Immunpräzipitation mit dem Antiserum gegen Hummer TnI 3

Durch eine Immunpräzipitation des 30 kDa Proteins mithilfe des Antiserums gegen Hummer TnI3

sollte geklärt werden, ob das anti TnI3 immunreaktive 30 kDa Protein des dünnen Filaments tatsächlich mit dem phosphorylierten 30 kDa Protein des dünnen Filaments (siehe 3.1.2.2.) identisch ist und somit als mögliches Substrat für die durch Proctolin induzierte Phosphorylierung in Frage kommt.

3.1.3.1. Immunpräzipitation des 30 kDa Proteins aus der Extensormuskulatur von Idotea

Die Immunpräzipitation mit dem Antiserum gegen TnI3 wurde am Gesamtmuskelhomogenat der Extensorfaser von Idotea durchgeführt. Der Antiserum-Antigen-Komplex wurde nach der Präzipitation im einem SDS-Gel elektrophoretisch getrennt und mit Silbernitrat angefärbt (Abb.

6A). Als Kontrolle wurde eine Immunpräzipitation mit einem unspezifischen Kaninchen-Serum am Gesamtmuskelhomogenat von Idotea durchgeführt und das erhaltene Präzipitat, gebunden an das Antiserum, elektrophoretisch aufgetrennt. In beiden Spuren waren mehrere Proteinbanden sichtbar, jedoch zeigte sich in der Spur der TnI3 Immunpräzipitation eine spezifische Bande bei 30 kDa, die in der Kontroll-Spur nicht vorhanden war (Abb. 6A, Pfeil). Um zu überprüfen, welche der gefärbten Proteinbanden schwere und leichte Ketten der Antikörper beziehungsweise Bruchstücke dieser Antikörper-Ketten sind, wurde an den Immunpräzipitaten ein Westernblot mit einem Kaninchen IgG-Antikörper durchgeführt, der sämtliche Antikörper-Untereinheiten erkennt (Abb. 6B). Dabei erschienen bei beiden Spuren sehr starke Bindungssignale bei 55 kDa, was dem Molekulargewicht der schweren Ketten der IgG Antikörper entspricht (Harlow & Lane, 1999).

Bei 25 kDa befanden sich ebenfalls Bindungssignale. Hier erkannte der IgG-Antikörper die leichten Ketten der Antiseren. Weitere vom IgG-Antikörper gebundene Proteine deuteten auf Bruchstücke der Antikörper hin. Bei dem Molekulargewicht von 30 kDa war im Westernblot mit dem IgG-Antikörper kein Bindungssignal zu erkennen (Abb. 6B). Das im SDS-Gel angefärbte Protein bei 30 kDa (Abb. 6A, Pfeil) war somit keine Untereinheit eines Antikörpers, sondern das aus dem Idotea Muskelhomogenat spezifisch präzipitierte 30 kDa Antigen des TnI3 Antiserums.

Führte man am Immunpräzipitat einen Westernblot mit dem Antiserum gegen TnI3 durch, so erhielt man neben den gebundenen Antikörper-Untereinheiten (schwere Ketten, leichte Ketten, Bruchstücke) auch eine spezifische Bindung bei 30 kDa (Abb. 6C, IP TnI 1-Spur). Hier erkannte das TnI3 Antiserum das präzipitierte 30 kDa Antigen. Bei der IP TnI 2-Spur erkannte das TnI3

Antiserum jedoch kein 30 kDa Protein. Bei dieser Immunpräzipitation wurde das 30 kDa Protein nicht aus dem Muskelhomogenat von Idotea herauspräzipitiert.

Aufgrund der begrenzten Proteinmenge aus den Extensormuskelfasern von Idotea wurden die weiteren Immunpräzipitations-Versuche an der Extensormuskulatur aus der abdominalen Muskulatur des Flußkrebses Procambarus clarkii fortgeführt.

Abb. 6 Immunpräzipitation mit einem Antiserum gegen Hummer TnI3 an der Extensormuskulatur von Idotea (A) Elektrophoretische Auftrennung des Immunpräzipitats des TnI3 Antiserums (IP TnI) und eines Immunpräzipitats mit einem unspezifischen Kaninchen-Serum (IP Kontrolle). Das durch das TnI3

Antiserum präzipitierte 30 kDa Protein ist mit einem Pfeil gekennzeichnet (B) Westernblot mit einem Antikörper gegen Kaninchen IgG. Der Antikörper erkannte die schweren Ketten, die leichten Ketten und die Bruchstücke der Antiseren in den Präzipitaten. (C) Westernblot mit dem Antiserum gegen Hummer TnI3. Das Antiserum markierte im Muskel wie auch im TnI3 Präzipitat (IP TnI 1) ein 30 kDa Protein (Pfeil). Im Kontrollpräzipitat (mit Kaninchen-Serum, IP Kontrolle) wurde kein 30 kDa Protein erkannt. Auch im TnI3

Präzipitat war das 30 kDa Protein nicht immer vorhanden (IP TnI 2). Die übrigen Banden sind durch den sekundären Antikörper markierte Antiserum Ketten und Bruchstücke. Molekulargewichtsmarker (in kDa) sind durch Pfeilspitzen gekennzeichnet.

3.1.3.2. Immunpräzipitation des 30 kDa Proteins aus der Extensormuskulatur von Procambarus In ihrer Diplomarbeit konnte Nicole Brenscheidt zeigen, dass das Neuropeptid Proctolin auch in der superfiziellen Extensormuskulatur des Abdominalmuskels von Procambarus clarkii ein 30 kDa Protein verstärkt phosphoryliert (Brenscheidt, 2001). Da auch das Antiserum gegen Hummer TnI3 in diesem Muskel ein 30 kDa Protein spezifisch erkannte (Abb. 5B), handelte es sich hierbei mit hoher Wahrscheinlichkeit um das gleiche Protein, das das TnI3 Antiserum in der

Extensormuskulatur von Idotea spezifisch bindet. Auch deshalb wurden die Immunpräzipitations-Versuche mit dem Flußkrebs-Muskel weitergeführt.

Wie unter 3.1.3.1. beschrieben, wurde am Gesamtmuskelhomogenat des dorsalen, superfiziellen Extensormuskels eine Immunpräzipitation mit dem Antiserum gegen TnI3 und eine weitere Immunpräzipitation mit einem unspezifischen Kaninchen-Antiserum als Kontrolle durchgeführt.

Um vorerst feststellen zu können, welche Proteinbanden der Immunpräzipitate Antikörper-Untereinheiten zugeordnet werden können, wurde ein Westernblot mit einem Antikörper gegen Kaninchen IgG-Untereinheiten durchgeführt (Abb. 7A). Auch hier befanden sich die stärksten Bindungssignale bei den schweren Ketten der Antikörper bei 55 kDa und den leichten Ketten bei 25 kDa. Bei 30 kDa fand bei keiner der beiden Präzipitate eine spezifische Bindung des IgG Antikörpers statt, wodurch ausgeschlossen werden konnte, dass sich in diesem Bereich eine Antikörper-Untereinheit befand. Nach einem Westernblot mit dem Antiserum gegen TnI3 zeigte sich am elektrophoretisch aufgetrennten TnI3 Immunpräzipitat, wie auch im Muskelhomogenat, bei 30 kDa ein deutliches Bindungssignal (Abb. 7B, Pfeil). Im Kontroll-Präzipitat erkannte das TnI3 Antiserum wie erwartet kein 30 kDa Protein (Abb. 7B). Folglich präzipitierte das TnI3

Antiserum auch aus der dorsalen, superfiziellen Extensormuskulatur von Procambarus clarkii spezifisch ein 30 kDa Protein.

Um feststellen zu können, ob dieses präzipitierte 30 kDa Protein phosphoryliertes Serin enthält, wurde ein Westernblot mit einem monoklonalen Antikörper gegen phosphoryliertes Serin durchgeführt. Dieser Antikörper wurde auch eingesetzt, um zu zeigen, dass Proctolin die Phosphorylierung eines 30 kDa Proteins aus der Extensormuskulatur von Idotea und Procambarus induziert (Brüstle et al., 2001; Brenscheidt, 2001). Im aufgetrennten TnI3

Immunpräzipitat war bei 30 kDa ein deutliches Bindungssignal des anti P-Serin Antikörpers sichtbar (Abb. 7C, Pfeil). Dies zeigt, dass das durch das TnI3 Antiserum präzipitierte 30 kDa Protein an der Aminosäure Serin phosphoryliert war. Im Kontroll-Präzipitat befand sich bei 30 kDa kein Bindungssignal des Antikörpers gegen phosphoryliertes Serin. Zwei weitere Banden bei 59 und 66 kDa waren in der Spur des TnI3 Immunpräzipitats (IP TnI) sichtbar. Da die 66 kDa Bande auch im Kontroll-Präzipitat vorhanden war, handelte es sich hierbei, wie auch bei der 59 kDa Bande, möglicherweise um eine unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers an Fragmente der Antikörper des präzipitierenden Antiserums.

Abb. 7 Immunpräzipitation mit einem Antiserum gegen Hummer TnI3 an der dorsalen, superfiziellen Extensormuskulatur von Procambarus clarkii (A) Westernblot mit einem Antikörper gegen Kaninchen IgG. Der Antikörper erkannte die schweren Ketten, die leichten Ketten und die Bruchstücke der Antiseren in den Präzipitaten. (B) Westernblot mit dem Antiserum gegen Hummer TnI3. Das Antiserum markierte im TnI3 Präzipitat (IP TnI) wie auch im Muskel ein 30 kDa Protein (Pfeil). Im Kontrollpräzipitat (mit Kaninchen-Serum, IP Kontrolle) wurde kein 30 kDa markiert. (C) Westernblot mit einem Antikörper gegen phosphoryliertes Serin. Im TnI3 Präzipitat band der Antikörper ein Protein bei 30 kDa (Pfeil). Dieses TnI3

immunreaktive Protein war somit an der Aminosäure Serin phosphoryliert. Im Kontroll-Präzipitat wurde kein 30 kDa Protein von dem anti P-Serin Antikörper erkannt. Molekulargewichtsmarker (in kDa) sind durch Pfeilspitzen gekennzeichnet.

3.1.4. Auftrennung der Muskelproteine aus der Extensormuskulatur von Idotea in der 2-D