Messung der cGMP-Konzentration

Obwohl die Ergebnisse der Koffein-Experimente die Annahme erlaubten, dass das Neuropeptid Proctolin die PLC aktiviert, wurde nach Proctolin-Stimulation in der Extensormuskulatur von Idotea kein Anstieg des Inositolphosphat-Spiegels gemessen. Da nach Aktivierung der PLC nicht nur Inositolphosphate entstehen, sondern auch DAG gebildet wird, sollte dieser Weg zusätzlich untersucht werden.

Von DAG ist bekannt, dass es in verschiedenen Zellen die PKC stimuliert (Huang, 1989). Die durch Vasopressoren aktivierte PKC verhindert in der glatten Muskulatur von Vertebraten die Produktion von cGMP (Jaiswal, 1992). Deshalb wurde in der Extensormuskulatur von Idotea nun der Einfluss von Proctolin auf die cGMP-Konzentration gemessen.

In Anlehnung an die physiologischen Experimente von Erxleben et al. (1995), bei denen Proctolin nach einer Inkubationszeit von 13 min kontraktionsverstärkende Wirkung auf die dorsale Extensormuskulatur von Idotea zeigte, wurden bei den hier durchgeführten Messungen der cGMP-Konzentrationen die Extensormuskelfasern von Idotea für 15 min mit 10^-6 M Proctolin stimuliert. Dabei lag nach der Simulation mit 10^-6 M Proctolin für 15 min der Wert der cGMP-Konzentration bei 12,32 fmol pro mg Protein (SE ±2,1 fmol/mg, n=6; Abb. 22).

Abb. 22 Effekt von Proctolin auf die cGMP-Konzentration der Extensormuskulatur von Idotea. Nach einer Stimulation der Fasern von 15 min mit 10^-6 M Proctolin reduzierte sich der Wert der cGMP-Konzentration signifikant im Vergleich zum Kontrollwert. Die Werte sind Durchschnittswerte aus 6 unabhängigen Experimenten. Die Fehlerbalken geben die Standardfehler (SE) an.

Ohne Stimulation mit Proctolin befand sich der Kontrollwert der cGMP-Konzentration nach 15 min bei 24,81 fmol/mg (SE ±1,3 fmol/mg, n=6). Durch den Einfluß von Proctolin verminderte sich die cGMP-Konzentration in der Extensormuskulatur von Idotea signifkant (p<0,01) um den Faktor 2 (Abb. 22).

Da die Proctolin-induzierte Verminderung der cGMP-Konzentration durch die Aktivierung einer Phosphodieseterase (PDE) und/oder durch die Hemmung einer Guanylatzyklase zustande kommen kann, wurden diese beiden Möglichkeiten näher untersucht.

Auch in Anwesenheit des PDE-Hemmstoffs IBMX (0,5 mM) und auch bei einer kurzen Stimulationszeit von 3 min wurde durch den Einfluss von 10^-6 M Proctolin die cGMP-Konzentration in der Extensormuskulatur von Idotea signifikant (p<0,05) um den Faktor 1,7 reduziert (Abb. 23).

Abb. 23 Messung der cGMP-Konzentration der Extensormuskulatur von Idotea nach einer Stimulation mit Proctolin und dem Phosphodiesterase Hemmstoffs IBMX für eine Zeit von 3 min. Durch den Einfluß von Proctolin (10^-6 M) reduzierte sich auch in Anwesenheit von 0,5 mM IBMX die cGMP-Konzentration der Fasern signifikant im Vergleich zur cGMP-Konzentration der Kontrolle. Die Werte sind Durchschnittswerte aus mind. 3 unabhängigen Experimenten. Die Fehlerbalken geben die Standardfehler (SE) an.

Der Kontrollwert der cGMP-Konzentration lag bei 148,53 fmol/mg (SE ±6,28 fmol/mg, n=3).

Nach Proctolin-Stimulation betrug die cGMP-Konzentration 90,13 fmol/mg (SE ±11,46 fmol/mg, n=4). Insgesamt erhöhte sich in Anwesenheit des PDE-Hemmstoffs IBMX (0,5 mM) die cGMP-Konzentration der Muskelfasern von 24,81 fmol/mg (Kontrolle nach 15 min Stimulation) auf

148,53 fmol/mg (Kontrolle + 0,5 mM IBMX nach 3 min Stimulation) um den Faktor 6. Der Hemmstoff IBMX wirkt somit in der Idoteen Muskulatur auf Phosphodiesterasen und verhindert neben dem Abbau von cAMP (siehe 3.2.1.3.) auch den Abbau von cGMP in den Zellen.

Da der Effekt von Proctolin auf die cGMP-Konzentration auch in Anwesenheit eines PDE-Hemmstoffs zu beobachten war, wird Proctolin die Phosphodiesterasen in der Extensormuskulatur nicht oder nur schwach aktivieren. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass Proctolin über die Aktivierung der PKC eine Guanylatzyklase der Muskelzellen hemmt.

Wurden die Extensormuskelfasern für 15 min mit 10^-8 M des spezifischen PKC-Hemmstoff BIM-1 (Toullec et al., 1991) inkubiert und wurde dann die cGMP-Konzentration der Muskelzellen gemessen, betrug der cGMP Wert 27,7 fmol/mg (SE ±3,19 fmol/mg, n=8). Dieser Wert unterscheidet sich nicht signifikant vom Kontrollwert der cGMP-Konzentration nach 15 min (24,81 fmol/mg, SE ±1,3 fmol/mg, n=6) (Abb. 24). Wurden die Muskelfasern für 15 min in Anwesenheit des PKC-Hemmstoffs BIM-1 (10^-8 M) mit 10^-6 M Proctolin stimuliert, betrug der Wert der cGMP-Konzentration 33,8 fmol/mg (SE ±7,6 fmol/mg, n=6). Auch dieser Wert unterscheidet sich nicht signifikant von dem Kontrollwert (24,81 fmol/mg) und dem cGMP Wert nach Inkubation der Fasern mit BIM-1 (27,7 fmol/mg). Jedoch war ein signifikanter Unterschied (p<0,05) zwischen der cGMP-Konzentration der Muskelfasern nach Proctolin-Stimulation und der cGMP-Konzentration nach Proctolin-Stimulation und gleichzeitiger Anwesenheit des PKC Hemmstoffs zu beobachten (Abb. 24). Nach Stimulation mit 10^-6 M Proctolin befand sich die cGMP-Konzentration bei 12,32 fmol/mg (SE ±2,1 fmol/mg, n=6). Wurde nun die PKC spezifisch gehemmt, betrug der Wert der cGMP-Konzentration nach Proctolin-Stimulation 33,8 fmol/mg, was in etwa der cGMP-Konzentration ohne Proctolin-Stimulation entspricht. Die durch Proctolin induzierte Verminderung der cGMP-Konzentration in der Extensormuskulatur von Idotea wird somit durch eine PKC vermittelt.

Um zu überprüfen, ob in der Extensormuskulatur von Idotea die cGMP Produktion nicht nur gehemmt, sondern auch aktiviert werden kann, wurden die Fasern für 5 min in dem NO-Donor SIN-1 (Jones et al., 1994) und 30 mM KCl inkubiert. Von dem Gas NO weiß man, dass es eine Guanylatzyklase aktiviert und somit die cGMP-Konzentration erhöht, was in glatten Muskelzellen schließlich zu einer Erschlaffung des Muskels führt (Murphy & Walker, 1998).

Wurden die Extensormuskelfasern von Idotea 5 min in 30 mM KCl inkubiert, betrug der Wert der

Muskeln eine Kaliumkontraktur durchführen und in einem kontrahierten Zustand vorliegen (Weiss et al., 2001), um anschließend zu relaxieren. Bei gleichzeitiger Inkubation der Fasern in 30 mM KCl und 10^-4 M SIN-1 für eine Zeit von 5 min stieg der Wert der cGMP-Konzentration auf 73,7 fmol/mg (n=1) an. Dieses Experiment zeigt, dass die cGMP-Produktion in der Extensormuskulatur von Idotea nicht nur gehemmt, sondern auch aktiviert werden kann.

Abb. 24 Die Proctolin-induzierte Verminderung der cGMP-Konzentration in der Extensormuskulatur von Idotea wird durch PKC vermittelt. Wurden Extensormuskelfasern für 15 min in dem spezifischen PKC-Inhibitor BIM-1 (10^-8 M) inkubiert, blieb die Konzentration der Fasern im Bereich der cGMP-Konzentration der Kontrollfasern. Nach Stimulation der Fasern mit 10^-6 M Proctolin bei gleichzeitiger Hemmung der PKC durch 10^-8 M BIM-1, blieb die Konzentration ebenfalls im Bereich der Konzentration der Kontrolle. In Anwesenheit von BIM-1 wurde keine Verminderung der cGMP-Konzentration durch Proctolin gemessen. Die cGMP-cGMP-Konzentration nach Stimulation mit Proctolin unterschied sich signifikant von der cGMP-Konzentration nach Stimulation mit Proctolin und BIM-1 und sie unterschied sich auch signifikant von der cGMP-Konzentration der Kontrollfasern. Die Werte sind Durchschnittswerte aus mind. 6 unabhängigen Experimenten. Die Fehlerbalken geben die Standardfehler (SE) an.

Zusammenfassung:

Durch den Effekt des Neuropeptids Proctolin (10^-6 M) wurde die cGMP-Konzentration in der Extensormuskulatur von Idotea signifikant um den Faktor 2 reduziert. Diese Verminderung der cGMP-Konzentration durch Proctolin war auch in Anwesenheit des PDE-Hemmstoffs IBMX zu beobachten. Wurde durch den spezifischen Hemmstoff BIM-1 die PKC in den Muskelzellen gehemmt, konnte die durch Proctolin induzierte Verminderung der cGMP-Konzentration nicht mehr gemessen werden. Der Effekt von Proctolin auf die cGMP-Konzentration in der Extensormuskulatur von Idotea wird somit durch die PKC vermittelt.

4. Diskussion

4.1. Charakterisierung des 30 kDa Proteins