwendig. Die Mechanismen, die zu einer Kontraktion führen, sind in der Skelettmuskulatur, der Herzmuskulatur und der glatten Muskulatur der Vertebraten jedoch recht unterschiedlich.
In den meisten Skelettmuskeln wird eine Kontraktion fast ausschließlich durch ein über das motorische Axon eintreffendes Aktionspotenzial ausgelöst. Dieses Aktionspotenzial löst ein elektrisches Signal an der Skelettmuskelfaser aus, das seinerseits durch die Depolarisation einen spannungsgeschalteten Dihydropyridin-Rezeptor in der Membran des tubulären Systems aktiviert.
Das Signal wird dann an den Ca2+ Kanal des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) weitergeleitet, was zu einer direkten Freisetzung von Ca2+ aus diesem intrazellulären Speicher führt. Dadurch steigt die freie, intrazelluläre Ca2+-Konzentration in der Muskelzelle stark an. Das freie Ca2+ wird nun an das mit dem dünnen Filament assozierten Protein Troponin C gebunden, was zu einer allosterischen Konformationsänderung des Tropomyosin-Troponin Komplexes führt. Troponin I bewirkt dann eine Freilegung der Myosin-Bindestelle des Aktins, die im erschlafften Zustand des Muskels durch das Tropomyosin blockiert ist. Die Myosinköpfchen können jedoch nur an das Aktin binden, wenn das am Myosinköpfchen gebundene ATP in ADP und Pi gespalten wird.
Durch die Spaltung richtet sich das Myosinköpfchen auf und legt sich zunächst mit schwacher Bindung an das Aktinmolekül. Das anorganische Phosphat löst sich dann rasch aus diesem Komplex und das Aktin geht eine festere Bindung mit dem Myosin ein, was zu einem Kippen des
und es entsteht eine Verkürzung des Muskels. Wird ATP erneut am Myosinköpfchen gebunden, lösen sich die Filamente von einander (Zusammenfassung siehe Klinke & Silbernagel, 2001).
Der Mechanismus, der zur Kontraktion des Vertebraten Herzmuskels führt, ähnelt dem Mechanismus, der bei der Skelettmuskulatur vorliegt. Die Freisetzung von Ca2+ aus dem SR wird hier zusätzlich durch einen Ca2+-Einstrom über die sarkolemmale Membran nach Aktivierung von spannungsgesteuerten Ca2+ Kanälen ausgelöst. Weiterhin kann die Ca2+-Permeabilität der sarkolemmalen Membran und der Membran des SR durch Neurotransmitter und Hormone regulatorisch gesteuert werden. Werden β1-Adrenorezeptoren der Herzmuskelzellen durch z.B.
Adrenalin aktiviert, wird die Aktivität einer membrangebundenen, G-Protein-gekoppelten Adenylatzyklase erhöht. Die Adenylatzyklase katalysiert die Umsetzung von ATP zu cAMP, was zu einem Anstieg von intrazellulärem cAMP führt. cAMP aktiviert wiederum eine Proteinkinase A (PKA), durch die Proteine eines sarkolemmalen Ca2+ Kanals phosphoryliert werden. Durch die Phosphorylierungen wird die Öffnungswahrscheinlichkeit des Kanals erhöht, und es strömt mehr Ca2+ in die Muskelzelle ein. Die erhöhte intrazelluläre Ca2+-Konzentration verstärkt folglich die Kontraktion des Muskels. Die aktivierte PKA phosphoryliert jedoch nicht nur Proteine der sarkolemmalen Membran sondern auch regulatorische Proteine wie das Troponin I oder auch Proteine des SR, was über eine Veränderung der Ca2+-Sensitivität des Systems zu einer Beschleunigung der Erschlaffung des Herzmuskels führt (Perry, 1999). Werden an den Herzmuskelzellen α1-Adrenorezeptoren aktiviert, so wird die Aktivität einer G-Protein- gekoppelten Phospholipase C (PLC) gesteigert. PLC katalysiert die Umsetzung von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) zu Diacylglycerin (DAG) und Inositol-1,4,5- trisphosphat (InsP3). InsP3 bindet intrazellulär an einen Rezeptor des SR und induziert dadurch die Freisetzung von Ca2+ aus dem SR. Die durch zwei Mechanismen erhöhte intrazelluläre Ca2+- Konzentration potenziert die Kraftentwicklung des Muskels.
In der glatten Muskulatur wird die Kontraktion durch einen anderen Mechanismus ausgelöst und reguliert. Hier kommt es nach Eintreffen eines Aktionspotenzials oder nach Bindung eines Transmitters oder Hormons zu einem Ca2+-Einstrom über die sarkolemmale Membran oder zu einer ligandengesteurten Ca2+-Freisetzung aus dem SR durch intrazelluläre Botenstoffe. Die intrazelluläre Ca2+-Konzentration wird anschließend durch eine Ca2+-induzierte Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern stark erhöht. Die Erhöhung der intrazellulären Ca2+- Konzentration führt zu einer Aktivierung der Ca2+/Calmodulin-abhängigen Myosin-Leichteketten- Kinase. Dieses Enzym phosphoryliert die regulatorischen leichten Ketten des Myosins. Das
Myosin ändert daraufhin seine Konformation, wodurch es dem Aktin ermöglicht, die ATPase des Myosins zu aktivieren. Die leichten Ketten des Myosins beeinflussen somit durch den Grad ihrer Phosphorylierung die ATPase Aktivität der schweren Ketten. Die Aktivierung der ATPase führt schließlich zur Kontraktion des Muskels. Nimmt die freie intrazelluläre Ca2+-Konzentration ab und wird das Myosin durch die Myosin-Leichteketten-Phosphatase dephosphoryliert, wird die Kontraktion beendet und der Muskel erschlafft (vgl. Voet & Voet, 1994). Auch im glatten Muskel wird die Kontraktion bzw. die Erschlaffung durch zusätzliche Mechanismen über extrazelluläre Liganden und intrazelluläre Botenstoffe wie cAMP, InsP3 und DAG reguliert. Dabei spielen durch Proteinkinase induzierte Phosphorylierungen von Enzymen, wie der Myosin- Leichteketten-Kinase oder der Myosin-Leichteketten-Phosphatase, aber auch Phosphorylierungen von regulatorischen Proteinen, wie dem Caldesmon oder dem Calponin, eine wichtige Rolle. Die Phosphorylierungen führen zu Veränderungen in den Enzymaktivitäten oder zu Veränderungen der Ca2+-Sensitivität des Systems (Horowitz et al., 1996). Durch diese Feinregulation wird die Kontraktion des Muskels verlängert oder aber der Muskel relaxiert schneller.
Neben dem InsP3 sind noch zwei weitere sekundäre Botenstoffe bekannt, durch die Ca2+ aus intrazellulären Speichern freigesetzt wird: Die zyklische Adenosindiphosphoribose (cADPribose) und das Nikotinsäureamid-adenin-dinukleotidphosphat, NAADP (Guse, 1999; Lee, 2000). Auch das Enzym, welches den Aufbau von cADPribose und NAADP katalysiert, die ADPribosyl- Zyklase, kann z.B. in der Herzmuskulatur durch extrazelluläre Liganden aktiviert werden (Higashida et al., 2000). Die Ca2+-Mobilisierung aus den intrazellulären Speichern läuft bei den drei Substanzen sehr wahrscheinlich über ganz unterschiedliche Wege (da Silva & Guse, 2000).
Dabei bindet InsP3 am SR an einen spezifischen InsP3-Rezeptor und cADPribose an einen Ryanodin-Rezeptor. Für NAADP ist der Rezeptor noch nicht bekannt. Die Aktivität der Rezeptoren kann wiederum über Phosphorylierungen durch verschiedene Proteinkinasen wie PKA, Proteinkinase G (PKG), Proteinkinase C (PKC) und eine Calmodulin-abhängige Kinase reguliert werden (da Silva & Guse, 2000).
Bei den Muskeln von Arthropoden, die im Aufbau den Vertebraten-Skelettmuskeln gleichen, scheint eine Kombination der verschiedenen Regulationsmechanismen für die Kontraktion der Muskeln vorzuliegen. So ist z.B. in Insekten-Muskeln die über Ca2+ laufende Regulation der
Tropomyosin (Bullard et al., 1973) sowie andererseits von der Phosphorylierung der leichten Kette des Myosins abhängig (Winkelman & Bullard, 1980). In der Flugmuskulatur von Drosophila wird durch die Phosphorylierung einer leichten Kette des Myosins die Actomyosin- ATPase Aktivität erhöht (Takahashi et al., 1990). Bei den Pfeilschwanzkrebsen der Gattung Limulus wird die Actomyosin-ATPase ebenfalls durch die Phosphorylierung der leichten Kette des Myosins aktiviert, wobei die Phosphorylierung durch eine Ca2+- und Calmodulin-abhängige Myosin-Leichteketten-Kinase stattfindet (Sellers, 1981). Neben der Phosphorylierung einer leichten Kette des Myosins spielt bei der Muskelkraftentstehung bei Arthropoden die Tropomyosin/Troponin-vermittelte Regulation eine wichtige Rolle (Lehman, 1982). Zusätzlich werden Muskelkontraktionen bei Arthropoden auch über extrazelluläre Transmitter und Neuromodulatoren, die an spezifische Rezeptoren der sarkolemmalen Membran binden, reguliert.
Dabei werden intrazelluläre Signalkaskaden aktiviert (Gäde et al., 1997; Wicher et al., 2001), wobei über sekundäre Botenstoffe wie cAMP oder InsP3 die Kraftentwicklung im Muskel beeinflußt werden kann.
1.2. Das Neuropeptid Proctolin: Ein Modulator der Muskelkontraktion
Das erste identifizierte und später sequenzierte Neuropeptid der Invertebraten war das Pentapeptid Proctolin (Aminosäuresequenz H-Arg-Tyr-Leu-Pro-Thr-OH). Es wurde zunächst im Enddarm der Schabe Periplaneta americana entdeckt (Brown & Starrat, 1975) und bald auch im Nervensystem weiterer Arthropoden nachgewiesen. In Insekten und Crustaceen kommt Proctolin als Cotransmitter in identifizierten Neuronen vor und wird im zentralen Nervensystem, an neuromuskulären Synapsen und aus Neurohaemalorganen freigesetzt (O´Shea, 1985; Siwicki et al., 1987; Orchard et al., 1989). An einigen viszeralen Muskeln sowie an manchen Skelettmuskeln von Insekten und Crustaceen löst Proctolin schon ohne Depolarisation der Membran graduierte Kontrakturen aus (Schwarz et al., 1980; Orchard et al., 1989; Baines & Downer, 1992).
Weiterhin potenziert es Kontraktionen von Skelettmuskeln und viszeralen Muskeln, die myogen oder als Folge der Aktivität von Motoneuronen ausgelöst wurden (Evans & Myers, 1986; Lange et al., 1986). Auch Muskelkontraktionen, die durch Depolarisation mittels hoher extrazellulärer K+-Konzentrationen oder durch Strominjektion induziert wurden, können durch Proctolin verstärkt werden (Orchard et al., 1989; Baines & Downer, 1992; Belanger & Orchard, 1993;
Erxleben et al., 1995; Facciponte et al., 1996; Jorge-Rivera et al., 1998).
Die Mechanismen, die zu den Proctolin-induzierten Muskelkraftverstärkungen führen, beinhalten prä- und postsynaptische Effekte. Durch die Verstärkung eines Ca2+-Einstroms über präsynaptische, P/Q-ähnliche Ca2+ Kanäle (Rathmayer et al., 2002a) erhöht Proctolin die Freisetzung klassischer Transmitter an neuromuskulären Endigungen (Belanger & Orchard, 1993;
Pasztor & Golas, 1993, Rathmayer et al., 2002a). Postsynaptisch schließt Proctolin spannungsunabhängige K+ Kanäle (Erxleben et al., 1995; Baines et al., 1996; Walther et al., 1998), was zu einer Erhöhung des Eingangswiderstandes und damit der Zeitkonstante der Muskelmembran führt und somit die Summation exzitatorischer synaptischer Potenziale verstärkt.
Weiterhin verstärkt Proctolin den Einstrom von Ca2+ in die Muskelfasern (Baines & Downer, 1992; Wilcox & Lange, 1995), indem es die Öffnungswahrscheinlichkeit von spannungsabhängigen Ca2+ Kanälen des L-Typs der Muskelmembran erhöht (Bishop et al., 1991a;
Erxleben & deSantis, 1998).
Auch in der Meeresassel Idotea ist das Neuropeptid Proctolin in einem einzelnen Paar Motoneurone enthalten, welche die dorsalen Extensormuskelfasern aller Segmente des Tieres versorgen (Brüstle et al., 2001). Somit kann Proctolin über zwei Motoneurone auf die dorsale Extensormuskulatur abgegeben werden. Proctolin verstärkt die Kontraktionskraft dieser Muskulatur ebenfalls über prä- und postsynaptische Effekte (Rathmayer et al., 2002b).
Präsynaptisch kommt es durch die Wirkung von Proctolin zu einer erhöhten Transmitterfreisetzung. Postsynaptisch bewirkt Proctolin die Erhöhung des Membranwiderstandes der Muskelfasern und den Übergang von graduierten Potenzialen zu Alles-oder-Nichts- Aktionspotenzialen. Diese Effekte sind teils darauf zurückzuführen, dass Proctolin die Zahl der aktiven K+ Kanäle verringert und den Ca2+-Einstrom über spannungsabhängige L-Typ Ca2+ Kanäle erhöht (Erxleben et al., 1995; Erxleben & deSantis, 1998; Rathmayer et al., 2002b). Weiterhin wurde gezeigt, dass durch die Wirkung von Proctolin in der Extensormuskulatur von Idotea ein intrazelluläres Muskelprotein mit dem Molekulargewicht von 30 kDa verstärkt phosphoryliert wird (Brüstle, 1998; Brüstle et al., 2001). Auch in der Eileitermuskulatur von Locusta migratoria wird durch Proctolin die Phosphorylierung eines 20 kDa Proteins ausgelöst (Lange & Nykamp, 1996). Die Autoren beschreiben dieses Protein als eine leichte Kette des Myosins, da die regulatorischen Ketten des Myosins von Vertebraten bei 20 kDa liegen. Regulatorische leichte Ketten des Myosins von Insekten wurden jedoch bei einem Molekulargewicht von 30 kDa identifiziert (Winkelman & Bullard, 1980; Müller, 1992). Auch in Muskeln des
Bei Crustaceen konnten in diesem Molekulargewichtsbereich keine leichten Ketten des Myosins identifiziert werden. Im Molekulargewichtsbereich von 30 kDa finden sich bei Crustaceen- Muskeln Isoformen des regulatorischen Proteins Troponin I (Mykles, 1985a, 1985b; Nishita &
Ojima, 1990; Miegel et al., 1992; Neil et al., 1993)
Die Phosphorylierung eines sarkoplasmatischen Proteins durch die Wirkung von Proctolin deutet darauf hin, dass Proctolin postsynaptisch nicht nur über die Modulation von membranständigen Prozessen, d.h. über Ionenkanäle, in der Idoteen Extensormuskulatur wirkt, sondern weitere intrazelluläre Signalwege an der Proctolin-induzierten Potenzierung der Muskelkontraktion beteiligt sind.
1.3. Einfluss von Proctolin auf intrazelluläre Signalwege
Wie die Wirkungen des Neuropeptids Proctolin intrazellulär vermittelt werden, ist noch weitgehend unklar. Es wird angenommen, dass Proctolin an einen oder mehrere Rezeptortypen bindet und somit intrazelluläre Signalkaskaden aktiviert (vgl. Lange & Nykamp, 1996). Bisher konnte jedoch noch kein spezifischer Proctolin-Rezeptor isoliert oder sequenziert werden. Es wurden allerdings Proctolin-Bindeproteine aus Membranen des Enddarms der Schabe isoliert (Mazzocco & Puiroux, 2000; Mazzocco et al., 2001). Diese Proctolin-Bindeproteine konnten nach Sequenzvergleichen als Dipeptidyl-Aminopeptidasen identifiziert werden, die das Neuropeptid Proctolin abbauen. Pharmakologische Untersuchungen mit Proctolin und Proctolin- Analoga weisen darauf hin, dass das Neuropeptid über mindestens zwei Rezeptor-Typen wirkt (Baines et al., 1996; Mazzocco-Manneval et al., 1998). Als mögliche sekundäre Botenstoffe des Proctolin-Effekts werden cAMP, InsP3 und Ca2+ diskutiert. Welcher Botenstoff in Zusammenhang mit einer Proctolin-Wirkung beobachtet werden kann, variiert von System zu System. So gibt es Hinweise darauf, dass die Effekte des Proctolins auf die sarkolemmalen Ionenkanäle in der Extensormuskulatur von Idotea über einen Adenylatzyklase-cAMP-PKA Signalweg vermittelt werden, da Aktivatoren und Hemmstoffe dieses Weges die Effekte des Proctolins nachahmen bzw. hemmen (Erxleben et al, 1995; Erxleben & deSantis, 1998). Auch in Muskeln anderer Arthropoden konnte dies gezeigt werden (Evans, 1984; Bishop et al., 1991a). In einigen viszeralen Muskeln wie auch in Skelettmuskeln konnte jedoch nach Stimulation mit Proctolin keine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration gemessen werden (Goy et al., 1984;
Evans & Myers, 1986; Groome & Watson III, 1989; Baines & Downer, 1992; Mazzocco-
Manneval et al., 1998). Ein weiterer, möglicher Signalweg, welcher intrazellulär die Proctolin- Wirkung vermittelt, stellt der Phospholipase C-InsP3-Ca2+-Weg dar. In verschiedenen Arthropoden Muskeln wurde gezeigt, dass Proctolin die InsP3-Konzentration erhöht (Lange, 1988; Baines et al., 1990; Hinton & Osborne, 1995; Mazzocco-Manneval et al., 1998). Weiterhin wird angenommen, dass durch die Wirkung von Proctolin, möglicherweise über InsP3, Ca2+ aus intrazellulären Speichern freigesetzt wird. So wurde in der Enddarmmuskulatur der Heuschrecke unter Einfluss von Proctolin eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration gemessen (Dunbar & Huddart, 1982). Auch in Muskelfasern von Muscheln konnte eine Proctolin-induzierte Zunahme der intrazellulären Ca2+-Konzentration beobachtet werden (Bittar & Nwoga, 1989).
Durch Experimente am Hyperneuralmuskel der Schabe Periplaneta americana wurde jedoch gezeigt, dass der durch Proctolin vermittelte Anstieg an intrazellulärem Ca2+ von der Anwesenheit von Ca2+ im extrazellulären Medium abhängig ist (Wegener & Nässel, 2000). Die Autoren gehen deshalb davon aus, dass Proctolin in diesem Muskel nicht über InsP3 intrazelluläres Ca2+ freisetzt, sondern sarkolemmale Ca2+ Kanäle öffnet und so einen Ca2+-induzierten Ca2+-Ausstrom aus intrazellulären Speichern auslöst. Weitere Experimente in diesem Muskel deuten darauf hin, dass die kontraktionsverstärkende Wirkung des Proctolins durch eine PKC vermittelt wird. Da nach einer Aktivierung der PLC neben InsP3 auch DAG entsteht, welches die PKC aktiviert, könnte Proctolin auch über diesen PLC-DAG-PKC-Weg wirken. Auch bei den Proctolin-induzierten Kontraktionen der Eileitermuskulatur von Locusta migratoria (Lange & Nykamp, 1996) und der Vorderdarmmuskulatur von Schistocerca gregaria (Hinton et al., 1998) wurde eine Rolle der PKC beobachtet. In der Mandibularmuskulatur von Locusta migratoria wurde eine PKC- vermittelte Wirkung des Proctolins auf die Kontraktion jedoch ausgeschlossen (Baines &
Downer, 1992).
Alle diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Neuropeptid Proctolin unter verschiedenen Bedingungen einen unterschiedlichen Einfluss auf intrazelluläre Signalwege haben kann und möglicherweise mehrere Signalwege in einem komplexen Zusammenspiel die Wirkungen von Proctolin vermitteln.
Obwohl die Inkubation der Muskeln von Idotea in einer Proctolin-Lösung nicht direkt zu einer Muskelkontraktion jedoch zu einer Stimulation der an den Proctolin-Rezeptor gekoppelten Signaltransduktion führt, wird in dieser Arbeit die Applikation des Peptids als Proctolin- Stimulation bezeichnet.
1.4. Zielsetzung der Arbeit
Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkungsmechanismen des Neuropeptids Proctolin auf die dorsale Extensormuskulatur der Meeresassel Idotea weiter zu charakterisieren, um insbesondere die kontraktionsverstärkende Wirkung des Peptids besser zu verstehen. Dabei sollten zwei Aspekte bearbeitet werden:
Im ersten Teil der Arbeit sollte das noch unbekannte, durch das Neuropeptid Proctolin verstärkt phosphorylierte 30 kDa Protein aus der Extensormuskulatur von Idotea näher charakterisiert werden.
Da bei der Regulation der Kontraktion die Phosphorylierung einer leichten Kette des Myosins eine wichtige Rolle spielt, aber auch regulatorische Proteine des dünnen Filaments am Regulationsmechanismus beteiligt sind (Horowitz et al., 1996), konnte es sich bei dem verstärkt phosphorylierten 30 kDa Muskelprotein um eines dieser Proteine handeln. Deshalb sollte durch unterschiedliche Muskelfilament-Präparationen untersucht werden, ob in der Extensormuskulatur eine leichte Kette des Myosins mit dem Molekulargewicht von 30 kDa existiert, oder aber regulatorische Proteine des dünnen Filaments in diesem Größenbereich liegen. Mithilfe spezifischer Antikörper und Antiseren sollten zusätzliche Informationen über die Identität des zu charakterisierenden 30 kDa Proteins gewonnen werden. Auch die Protein-Auftrennung durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese sollte weitere Informationen über den isoelektrischen Punkt des 30 kDa Proteins liefern und damit zur Charakterisierung des Proteins mithilfe eines Vergleichs mit bekannten Muskelproteinen beitragen.
Im zweiten Teil der Arbeit sollten die durch Proctolin induzierten intrazellulären Signalwege in der Extensormuskulatur von Idotea näher untersucht werden.
Da es Hinweise darauf gab, dass die Effekte von Proctolin auf die sarkolemmalen Ionenkanäle der Idoteen Muskulatur durch cAMP und PKA vermittelt werden (Erxleben et al., 1995; Erxleben &
deSantis, 1998; Rathmayer et al., 2002b), wurde zuerst der Einfluss von Proctolin auf die intrazelluläre cAMP-Konzentration gemessen. Weiterhin sollte untersucht werden, ob Proctolin in der Extensormuskulatur den PLC-InsP3-Ca2+-Weg benutzt. Durch Messungen der intrazellulären Konzentration von cGMP nach Stimulation mit Proctolin sollten mögliche Effekte des Proctolins auf die cGMP-Konzentration ermittelt werden. Dabei spielten auch Untersuchungen zur Wirkungsweise der PKC und der Phosphodiesterasen eine wichtige Rolle.
2. Material und Methoden
2.1. Versuchstiere
Idotea emarginata
Die Versuche wurden hauptsächlich an der Meeresassel Idotea emarginata durchgeführt. Die Tiere stammten ursprünglich von der Biologischen Anstalt Helgoland und wurden in der Tierforschungsanlage der Universität Konstanz bei 18°C Wassertemperatur unter konstanten Bedingungen gehalten und gezüchtet. Für die Experimente wurden ausschließlich adulte, männliche Tiere verwendet.
Procambarus clarkii
Einzelne Experimente wurden auch an dem Flußkrebs Procambarus clarkii durchgeführt. Auch diese Tiere wurden in der Tierforschungsanlage der Universität Konstanz gehalten und gezüchtet.
Für die Experimente wurden adulte Tiere mit einer Körperlänge von ca. 8 bis 10 cm verwendet.
Orconectes limosus
Die adulten Flußkrebse Orconectes limosus wurden in der Tierforschungsanlage der Universität Konstanz unter konstanten Bedingungen gehalten.
Eriphia spinifrons
Die Krabben der Art Eriphia spinifrons stammten ursprünglich aus der Bucht von Neapel (Italien) und wurden in der Tierforschungsanlage der Universität Konstanz bei 16°C Wassertemperatur gehalten.
Locusta migratoria
Für die Experimente mit Locusta migratoria wurden junge, adulte Tiere (bis eine Woche nach der letzten Häutung) verwendet. Die Tiere wurden in der Tierforschungsanlage der Universität Konstanz gehalten und gezüchtet.
2.2. Physiologische Lösungen
ASW (Artificial Sea Water): 490 mM NaCl pH 7,4 8 mM KCl
10 mM CaCl2
12 mM MgCl2
10 mM HEPES
Flußkrebs-Saline (Astacus Blutersatzlösung, nach van Harreveld, 1936):
200 mM NaCl pH 7,4
5,4 mM KCl 2,7 mM MgCl2
10 mM CaCl2
12,9 mM Tris-BASE 5,3 mM Glucose
Locusta Blutersatzlösung (Usherwood & Grundfest, 1965):
140 mM NaCl pH 6,8
10 mM KCl 2 mM CaCl2
4 mM NaH2PO4
6 mM Na2HPO4
90 mM Saccharose
2.3. Chemikalien und Antikörper
Proctolin Sigma
Octopamin Sigma
5-HT (5-Hydroxytryptamin) Sigma
CCAP (Crustacean Cardioactive Peptide) Bachem
Koffein Sigma
ADPribosyl-Zyklase (von Aplysia) Sigma NGD+(Nicotinamid-guanin-dinucleotid) Sigma 8-Br-cAMP (8-Bromoadenosin 3´,5´-zyklisches Monophosphat) Sigma
GTP (Guanosintriphosphat) Sigma
ATP (Adenosintriphosphat) Sigma
cAMP Biotrak cellular communication assay Amersham Pharmacia Biotech cGMP Biotrak cellular communication assay Amersham Pharmacia Biotech IBMX (3-Isobutyl-1-Methylxanthin) Calbiochem
BIM-1 (Bisindolylmaleimid I) Calbiochem
SIN-1 (3-Morpholinosydnonimin) Calbiochem
[3H]-Myo-Inositol Amersham Pharmacia Biotech
Szintillationsflüssigkeit Emulsifier Scintillator Plus Canberra Packard
Dowex-1 (X8, Cl-Form) Supelco
Troponin (vom Kaninchen) Sigma
Biotynl. SDS-PAGE Standard (Low Range) Biorad
2-D SDS-PAGE Standard Biorad
IPG Puffer (pH 3-10) Amersham Pharmacia Biotech IPG Puffer (pH 6-11) Amersham Pharmacia Biotech
Luminol Super Signal Pierce
Anti Troponin I3 Antiserum Prof. Dr. D. Mykles / USA
Anti Calponin Antiserum Dr. M. Gimona / Österreich
Anti Phospho-Serin Antikörper (4A3) Biomol
Biotynl. anti Maus IgM Vector Lab
Biotynl. anti Kaninchen IgG Vector Lab
Vectastain ABC Kit Vector Lab
Alle weiteren Chemikalien wurden von den Firmen Calbiochem, Fluka, Merck, Roth, Serva und Sigma bezogen.
2.4. Geräte, Materialien und Computerprogramme
Geräte
Dynal MPC-S Dynal
Fluoreszenz-Spektrometer LS 50 B Perkin Elmer
Gelhalter (2-D Elektrophorese) Amersham Pharmacia Biotech
Glas-Handhomogenisator Wheaton
Heizblock Kleinfeld Labortechnik
IPGphor Kammer (2-D Elektrophorese) Amersham Pharmacia Biotech
Kraftmessgerät SI Heidelberg
Photometer CE 1021 Cecil Instruments
Megafuge 1.0R Haraeus Sepatech
Mini-Protean II Kammer (1-D Elektrophorese) Biorad
Netzgerät Model 200/2.0 Biorad
Netzgerät EPS 600 Amersham Pharmacia Biotech
Szintillationszähler LS 6000 IC Beckman
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Biorad
Ultraschallbad Elma
Ultrazentrifuge Beckman
Vakuumrotationsverdampfer Bachofer
Materialien
Anionen-Austausch-Säule (Poly Prep) Biorad
Dry-Strip Cover Fluid (2-D Elektrophorese) Amersham Pharmacia Biotech
Dynabeads Protein G Dynal
Filterpapiere (Westernblot) Amersham Pharmacia Biotech
Fluoreszenz Küvetten (PMA) Sigma
Folie für Gele (Gelbond) FMC bioproduct
Immobiline DryStrip Gele (2-D Elektrophorese) Amersham Pharmacia Biotech Nitrocellulose-Membran Schleicher & Schuell
Röntgenfilm (New RX) Fuji
Szintillationsgefäße (Poly-Q Vial) Beckman Computerprogramme
Aida Raytest
Excel ´97 Microsoft
Illustrator 9.0 Adobe
Origin 5.0 Microcal
Photoshop 6.0 Adobe
Windows ´98 Microsoft
Word ´97 für Windows Microsoft
2.5. Biochemische Charakterisierung des 30 kDa Proteins
2.5.1. Muskelpräparation
2.5.1.1. Idotea emarginata
Zunächst wurden die ausschließlich männlichen, adulten Tiere vor der Präparation einige Minuten in 4°C kaltem ASW heruntergekühlt und anschließend decapitiert. Um Präparationsartefakte und Proteindegradation zu vermeiden, wurde die Präparation in eisgekühltem ASW durchgeführt, wobei die Präparierschale in einen tiefgekühlten Aluminiumblock eingelassen war. So konnte die Temperatur während der Präparation bei etwa 8°C gehalten werden.
Die Präparation der dorsalen, zweisegmentalen Extensormuskelfasern (Fasern Nr. 5; zur Nomenklatur und Anatomie siehe Kreissl et al., 1999, 2002), die individuell identifzierbar sind, erfolgte von ventral. Die Beine, die Sternite mit den Flexormuskelfasern und das ventrale Nervensystem wurden entfernt. Auch der Darm, die Verdauungsdrüsen, die Gonaden mit den Vasa deferentia und das Herz wurden vorsichtig aus dem Tier herausgeschnitten. Nun konnten die individuell identifizierten, zweisegmentalen Fasern (Nr. 5) beidseitig aus den Pereion Segmenten 2 und 3, 3 und 4, 4 und 5, 5 und 6 herauspräpariert werden. Dabei wurde darauf geachtet, dass die
Fasern nicht beschädigt wurden. Die isolierten Fasern wurden sogleich in ein 1x1 cm großes Stück Aluminiumfolie eingefaltet, in Eppendorfgefäße verpackt und in flüssigem Stickstoff bis zur Weiterverarbeitung gelagert.
2.5.1.2. Procambarus clarkii
Zur Isolierung der dorsalen superfiziellen Extensormuskeln aus der abdominalen Muskulatur des Flußkrebses wurde das Tier zunächst für einige Minuten auf Eis gekühlt. Danach wurde das Tier decapitiert und das Abdomen vom Carapax abgetrennt. Die Präparation erfolgte von ventral, wobei zwei lateral geführte flache Längsschnitte und ein über dem Telson geführter Querschnitt durchgeführt wurden. Anschließend konnte die ventrale Kutikula mit den abdominalen Flexormuskeln durch Abziehen entfernt werden. Das restliche Abdomen mit den intakten dorsalen Extensormuskeln wurde in einer Präparierschale befestigt und mit 4°C kalter Flußkrebssaline überdeckt. Die dorsalen superfiziellen Extensormuskeln wurden nun aus dem Abdomen herauspräpariert und in Aluminiumfolie in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
2.5.1.3. Orconectes limosus, Eriphia spinifrons, Locusta migratoria
Die Präparation des tiefen, medialen Extensormuskels von Orconestes limosus erfolgte wie in der Arbeit von Gruhn & Rathmayer (2002) beschrieben. Der Beinmuskel aus Eriphia spinifrons wurde nach Rathmayer & Erxleben (1983) aus dem Tier präpariert. Die Präparation des Laufmuskels M93 aus Locusta migratoria wurde nach Bässler (1993) durchgeführt.
2.5.2. Herstellung der Muskelhomogenate
Die aus den Tieren isolierten Muskeln wurden für 20 min mit einem Glas-Handhomogenisator in kaltem Martinez-Extraktionspuffer auf Eis homogenisiert. Danach wurde das Homogenat für 4 min bei 12 000 g zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Der Überstand wurde in ein vorgekühltes Eppendorfgefäß überführt und bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis aufbewahrt.
Die Verarbeitung von 10 Muskelfasern (Nr. 5) aus Idotea in 140 µl Martinez-Extraktionspuffer ergab eine Proteinkonzentration von 3-4 mg/ml (Proteinbestimmung siehe 2.7.).
Die Verarbeitung von einem Extensormuskel aus Procambarus clarkii in 80 µl Martinez-
Martinez-Extraktionspuffer (mod. nach Martinez et al., 1990):
100 mM Na4P2O7 pH 8,5
2,5 mM EDTA
15 mM MgCl2
1 mM Pefabloc 5 mM DTT
2.5.3. Myosinaufreinigung
Die Aufreinigung des Myosins wurde nach einer Methode zur Reinigung von Invertebraten Myosin (Kendrick-Jones et al., 1976) mit leichten Modifikationen durchgeführt. Dabei wurden 50 Muskelfasern Nr. 5 von Idotea in 100 µl Extraktionspuffer I für 10 min mit einem Glas- Handhomogenisator homogenisiert. Das Homogenat wurde dann bei 4°C über Nacht gerührt.
Anschließend wurde das Homogenat mit 100 µl kaltem, destillierten Wasser gemischt und 800 µl kaltes Ethanol wurde langsam dazugegeben, um die schweren Ketten des Myosins zu präzipitieren. Nachdem das Homogenat für 30 min bei 4°C gerührt wurde, wurde es bei 3200 g und 4°C für 30 min zentrifugiert. Das Pellet, welches das Myosin (hauptsächlich die Myosin schweren Ketten, weniger die Myosin leichten Ketten) enthielt, wurde in kaltem Martinez- Extraktionspuffer (Rezept siehe 2.5.2.) gelöst. Der Überstand wurde zur Extraktion der leichten Ketten des Myosins weiterverwendet (siehe 2.5.4.).
Extraktionspuffer I: 10 mM Tris-HCl pH 8,0 6 M Guanidin-HCl
5 mM DTT 2 mM EDTA
2.5.4. Extraktion der leichten Ketten des Myosins
Die leichten Ketten des Myosins wurden nach Kendrick-Jones et al. (1976) aus dem in 2.5.3.
gewonnenen Myosin Überstand extrahiert. Dabei wurde das Ethanol aus dem Überstand mithilfe eines Vakuumrotationsverdampfers bei RT (1 h 30 min) entfernt. Durch Dialyse des Überstands gegen 2 Liter 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM DTT bei RT über Nacht, konnte schließlich das
Guanidin-HCl entfernt werden. Die leichten Ketten des Myosins waren somit im Überstand enthalten.
2.5.5. Präparation des Actomyosins
Das Actomyosin der Idoteen Muskelfasern wurde nach einer modifizierten Methode von Offer et al. (1973) isoliert. Dabei wurden 25 Muskelfasern in 400 µl kalten Guba-Straub Extraktionspuffer überführt. Nach Zugabe von 12 µl Pefabloc (100 mM), wurden die Fasern für 15 min auf Eis homogenisiert. Die Extraktion wurde durch konstantes Rühren für 90 min bei 4°C fortgeführt.
Das Homogenat wurde dann für 10 min bei 15 000 g zentrifugiert und der Überstand entfernt.
Zum Überstand wurde anschließend 4 ml einer Lösung aus 1 mM EDTA und 100 mM MESNA dazugegeben und die Proteine wurden bei 4°C für 1 h präzipitiert. Nach der Präzipitation wurde das Homogenat wieder für 10 min bei 15 000 g zentrifugiert, das Pellet schließlich in 500 µl eines Extraktionspuffers mit ATP gelöst und für 1 h bei 4°C gerührt. Nach Zentrifugation für 2 h bei 105 000 g, wurde der Überstand, der das Actomyosin enthielt, vom Pellet abgetrennt.
Guba-Straub Extraktionspuffer (leicht mod.):
300 mM NaCl pH 6,5
100 mM NaH2PO4
50 mM Na2HPO4
1 mM MgCl2
10 mM Na4P2O7
10 mM EDTA 15 mM NaN3
100 mM MESNA
Extraktionspuffer mit ATP: 100 mM Na4P2O7
4 mM EDTA 3 mM DTT 12 mM ATP
2.5.6. Isolierung dünner Filamente
Proteine des dünnen Filaments aus der Extensormuskulatur von Idotea wurden nach einer Methode zur Isolierung des dünnen Filaments aus Abdominalmuskeln des Flußkrebses (Watanabe et al., 1982) extrahiert. Die Extensormuskelfasern (Nr. 5) von Idotea wurden in kaltem Extraktionspuffer II 10 min auf Eis homogenisiert. Nach dem das Homogenat für 10 min auf Eis belassen wurde, wurde es anschließend für 20 min bei 85 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und für 2 h bei 105 000 g zentrifugiert. Das Pellet, welches die Proteine des dünnen Filaments enthielt, wurde schließlich in Extraktionspuffer III gelöst.
Extraktionspuffer II: 6,7 mM Na-Phosphat-Puffer pH 6,0 50 mM KCl
1 mM MgCl2
0,1 mM EDTA 5 mM ATP
Extraktionspuffer III: 10 mM Tris-HCl pH 6,8 50 mM KCl
1 mM MgCl2
0,1 mM CaCl2
0,5 mM DTT
2.5.7. Protein-Auftrennung durch SDS-Gelelektrophorese
Aufgrund ihrer Eigenschaften können Proteine in Polyacrylamidgelen nach verschiedenen Kriterien aufgetrennt werden. Ihre Mobilität in diesen Gelen ist nicht nur von ihrer Größe und Form, sondern auch von ihrer Nettoladung abhängig. Will man eine Auftrennung ausschließlich nach Größe und Form erreichen, müssen die Ladungen der Proteine mit einem Detergens (SDS) überdeckt werden. Liegen die Molekulargewichte zweier Proteine sehr nahe beieinander, stößt diese ein-dimensionale SDS-Gelelektrophorese jedoch an ihre Grenzen. Die isoelektrische Fokussierung, die sich Unterschiede in der Nettoladung der Proteine zunutze macht, ermöglicht noch eine weitere Auftrennung der Proteine in einem pH-Gradienten nach ihren isoelektrischen Punkten.
2.5.7.1. Ein-dimensionale SDS-Gelelektrophorese
Die ein-dimensionale (1-D) SDS-Gelelektrophorese nach Laemmli (1970) trennt Proteine und Proteinuntereinheiten im elektrischen Feld nach ihren relativen molekularen Massen auf. Dabei werden die Ladungen der Proteine mithilfe des anionischen Detergens SDS gleichmäßig überdeckt. Der Vernetzungsgrad im Polyacrylamindgel bestimmt die Laufgeschwindigkeit der Proteine. Um eine gute Auflösung bei dem Molekulargewicht von 30 kDa zu erhalten, wurden ausschließlich 15 %ige SDS-Gele verwendet.
Die 1-D Gelelektrophorese wurde mit der Mini-Protean II Kammer der Firma Biorad nach Anleitung des Herstellers (instruction manual, Mini-Protean II Electrophoresis Cell) durchgeführt.
Lösungen
15 % Gel (15 % T, 2,5 % C): Trenngel Sammelgel
Acrylamid (30 %) 4,8 ml 14,62 % 1,15 ml 3,45 % Bisacrylamid (2 %) 1,9 ml 0,38 % 1,65 ml 0,33 % Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) 2,5 ml 375 mM
Tris-HCl (0,5 M, pH 6,8) 2,5 ml 125 mM
H2Omillipore 0,65 ml 4,54 ml
SDS (10 %) 0,1 ml 0,1 % 0,1 ml 0,1 %
TEMED 0,005 ml 0,05 % 0,01 ml 0,1 %
APS (10 %) 0,05 ml 0,05 % 0,05 ml 0,05 %
Die Mengen sind ausreichend für jeweils 2 Gele.
Laemmli-Probenpuffer (mod. nach Laemmli, 1970):
60 mM Tris-HCL pH 6,8
10 % (v/v) Glycerin
5 % (w/v) SDS
0,4 M MESNA
0,04 % (w/v) Bromphenolblau
mit H2Omillipore auf 10 ml auffüllen
Der Probenpuffer wurde bei 30°C gelöst, à 250 µl aliquotiert und bei -20°C aufbewahrt.
Im Laemmli-Probenpuffer wurde die Substanz 2-Mercaptoethansulfonat (MESNA) anstatt von 2- Mercaptoethanol verwendet. Ebenso wie Mercaptoethanol spaltet MESNA Schwefelbrücken und kann in gleicher Konzentration eingesetzt werden. Der große Vorteil des MESNA besteht darin, dass es weitgehend geruchslos ist.
Laufpuffer (Stammlösung): 75 mM Tris-BASE
576 mM Glycin
0,3 % (w/w) SDS
mit H2Omillipore auf 2 l auffüllen
Diese Stammlösung wurde bei RT aufbewahrt und für jeden Elektrophorese-Lauf 1:7 mit H2Omillipore verdünnt.
Gießen der Gele
Die Glasplatten, die Probenkämme und die Abstandshalter („spacer“) der Gelelektrophorese- Apparatur wurden vor dem Ansetzen der Gele gründlich mit Ethanol und H2Omillipore gereinigt.
Anschließend wurden die Glasplatten nach Angaben des Herstellers zusammengesetzt und im Gießständer befestigt. Zuerst wurde das Trenngel, dann das Sammelgel gegossen. Es wurden alle Gellösungen, außer SDS und den Polymerisationskatalysatoren TEMED und APS, gemischt und für 10 min entgast. Dann wurde SDS, TEMED und APS zugegeben, die Lösung vorsichtig vermischt und nach 3 min mit einer Pasteur-Pipette luftblasenfrei zwischen die Glasplatten gefüllt.
Die Trenngellösung wurde bis zu einer Höhe von 5,3 cm eingefüllt, um eine Trenngellänge von 5,0 cm zu erreichen. Diese Länge hat sich als optimal für die gewünschte Auftrennung erwiesen.
Um eine glatte Trennfläche zu erhalten, wurde die Trenngellösung mit unvergälltem Ethanol überschichtet. Nach der Polymerisation des Trenngels (nach ca. 1½ h) wurde der Alkohol abgesaugt, die Geloberfläche mehrmals mit H2Omillipore gespült und die Flüssigkeitsreste wurden mit einem Filterpapier aufgenommen. Nun konnte die ebenfalls entgaste Sammelgellösung zwischen die Glasplatten eingefüllt werden. Der Probenkamm wurde so weit in die Gellösung eingeführt, bis dass ein Sammelgel der Länge 1 cm entstand. Die auspolymerisierten Gele wurden in einer Plastiktüte luftdicht verschlossen und über Nacht bei 4°C aufbewahrt.
Maße der Gele: Sammelgel: 1x8 cm
Trenngel : 5x8 cm
Dicke : 0,75 mm
Probenvorbereitung
Die vorliegenden Homogenate wurden vor Auftragung auf das Gel mit dem Laemmli- Probenpuffer im Verhältnis 1:1 gemischt. Zusätzlich wurden zu den vorbereiteten Proben Proteaseinhibitoren (Pefabloc, 5 mM) und DTT (12 mM) zugegeben. Die Proben wurden anschließend für 10 min gekocht, nochmals mit 5 mM Pefabloc versetzt und 3 min bei 12 000 g abzentrifugiert.
Je Probentasche wurde 10 µl des Probenüberstandes auf das Gel aufgetragen. Die Gele wurden zuvor in die Elektrophoresekammer eingesetzt und mit Laufpuffer bedeckt. Die Vorbereitung der Markerproteine (Biotinylierte SDS-PAGE Standard, Low Range, Biorad; 1:20 in Probenpuffer verdünnt) wurde nach dem gleichen Schema durchgeführt.
Elektrophorese
Die Elektrophorese wurde bei RT wie folgt durchgeführt:
Spannung: 180 V
Stromstärke: zu Beginn: ca. 50 mA gegen Ende: ca. 25 mA
Laufzeit: ca. 1 h 15 min (jedoch variabel, entsprechend der Lauffront)
2.5.7.2. Zwei-dimensionale Gelelektrophorese
Mithilfe der zwei-dimensionalen (2-D) Gelelektrophorese werden Proteine und Proteinuntereinheiten im elektrischen Feld nicht nur nach ihrem Molekulargewicht, sondern auch nach ihrer Nettoladung aufgetrennt. Dabei werden die Proteine zuerst in einem pH-Gradienten isoelektrisch fokussiert und anschließend nach ihrem Molekulargewicht in einer 1-D SDS- Gelelektrophorese getrennt (O´Farell, 1975). Der große Vorteil der isoelektrischen Fokussierung besteht darin, dass im Vergleich zur 1-D SDS-Gelelektrophorese, ein Vielfaches von Proteinen aus einem komplexen Proteingemisch aufgetrennt werden kann. Zusätzlich können jedoch auch geringe Veränderungen eines Proteins identifiziert werden, da die Nettoladung von
Phosphorylierungen, Acetylierungen und Glykosylierungen des Proteins beeinflußt wird (Rabilloud, 2000).
Die isoelektrische Fokussierung wurde mit einer IPGphor Kammer der Firma Amersham Pharmacia Biotech nach Anleitung des Herstellers (Berkelman & Stenstedt, 1998) durchgeführt.
Die Proteine der Extensormuskulatur von Idotea wurden über einen Bereich von pH 3-10 und über einen Bereich von pH 6-11 fokussiert.
Lösungen
Probenpuffer: 8 M Harnstoff
4 % (w/v) CHAPS
40 mM Tris-BASE
Aliquote können bei -20°C aufbewahrt werden.
Rehydrationspuffer: 8 M Harnstoff
2 % (w/v) CHAPS
0,5 % (v/v) IPG Puffer (pH 3-10) bzw. 0,5 % (v/v) IPG Puffer (pH 6-11)
Bei der isoelektrischen Fokussierung im Bereich pH 3-10 wurde der Rehydrationspuffer mit dem IPG Puffer (pH 3-10) eingesetzt, bei einer Fokussierung im Bereich pH 6-11 der Puffer mit dem IPG Puffer (pH 6-11). Aliquote des Rehydrationspuffers können bei -20°C aufbewahrt werden.
SDS-Equilibrierungspuffer: 50 mM Tris-HCl pH 8,8 6 M Harnstoff
30 % (v/v) Glycerin 2 % (w/v) SDS
wenige Körner Bromphenolblau
Aliquote können bei -20°C aufbewahrt werden. Vor Gebrauch wird zum SDS- Equilibrierungspuffer 16 mM DTT hinzugefügt.
Agarose-Stammlösung: 14 % (v/v) SDS Laufpuffer
1 % (w/v) Agarose (NA)
wenige Körner Bromphenolblau
Die Agarose-Stammlösung muß kurz erhitzt werden, bis sich die Agarose vollständig löst.
Aliquote können bei RT aufbewahrt werden.
Gele
Die Gele für die isoelektrische Fokussierung wurden gebrauchsfertig bei der Firma Amersham Pharmacia Biotech gekauft. Dabei handelt es sich um Immobiline DryStrip Gele, die 7 cm lang und 3 mm breit sind und einen linearen pH Gradienten von pH 3-10 bzw. pH 6-11 haben. Sie können bei -20 °C aufbewahrt werden, sollten aber vor Gebrauch bei RT sein.
Probenvorbereitung
Die Muskelhomogenate von Idotea wurden, wie unter 2.5.2. beschrieben, vorbereitet. Je Probe wurden 3 µl Homogenat und 27 µl Probenpuffer eingesetzt. In den 3µl Homogenat waren etwa 10 µg Muskelprotein enthalten. Die Probe (3 µl Homogenat + 27 µl Probenpuffer) wurde gut gevortext und 1 h bei RT aufbewahrt. Anschließend wurde je Probe 95 µl Rehydrationspuffer dazu gegeben, kurz gevortext und das Gemisch luftblasenfrei in einen leeren Gelhalter („Schiffchen“) überführt. Dabei sollte die Flüssigkeit gleichmäßig im Gelhalter verteilt sein.
Die hohe Konzentration an Harnstoff und das Detergenz CHAPS im Probenpuffer und im Rehydrationspuffer ermöglichen die vollständige Entfaltung der Proteine und verhindern eine Aggregation von Proteinkomplexen. Dies ist sehr wichtig, um Proteine in einem pH-Gradienten isoelektrisch fokussieren zu können. Der IPG Puffer, welcher die entsprechenden Ampholyte für den pH Gradienten beinhaltet, erhöht ebenfalls die Löslichkeit der Probe und bewirkt zusätzlich eine gleichmäßig verteilte Leitfähigkeit über den gesamten pH Bereich während der Fokussierung.
Die Probenvorbereitung und die isoelektrische Fokussierung des 2-D SDS-PAGE Standards (Biorad) im Bereich pH 3-10 wurde in gleicher Weise durchgeführt, wie die Fokussierung der Proteine aus dem Crustaceen-Muskelhomogenat. Dabei wurden 3,5 µl des Standards eingesetzt, welche mit 26,5 µl Probenpuffer vermischt wurden. Der 2-D SDS-PAGE Standard (Biorad) beinhaltet die Proteine Conalbumin (76 kDa, pI 6,0, 6,3, 6,6), Albumin (66,2 kDa, pI 5,4, 5,6), Aktin (43 kDa, pI 5,0, 5,1), GAPDH (36 kDa, pI 8,3-8,5), Carbonische Anhydrase (31 kDa, pI
Rehydration und isoelektrische Fokussierung
Vor der eigentlichen isoelektrischen Fokussierung der Proteine müssen die Gele rehydriert werden. Dazu wurde das Gel nun ebenfalls luftblasenfrei in den Gelhalter, der bereits die Probe mit Rehydrationspuffer enthielt, gelegt, so dass das Gel Kontakt mit den zwei Elektroden des Gelhalters hat. Damit das Gel während der Fokussierung nicht austrocknet, wurde es mit 180 µl Dry Strip Cover Fluid (Amersham Pharmacia Biotech) überdeckt. Der Gelhalter wurde mit einem Deckel verschlossen und in die IPGphor Kammer nach Anleitung des Herstellers gestellt.
Programm für die Fokussierung im Bereich pH 3-10:
Rehydration 10-16 h
S1: 500 V 0:30 h 250 Vh Step-n-hold
S2: 1000 V 1:00 h 1000 Vh Step-n-hold S3: 8000 V 2:00 h 16000 Vh Step-n-hold
Programm für die Fokussierung im Bereich pH 6-11:
Rehydration 10-16 h
S1: 500 V 0:30 h 250 Vh Step-n-hold
S2: 1000 V 1:00 h 1000 Vh Step-n-hold S3: 8000 V 3:45 h 27600 Vh Step-n-hold
Nach der Fokussierung wurden die Gele aus dem Gelhalter herausgehoben, in SDS- Equlibrierungspuffer überführt und darin für 15 min auf einem Schüttler inkubiert.
Der Equilibrierungspuffer enthält Substanzen, die zur Vorbereitung der Proteine für die Auftrennung in der zweiten Dimension, notwendig sind. So werden während der Equilibrierung die Ladungen der Proteine mit SDS überlagert, um die Proteine schließlich nach ihrem Molekulargewicht auftrennen zu können. Glycerin verbessert den Transfer der Proteine von der ersten auf die zweite Dimension und DTT erhält den vollständig reduzierten Status der denaturierten Proteine.
SDS-Gelelektrophorese (Zweite Dimension)
Nach der Equilibrierung wurde das Gel über einem Filterpapier abgetropft, auf ein 15 %iges SDS- Gel (ohne Sammelgel) überführt und mit Agarose überdeckt. Die Agarose fixiert das Gel der
isoelektrischen Fokussierung auf dem SDS-Gel und ermöglicht die Anfertigung von Markertaschen für der Molekulargewichtsmarker der 2. Dimension.
Um die etwa 0,75 mm dicken Gelstreifen der ersten Dimension auf das SDS-Gel aufbringen zu können, wurde das Gel der zweiten Dimension mit 1 mm dicken Abstandshaltern gegossen. Die Laufbedingungen der SDS-Gelelektrophorese der zweiten Dimension stimmen mit denen der 1-D Gelelektrophorese überein (siehe 2.5.7.1.).
2.5.8. Silbernitratfärbung von Proteinen im Gel (nach Heukeshoven & Dernick, 1988)
Die Silbernitratfärbung ist eine sehr sensitive Methode, bei der schon geringe Mengen an Protein (weniger als 1 µg) nachgewiesen werden können (Burden & Knippenberg, 1988). Dabei werden zuerst die Proteine im Gel fixiert. Die gelösten Silberionen werden unter sauren Bedingungen von den Proteinen zu Protein-Silberkomplexen gebunden. Die nun gebundenen Silberionen werden anschließend durch Formaldehyd in saurer Lösung zu metallischem Silber reduziert, was zu einer Schwärzung der Proteinbanden führt (Eckert & Kartenbeck, 1997). Durch Zugabe einer Stopplösung wird die Färbung schließlich unterbrochen.
Durchführung
• Fixieren 30 % (v/v) Ethanol 3 h oder über Nacht
10 % (v/v) Essigsäure
• Sensitivieren 30 % (v/v) Ethanol 30 min 0,5 M Natriumacetat x 3 H2O
0,5 % (v/v) Formaldehyd (37 %)
0,2 % (w/v) Natriumthiosulfat
• Waschen H2Omillipore 3 x 10 min
• Färben 0,1 % (w/v) Silbernitrat 60 min 0,02 % (v/v) Formaldehyd (37 %)
• Waschen H2Omillipore kurz abspülen
• Entwickeln 2,5 % (w/v) Natriumchlorid 2 x kurz abspülen 0,01 % (v/v) Formaldehyd (37 %) neuer Entwickler
• Stoppen 5 % (v/v) Essigsäure kurz
• Waschen H2Omillipore kurz abspülen
Aufbewahrungslösung für Gele: 10 % (v/v) Ethanol 5 % (v/v) Glycerin
Die Gele können in dieser Lösung bei 4°C bis zum Trocknen aufbewahrt werden und verlieren nicht an Farbintensität. Zur weiteren Auswertung wurden die Gele mit einem Flachbett- Durchlichtscanner eingescannt und im Computer gespeichert. Anschließend wurden sie in einem Vakuumtrockner auf einer Spezialfolie eingeschweißt und aufbewahrt.
2.5.9. Übertragung von Proteinen auf eine Nitrocellulose-Membran (Westernblot)
Durch diese Methode kann die elektrophoretische Proteinauftrennung mit immunchemischen Nachweismethoden verbunden werden. Dabei werden Proteine, die durch die Gelelektrophorese spezifisch aufgetrennt wurden, direkt auf eine Nitrocellulose-Membran (NC-Membran) übertragen. Das Proteinmuster im Gel entspricht so exakt dem Proteinmuster auf der Membran.
Als Methode wurde das SemiDry-Blotting-Verfahren nach Kyhse-Andersen (1984) angewandt.
Diskontinuierliche Puffer
Anodenpuffer I: 300 mM Tris-HCL pH 10,4 20 % (v/v) Methanol
Anodenpuffer II: 25 mM Tris-HCL pH 10,4 20 % (v/v) Methanol
Kathodenpuffer: 40 mM Aminocapronsäure 20 % (v/v) Methanol
0,01 % (w/v) SDS
Durchführung
Nach der Elektrophorese wurden die zu blottenden Gele 7 min in Kathodenpuffer äquilibriert. Die Filterpapiere und die Nitrocellulose-Membran wurden auf eine Fläche von 8 x 10 cm2 geschnitten und in den jeweiligen Lösungen (siehe unten) äquilibriert. Anschließend konnte der Transferstapel (von unten nach oben) auf der unteren Elektrodenplatte der Biorad Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (siehe Instruction Manual, Trans-Blot SD Semi-Dry E. Transfer Cell), aufgebaut werden:
• 6 Filterpapiere (äquilibriert in Anodenpuffer I)
• 3 Filterpapiere (äquilibriert in Anodenpuffer II)
• NC-Membran (äquilibriert in Anodenpuffer II)
• äquilibriertes Gel
• 6 Filterpapiere (äquilibriert in Kathodenpuffer)
Das Gel, die NC-Membran und die Filterpapiere wurden luftblasenfrei aufeinander gelegt, damit die vollständige Übertragung der Proteine gewährleistet werden konnte. Um ein luftblasenfreies System zu erhalten, wurde das Gel mithilfe einer Overhead-Folie auf die NC-Membran übertragen und die Filterpapiere sorgfältig mit einem Handroller ausgerollt.
Nach Anbringung der oberen Elektrodenplatte wurde der Transfer bei konstanter Stromstärke von 64 mA (0,8 mA x cm2 Filterpapierfläche) für 55 min durchgeführt. Zur Kontrolle der vollständigen Proteinübertragung wurde das Gel anschließend mit Silbernitrat gefärbt.
Während der Elektrophorese zur Auftrennung der Proteine befand sich immer auch ein zweites Gel in der Elektrophorese-Kammer, das in der gleichen Art wie das zu blottende Gel beladen war.
Die aufgetrennten Proteine dieses Paralell-Gels wurden anschließend nicht geblottet, sondern mit Silbernitrat angefärbt, um die Proteinauftrennungen vergleichen zu können.
2.5.10. Immunfärbung der Proteine
Mithilfe von immunchemischen Methoden können Proteine markiert und identifiziert werden.
Dabei treten Antikörper über spezifische Bindungsstellen mit den Proteinen in Wechselwirkung und können durch eine entsprechende Nachweisreaktion sichtbar gemacht werden.
Der primäre Antikörper bindet an sein Antigen und wird anschließend mit einem sekundären polyklonalen und markierten z.B. biotinylierten Antikörper gekoppelt. In einem dritten Schritt wird an den sekundären Antikörper ein Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex gebunden. Das Antigen kann nun durch eine Peroxidase-katalysierte Umsetzung (ECL-System) von H2O2 über eine Lichtemission indirekt, mithilfe blauempfindlicher Röntgenfilme, sichtbar gemacht werden.
Um unspezifische Hintergrundreaktionen zu vermeiden, müssen vor der Durchführung des immunchemischen Nachweises unspezifische Bindungsstellen für die Antikörper auf der Blot- Membran vollständig abgesättigt werden. Zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen werden einerseits Proteine verwendet, die möglichst keine Reaktion mit den Antikörpern aufweisen, andererseits werden durch nicht-ionische Detergenzien, wie Tween 20, hydrophobe Wechselwirkungen der Reaktanden mit der Membran verhindert (Garfin & Bers, 1989).
Verwendete Primäre Antikörper bzw. Antiseren
anti Calponin Antiserum:
- „new poly α-pan CaP Prot A elu 2/98“
- polyklonales Antiserum gegen Calponin aus dem Muskelmagen des Huhns, hergestellt im Kaninchen
- Verdünnung 1:100 in Blockpuffer I
- Geschenk von Dr. M. Gimona, Österreichische Akademie der Wissenschaft, Salzburg
anti TnI3 Antiserum:
- polyklonales Antiserum gegen TnI3 aus der Abdominalmuskulatur des Hummers, hergestellt im Kaninchen
- Verdünnung 1:5000 (1-D Elektrophorese) und 1:2500 (2-D Elektrophorese) in Blockpuffer I
- Geschenk von Prof. Dr. D. Mykles, Colorado State University, Fort Collins, USA
anti Phospho-Serin Antikörper:
- monoklonaler IgM Antikörper (Klon 4A3, Biomol), hergestellt in der Maus
- Verdünnung 1:500 in Blockpuffer II
- Spezifität: Der Antikörper bindet spezifisch an Proteine, die Phosphoserin enthalten.
- Positivkontrolle: Phosphoproteine isoliert aus Kaninchen Muskeln; vom Hersteller mitgeliefert
Lösungen
PBS (phosphate buffered saline):
1,9 mM NaH2PO4 pH 7,4
8,1 mM Na2HPO4
154 mM NaCl
Blockpuffer I: 0,5 % (w/v) BSA (Cohn V)
1 % (w/v) Polyvinyl-Pyrrolidone (PVP) 1 % (w/v) Polyethylenglycol (PEG 3500) 0,2 % (v/v) Tween 20
10 mM NaF gelöst in PBS
Blockpuffer II: 5 % (w/v) Magermilchpulver gelöst in Waschpuffer
Waschpuffer: 100 mM Tris-Base/HCl pH 7,6
0,9 % (w/v) NaCl
0,01 % (v/v) Tween 20
Entwicklungslösung: 50 % (v/v) Luminol/Enhancer Solution 50 % (v/v) Stable Peroxide Solution
Durchführung
• Vorinkubation 10 min in Waschpuffer
• Blocken 2 h in Blockpuffer
• Primärer Antikörper anti Calponin / anti TnI3 1 h in Blockpuffer anti P-Serin über Nacht in Blockpuffer
• Waschen 6 x 10 min in Waschpuffer (gründlich !)
• Sekundärer Antikörper 90 min, gelöst in Blockpuffer (1:500)
(bei anti Calponin/anti TnI3: biotinyl. anti Kaninchen IgG; bei anti P-Serin: biotinyl. anti Maus IgM)
• Waschen 6 x 10 min in Waschpuffer (gründlich !)
• Avidin-Biotin-Komplex 90 min, gelöst in Waschpuffer (1:500)
• Waschen 6 x 10 min in Waschpuffer (gründlich !)
• ECL-System 2 min in Entwicklungslösung
Die einzelnen Schritte der Immunfärbungen wurden bei RT und auf einem Schüttler durchgeführt.
Um IgG Aggregate zu verhindern, musste der anti P-Serin Antikörper vor Gebrauch für 1 h bei 37°C im Wasserbad gelöst werden.
Nach der Inkubation der NC-Membran in der ECL-Entwicklungslösung wurde die Membran über einem Filterpapier gut abgetropft, mit der Proteinseite nach oben auf eine Glasplatte gelegt und mit Frischhaltefolie überdeckt. Zur Entfernung von Luftblasen wurde ein Handroller verwendet.
In einer Dunkelkammer wurde dann die Lichtemission mithilfe von Röntgenfilmen festgehalten.
2.5.11. Immunpräzipitation
Die Methode der Immunpräzipitation ermöglicht die partielle Reinigung eines Antigens, gewöhnlich eines Proteins, aus einer komplexen Mischung löslicher Moleküle (siehe Harlow &
Lane, 1999). Dabei wird das in einer Lösung befindliche Antigen an einen spezifischen, hoch affinen Antikörper gebunden und dieser Komplex mithilfe von Protein A bzw. Protein G gekoppelten Polystyren-Kugeln aus der Lösung entfernt. Durch die anschließende elektrophoretische Auftrennung des präzipitierten Antigens in einem SDS-Gel und Immunfärbungen mit Antikörpern können weitere Charaktermerkmale des Antigens ermittelt werden.
Die Immunpräzipitation des zu charakterisierenden 30 kDa Proteins wurde mit dem anti TnI3
Antiserum an Muskelhomogenaten der Extensormuskelfasern (Nr. 5) von Idotea und an Muskelhomogenaten der dorsalen superfiziellen Extensormuskulatur von Procambarus durchgeführt.
Lösungen
Lyse-Puffer: 50 mM Tris-HCl pH 8,0
150 mM NaCl
2 mM EDTA
1 % (v/v) NP 40
5 mM DTT 1 mM Pefabloc
PBS (phosphate buffered saline): pH 7,4 1,9 mM NaH2PO4
8,1 mM Na2HPO4
154 mM NaCl
Waschpuffer I: 50 mM Tris-HCl pH 8,0
150 mM NaCl
2 mM EDTA
0,1 % (v/v) NP 40
Waschpuffer II: 50 mM Tris-HCl pH 8,0
150 mM NaCl
2 mM EDTA
