4.2. Intrazelluläre Signalwege der proctolinergen Modulation
4.2.4. Modell zur Wirkung von Proctolin auf die Extensormuskulatur von Idotea
Geht man von der Annahme aus, dass es in der Extensormuskulatur von Idotea einen oder mehrere Rezeptoren für Proctolin gibt, wird das Neuropeptid, nachdem es mit dem erregenden Transmitter Glutamat aus motorischen Endigungen der Nervenzellen ausgeschüttet wurde bzw.
über die Hämolymphe an die Muskelzellen gelangte, an Rezeptoren der postsynaptischen Membran binden. Die Bindung an einen Rezeptor kann intrazellulär eine Vielzahl von Effekten bewirken, die gemeinsam zu der Proctolin-induzierten Kontraktionsverstärkung der Extensormuskulatur beitragen können (siehe Abb. 25). Dabei wird durch die Wirkung von Proctolin nicht nur der Ca2+-Eintrom über spannungsabhängige L-Typ Ca2+ Kanäle erhöht, sondern auch der K+-Ausstrom durch das Schließen spannungsunabhängiger K+ Kanäle verringert (Erxleben et al, 1995; Rathmayer et al., 2002b). Proctolin induziert ebenfalls die Phosphorylierung eines 30 kDa Muskelproteins, bei welchem es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um das regulatorische Protein Troponin I (TnI) des dünnen Filaments handelt. Die Phosphorylierung von Troponin I könnte zu einer Erhöhung der Ca2+-Sensitivität der Actomyosin-ATPase führen und würde somit zur Verstärkung der Kontraktionskraft des Muskels beitragen. Auch die mit Proctolin durchgeführten Koffein-Kontrakturen weisen darauf hin, dass durch die Wirkung von Proctolin entweder die Ca2+-Sensitivität für die Kontraktion des Muskels erhöht wird oder Proctolin eine Zunahme der intrazellulären Ca2+-Konzentration induziert. Falls letzteres der Fall ist, wirkt das Peptid sehr wahrscheinlich nicht über die sekundären Botenstoffe cADPribose und NAADP auf eine Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern. Auch eine Erhöhung von
InsP3 durch Proctolin, was zu einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration beitragen würde, wurde im Idoteen-Muskel bisher nicht gemessen. In den Extensormuskelfasern von Idotea vermindert Proctolin jedoch die Konzentration des sekundären Botenstoffs cGMP. Die Proctolin-induzierte Verminderung der intrazellulären cGMP-Konzentration wird dabei durch eine PKC vermittelt und ist unabhängig von der Aktivität der Phosphodiesterasen (PDE). Die durch Proctolin aktivierte PKC hemmt dabei die Aktivität einer Guanylatzyklase (GC) in den Idoteen-Muskelfasern.
Abb. 25 Effekte von Proctolin auf die Extensormuskulatur von Idotea. Durch die Wirkung von Proctolin (Proc), das sehr wahrscheinlich an Rezeptoren der Zellmembran bindet, wird nicht nur der Ca2+-Einstrom über spannungsabhängige L-Typ Ca2+ Kanäle erhöht, sondern auch der K+-Ausstrom durch das Schließen spannungsunabhängiger K+ Kanäle verringert (Rathmayer et al., 2002b; hellrote Pfeile). Proctolin induziert ebenfalls die Phosphorylierung eines 30 kDa Proteins des dünnen Filaments, das mit großer Wahrscheinlichkeit ein Troponin I (TnI) ist. Weiterhin vermindert Proctolin über die Aktivierung einer Proteinkinase C (PKC) die intrazelluläre Konzentration von cGMP. Die Verminderung der cGMP-Konzentration wird durch eine PKC-vermittelte Hemmung einer Guanylatzyklase (GC) bewirkt. Somit kann weniger GTP zu cGMP umgesetzt werden. Die Proctolin-induzierte Verminderung der cGMP-Konzentration ist unabhängig von der Aktivität einer Phosphodiesterase (PDE). Die in der vorliegenden Arbeit erstmals untersuchten und beschriebenen Wirkungen des Proctolins auf die Muskulatur von Idotea,
Über welchen Weg das Neuropeptid Proctolin die PKC der Muskelfasern aktiviert, ist noch nicht geklärt (siehe Abb. 26). Würde die Aktivierung der PKC über die Erhöhung der PLC Aktivität hervorgerufen werden, sollte dabei auch InsP3 und DAG entstehen. Da aber keine Zunahme von InsP3 nach Stimulation mit Proctolin gemessen werden konnte, gibt es bisher keine Anhaltspunkte für eine Beteiligung der PLC.
Von der glatten Gefäßmuskulatur der Vertebraten ist bekannt, dass kontraktionsverstärkende Peptide, wie das Angiotensin II, über einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor eine Isoform der Phospholipase D (PLD) aktivieren, was zu einer Umsetzung von Phosphatidylcholin (PC) zu Phosphatidylsäure (PA) führt (Andresen et al., 2001). PA wird in den Muskelzellen schliesslich durch die Phosphatidylsäure-Phosphohydrolase zu DAG umgesetzt (Lassegue et al., 1993; Berry et al., 2001). DAG führt dann zu einer anhaltenden Aktivierung der PKC. Auf diesem PLD-vermittelten Weg entsteht somit kein InsP3, wie es nach der Aktivierung der PLC zu beobachten ist. Würde Proctolin in der Extensormuskulatur von Idotea, wie das Angiotensin II in der glatten Gefäßmuskulatur, über eine PLD wirken, wäre dadurch der nach Proctolin-Stimulation unveränderte Inositolphosphat- Spiegel zu erklären.
Proctolin zeigt noch weitere Ähnlichkeiten in der Wirkungsweise zu dem gefäßverengenden Octapeptid Angiotensin II. Wie Proctolin führt Angiotensin II zu einer verstärkten Muskelkontraktion (Berry et al., 2001), zu einer Erhöhung der Öffnungswahrscheinlichkeit von L-Typ Ca2+ Kanälen (Macrez-Lepretre et al., 1996), zu einer verstärkten Phosphorylierung von Troponin I an der Aminosäure Serin (Malhotra et al., 2001) und zu einer Verminderung der cGMP-Konzentration, die nicht durch die Aktivierung einer PDE bewirkt wird (Brechler et al., 1994). Angiotensin II aktiviert ebenfalls die PKC, die im Fall des Angiotensin II eine Guanylatzyklase hemmt. Somit wird die intrazelluläre cGMP-Konzentration, die durch die Wirkung eines gefäßerweiternden Peptids erhöht wurde, erniedrigt (Haneda et al., 1991). Die Wirkungsmechanismen des Angiotensin II in unterschiedlichen Zellen sind jedoch sehr komplex und hängen stark vom Vorhandensein unterschiedlicher Rezeptoren und Co-Faktoren ab. So aktiviert Angiotensin II nicht nur die PLD und die PKC, sondern neben weiteren Enzymen auch die PLC, die PKA und bestimmte Tyrosinkinasen (Berry et al., 2001).
Abb. 26 Modell zur Wirkung von Proctolin auf mögliche Signalkaskaden. Zur Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) kann Proctolin (Proc) einerseits über einen G-Protein (G) gekoppelten Rezeptor die Aktivität einer Phospholipase C (PLC) erhöhen, oder andererseits eine Phosholipase D (PLD) aktivieren.
Wird die PLC aktiviert, spaltet sie Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in Inositol-1,4,5,-trisphosphat (InsP3) und Diacylglycerin (DAG). DAG aktiviert die PKC, die ihrerseits auf Ionenkanäle, filamentöse Proteine wie das Troponin I und Enzyme wie die Guanylatzyklase wirkt. Wird über einen G-Protein (G) gekoppelten Rezeptor die PLD aktiviert, führt dies zur Umsetzung von Phosphatidylcholin (PC) zu Phosphatidylsäure (PA). PA wird schließlich zu DAG umgesetzt. DAG aktiviert wiederum die PKC, die u.a. auf Ionenkanäle, filamentöse Proteine und Enzyme wirkt.
Wie bereits gezeigt wurde, verwendet auch das Neuropeptid Proctolin verschiedene Mechanismen, um die Effizienz motoneuronaler Aktivität an deren Zielorgan, der Muskulatur, zu modulieren. Die zugrundeliegenden Mechanismen, sowohl auf prä- wie auch auf postsynaptischer Seite, sind bereits gut untersucht (Rathmayer et al., 2002a, 2002b). Die beteiligten Signalwege sind jedoch größtenteils unbekannt. Die vorliegende Arbeit trägt zum Verständnis dieser Signalwege bei und liefert für weiterführende Untersuchungen nicht nur Grundlagen, sondern legt die Existenz komplexer Signalwege für die Modulation der Muskelkontraktion durch Proctolin,
5. Zusammenfassung
In der Extensormuskulatur von Idotea verringert das Neuropeptid Proctolin die Zahl der funktionell aktiven K+ Kanäle und erhöht den spannungsabhängigen Ca2+-Einstrom über sarkolemmale Ca2+ Kanäle, was zu einer Erhöhung der Kontraktionskraft des Muskels führt (Erxleben et al., 1995, Erxleben & deSantis, 1998). Zusätzlich wird in dieser Muskulatur durch die Wirkung von Proctolin ein 30 kDa Protein verstärkt phosphoryliert (Brüstle et al., 2001).
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass in der Extensormuskulatur von Idotea ein Protein mit dem Molekulargewicht von 30 kDa mit dem dünnen Filament assoziiert ist. In präparierten Myosinfilamenten und unter den leichten Ketten des Myosins lässt sich kein Protein mit dem Molekulargewicht von 30 kDa nachweisen.
Das mit dem dünnen Filament assoziierte 30 kDa Protein bindet ein Antiserum gegen Hummer Troponin I3 und ist an der Aminosäure Serin phosphoryliert. Das Protein zeigt jedoch keine Immunreaktivität zu einem Antiserum, welches gegen das Protein Calponin aus den dünnen Filamenten von Vertebraten gerichtet ist.
Auch das dem Idotea 30 kDa Protein vergleichbare Troponin I3 immunreaktive 30 kDa Protein aus der Extensormuskulatur des Flußkrebses Procambarus clarkii ist an der Aminosäure Serin phosphoryliert.
Die isoelektrischen Punkte des Troponin I3 immunreaktiven 30 kDa Proteins aus dem Extensormuskel von Idotea liegen im basischen Bereich, wie auch die isoelektrischen Punkte von schon identifizierten Troponin I Isoformen aus verschiedenen anderen Muskeln.
Aufgrund dieser Ergebnisse wird das durch die Wirkung von Proctolin verstärkt phosphorylierte 30 kDa Protein als ein Troponin I angesehen. Die Phosphorylierung eines mit dem dünnen Filament assoziierten, vermutlich regulatorischen Proteins durch das Neuropeptid Proctolin stellt einen bisher unbekannten Modulationsweg für dieses Peptid dar.
Um zu untersuchen, welche intrazellulären Signalwege das Neuropeptid Proctolin in der Extensormuskulatur von Idotea induziert, wurden die Konzentrationen unterschiedlicher intrazellulärer Botenstoffe nach Proctolin-Stimulation einzelner individuell identifizierbarer Muskelfasern gemessen.
Die kontraktionsverstärkende Wirkung von Proctolin scheint in der Extensormuskulatur nicht an die Adenylatzyklase und die PKA gekoppelt zu sein, da durch Applikation von Proctolin die
cAMP-Konzentration der Muskelfasern unter verschiedenen Ausgangsbedingungen nicht verändert wird.
Dass durch Proctolin die intrazelluläre Ca2+-Konzentration ansteigt oder Proctolin die Ca2+ -Sensitivität intramuskulärer Proteine erhöht, zeigen die Ergebnisse der Potenzierung von Koffein-Kontrakturen in Gegenwart von Proctolin.
Eine Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern könnte durch eine Proctolin-induzierte Erhöhung der InsP3-Konzentration ausgelöst werden. Bei den hier vorgestellten Experimenten konnte jedoch in der Extensormuskulatur von Idotea, wie auch in der Mandibularmuskulatur von Locusta migratoria, keine Erhöhung in der Menge der Inositolphosphate wie des InsP3 nach Proctolin-Stimulation gemessen werden. Da aber keine Positivkontrolle vorhanden war, kann dies auch an der Messmethode liegen.
Weiterhin scheint Proctolin in der Extensormuskulatur von Idotea die intrazelluläre Ca2+ -Konzentration nicht über die sekundären Botenstoffe cADPribose und NAADP zu erhöhen, da zum einen in diesem Muskel keine Aktivität der ADPribosyl-Zyklase gemessen werden konnte und zum anderen durch Proctolin die Aktivität des Enzyms nicht induziert bzw. verstärkt wurde.
Eine signifikante Verminderung der intrazellulären cGMP-Konzentration wurde nach Proctolin-Stimulation in der Extensormuskulatur von Idotea gemessen. Diese Proctolin-induzierte Verminderung der cGMP-Konzentration wird in den Muskelzellen durch eine PKC vermittelt und ist unabhängig von einer Aktivierung der Phosphodiesterasen. Sehr wahrscheinlich hemmt die durch Proctolin aktivierte PKC indirekt die Aktivität einer Guanylatzyklase, was dazu führt, dass im Muskel weniger cGMP entsteht.
Auch die anderen Effekte des Proctolins auf die Extensormuskulatur von Idotea könnten durch die Aktivierung einer PKC vermittelt werden.
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