Messung der Inositolphophate

Die Verstärkung der Amplitude Koffein-induzierter Kontrakturen durch Proctolin steht nicht mit der Annahme im Widerspruch, dass das Neuropeptid Proctolin über eine Erhöhung der InsP3 -Konzentration in der Extensormuskulatur von Idotea intrazelluläres Ca²⁺ freisetzt. Deshalb sollten nun direkt die Inositolphosphate nach Proctolin-Stimulation in der Extensormuskulatur von Idotea gemessen werden.

Nach einer Stimulation der noch im Tier befindlichen Extensorfasern von 90 sec mit 10^-6 M Proctolin veränderte sich die Menge der [³H]-markierten Inositolphosphate im Vergleich zur Kontrolle nicht signifikant (Abb. 17). Die Menge der [³H]-markierten Inositolphosphate reduzierte sich nach Proctolin-Stimulation um 3,8 % im Vergleich zum Kontrollwert (SD ±18,4

%, n=4). Wurden die Fasern herauspräpariert und im isolierten Zustand mit 10^-6 M Proctolin stimuliert, lag der durchschnittliche Wert der [³H]-markierten Inositolphosphate um 14,5 % niedriger als der durchschnittliche Kontrollwert (SD ±20,2 %, n=7). Auch diese Veränderung der radioaktiv markierten Inositolphosphate durch Proctolin war nicht signifikant.

Die Substanz NaF ist bekannt dafür, G-Proteine zu aktivieren und somit G-Protein gekoppelte Enzyme, wie die PLC, zu stimulieren (Goldman et al., 1995; Solon et al., 1996). Um zu untersuchen, ob NaF auch in der Extensormuskulatur von Idotea die PLC aktiviert und somit als Kontrollsubstanz der Messmethode verwendet werden kann, wurden isolierte Fasern für 90 sec mit 20 mM NaF stimuliert. Der Wert der [³H]-markierten Inositolphosphate war nach Stimulation mit NaF im Vergleich zum Kontrollwert um 15,4 % gesunken (SD ±38,4 %, n=4). Die

Veränderung war jedoch nicht signifikant. Nach diesem Ergebnis ließ sich in der Extensormuskulatur von Idotea keine Erhöhung der Inositolphosphate durch NaF beobachten.

Abb. 17 Effekt von Proctolin (10^-6 M) auf die Menge der Inositolphosphate in der Extensormuskulatur von Idotea nach einer Stimulation der Fasern für 90 sec. Die normalisierten Werte sind Durchschnittswerte aus 4 unabhängigen Experimenten.

Von der Mandibularmuskulatur der Wanderheuschrecke Locusta migratoria wurde beschrieben, dass 10^-9 M Proctolin in diesem Muskel den intrazellulären Spiegel an InsP3 um 32 % erhöht (Baines et al., 1990). Da dieser Insekten-Skelettmuskel der Extensormuskulatur von Idotea vergleichbar ist, sollte nach der gleichen Messmethode, mit der die Erhöhung des InsP3-Spiegels durch Proctolin in der Mandibularmuskulatur ermittelt wurde, untersucht werden, ob Proctolin in der Extensormuskulatur von Idotea doch die Menge an InsP3 erhöht. Hierzu wurden aus den Muskelfasern Membranen hergestellt, die nach radioaktiver Markierung mit dem Neuropeptid Proctolin stimuliert wurden. Ein erster Versuch mit Membranen aus Extensormuskelfasern von Idotea ergab nach einer Stimulation mit 10^-9 M Proctolin eine Erhöhung der Inositolphosphat-Menge um 5,8 %, nach einer Stimulation mit 10^-8 M Proctolin eine Erniedrigung der Inositolphosphat-Menge um 7,6 %, nach einer Stimulation mit 10^-7 M Proctolin eine Erhöhung der Inositolphosphat-Menge um 10,5 % und nach einer Stimulation mit 10^-6 M Proctolin eine Erhöhung der Inositolphosphat-Menge um 5,3 % im Vergleich zum Kontrollwert ohne Proctolin Stimulation (jeweils n=1). Die gemessenen Werte variieren untereinander und zeigen keine deutliche Erhöhung der Inositolphosphate nach Stimulation mit verschiedenen

Proctolin-Um zu testen, ob Proctolin wirklich keinen Effekt auf den Spiegel der Inositolphosphate der Extensormuskulatur von Idotea hat oder durch Messungenauigkeiten eine Erhöhung der Inositolphosphate nicht ermittelbar war, wurde die Methode an der Mandibularmuskulatur von Locusta migratoria überprüft. Nach Stimulation der Membranen der Mandibularmuskulatur mit 10^-8 M Proctolin für 90 sec erniedrigte sich der Wert der Inositolphosphate um 16,5 % (SD ±6,2

%, n=2) im Vergleich zum Kontrollwert ohne Proctolin-Stimulation (Abb. 18).

Abb. 18 Einfluß von Proctolin (10^-8 M, 10^-9 M) auf die Menge der Inositolphosphate in der Mandibularmuskulatur von Locusta migratoria nach einer Stimulation der Muskelmembranen für 90 sec.

Die normalisierten Werte sind Durchschnittswerte der Inositolphosphat-Werte aus 2 unbhängigen Experimenten.

Wurde mit 10^-9 M Proctolin stimuliert, reduzierte sich die Menge der Inositolphosphate um 3,7 % (SD ±19,4 %, n=2) im Vergleich zum Kontrollwert. Da die Messung der Gesamt-Inositolphosphate eine spezifische Erhöhung der InsP3-Menge überdecken kann, wurden in den anschließenden Experimenten die einzelnen, [³H]-markierten Inositolphosphate getrennt gemessen. Auch hier zeigte sich nach Stimulation der Mandibularmuskelmembranen mit verschiedenen Proctolin-Konzentrationen keine signifikante Veränderung der InsP3-Werte im Vergleich zur gemessenen InsP3-Menge von unstimulierten Muskelmembranen (Abb. 19). Auch nach Stimulation mit 10^-6 M 5-HT war keine signifikante Veränderung zu beobachten. Die prozentualen Werte der einzelnen Inositolphosphate nach unterschiedlicher Stimulation sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Abb. 19 Messung der einzelnen, aufgetrennten Inositolphosphate aus der Mandibularmuskulatur von Locusta migratoria nach einer Stimulation der Muskelmembranen für 90 sec mit Proctolin und 5-HT. Die durchschnittlichen Werte der Inositolphosphate sind normalisiert.

Bei den Versuchen mit der Mandibularmuskulatur konnte die von Baines et al. (1990) beschriebene Erhöhung des InsP3-Spiegels nach Proctolin-Stimulation nicht bestätigt werden. In keinem der Versuche mit der Extensormuskulatur von Idotea oder der Mandibularmuskulatur von Locusta konnte eine durch Proctolin induzierte, signifikante Veränderung der Inositolphosphat- bzw. InsP3-Menge festgestellt werden.

GlyceroPIns Ins1P Ins(1,4)P2 Ins(1,4,5)P3

Kontrolle (n=4) 100 % 100 % 100 % 100 %

Proc 10^-6 M (n=1) 102,4 % 101 % 95,2 % 99 %

Proc 10^-8 M (n=4) 97,7 % (±17,2) 103,9 % (±7,9) 114,1 % (±13,1) 105,6 % (±12,4) Proc 10^-9 M (n=1) 89,9 % 98 % 104,9 % 97,5 %

5-HT 10^-6 M (n=2) 96,7 % (±14,9) 100,4 % (±23,5) 107,6 % (±28,9) 86,1 % (±11,8)

Tabelle 2: Übersicht über die normierten Werte der einzelnen Inositolphosphate in der Mandibularmuskulatur von Locusta m. nach einer Stimulationszeit von 90 sec.

Zusammenfassung:

In den durchgeführten Experimenten veränderte das Neuropeptid Proctolin die Menge der Inositolphosphate in der Extensormuskulatur von Idotea nicht signifikant. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass Proctolin den InsP3-Spiegel dennoch erhöht, da durch keine Positivkontrolle gezeigt werden konnte, dass die Menge der Inositolphosphate signifikant verändert werden kann. Auch in der Mandibularmuskulatur von Locusta migratoria zeigte Proctolin keinen signifikanten Effekt auf die Menge der einzelnen Inositolphosphate.

3.2.4. Messung der ADPribosyl-Zyklase Aktivität

InsP3 ist nicht die einzige Substanz, die in Muskelfasern Ca²⁺ aus dem SR freisetzen kann. Das Nucleotid cADPribose und NAADP induzieren in verschiedenen Zellen nach Bindung an einen Rezeptor die Freigabe von Ca²⁺ aus intrazellulären Speichern (Guse, 1999; Lee, 2000). Die Synthese von cADPribose und NAADP erfolgt über das Enzym ADPribosyl-Zyklase, welches auch durch extrazelluläre Peptide reguliert werden kann (Higashida, 2000). Im Folgenden sollte untersucht werden, ob eine ADPribosyl-Zyklase in den Extensormuskelfasern von Idotea aktiv ist und die Aktivität des Enzyms durch das Neuropeptid Proctolin stimuliert werden kann.

Bei der Messung der ADPribosyl-Zyklase Aktivität macht man sich den Vorteil zunutze, dass das Enzym auch die Umwandlung von NGD⁺ zu cGDPribose katalysiert (Graeff et al., 1994). Da das

Produkt cGDPribose von sich aus fluoresziert, kann die enzymatische Umsetzung von NGD⁺ fluorimetrisch bei einer Emissionswellenlänge von 410 nm verfolgt werden.

Als Kontrolle wurde gereinigte ADPribosyl-Zyklase von Aplysia californica verwendet. Das ins Reaktionsmedium eingebrachte Enzym setzte stöchiometrisch NGD⁺ zu cGDPribose um, was durch einen Anstieg der Fluoreszenz bis auf einen Sättigungswert beobachtet werden konnte (Abb. 20). Dabei zeigte das Enzym eine Aktivität von 73,3 ± 25,1 (SD) µmol cGDPribose/min mg Protein.

Abb. 20 Messung der ADPribosyl-Zyklase Aktivität bei Aplysia californica. Die ADPribosyl-Zyklase wandelte stöchiometrisch NGD⁺ in das fluoreszierende Produkt cGDPribose um. Anregungswellenlänge:

300 nm, Emmissionswellenlänge: 410 nm.

Bestand das Reaktionsmedium aus einem Muskelhomogenat der Extensormuskulatur von Idotea, konnte nach Zugabe des Substrats NGD⁺ kein Anstieg der Fluoreszenz beobachtet werden (n=6;

Abb. 21). Untersucht wurden neben einem Gesamthomogenat der Extensormuskulatur von Idotea auch Membanpräparationen des gleichen Muskels. Auch hier ergab sich keine Veränderung der Fluoreszenz (n=3). Wurden aus der Literatur bekannte Stimulatoren der ADPribosyl-Zyklase wie z.B. GTP, cAMP, MgCl2 (Morita et al., 1997; Higashida et al., 1999) sowie auch das Neuropeptid Proctolin (10^-8 M-10^-6 M) ins Reaktionsmedium gegeben, konnte keine Aktivität des Enzyms im Muskelhomogenat von Idotea beobachtet weden (jeweils n=3). Um zu testen, ob im

Messungen mit Muskelhomogenaten von Idotea dem jeweiligen Reaktionsmedium Aplysia ADPribosyl-Zyklase beigegeben und die Aktivität dieses Enzyms gemessen. Das Aplysia Enzym zeigte in jedem eingesetzten Reaktionsmedium die erwartete Aktivität wie in Abb. 20.

Wie in der Extensormuskulatur von Idotea konnte auch in Extensormuskelhomogenaten von Procambarus clarkii nach Zugabe von NGD⁺ keine Erhöhung der Fluoreszenz gemessen werden (n=4).

Abb. 21 Messung der ADPribosyl-Zyklase Aktivität in einem Muskelhomogenat der Extensormuskulatur von Idotea. Im Muskelhomogenat von Idotea konnte keine Aktivität der ADPribosyl-Zyklase gemessen werden. Als Vergleich wurde die Veränderung der Fluoreszenz nach Aktivierung der Aplysia ADPribosyl-Zyklase durch NGD⁺ aufgetragen.

Zusammenfassung:

In Homogenaten der Extensormuskulatur von Idotea und Procambarus clarkii konnte keine Aktivität der ADPribosyl-Zyklase gemessen werden. Auch aus der Literatur bekannte Stimulatoren des Enzyms sowie das Neuropeptid Proctolin aktivierten die ADPribosyl-Zyklase in den untersuchten Crustaceen-Muskelhomogenaten nicht. Möglicherweise war das Enzym unter diesen Bedingungen nicht aktivierbar oder es wird in den Extensormuskelzellen von Idotea und Procambarus nicht exprimiert.