Messung der Inositolphosphate

Die Messung der Inositolphosphate nach Stimulation der Idoteen Muskeln mit Neuromodulatoren wurde in Anlehnung an die Inositolphosphat-Messungen an der Heuschrecken-Mandibularmuskulatur von Baines et al. (1990) durchgeführt. Dabei wurde [³H] markiertes Myo-Inositol in die Membranen der Muskelzellen eingebaut, um nach Stimulation der Zellen den Umsatz des radioktiv markierten Myo-Inositols zu den entsprechenden, dann auch radioaktiv markierten Inositolphosphaten messen zu können. Stimuliert wurden zum einen intakte Muskelfasern, in situ oder schon aus dem Tier herauspräpariert, zum anderen Membranen, die aus den entsprechenden Muskeln hergestellt wurden.

Stimulation intakter Muskelfasern

Zur Stimulation intakter Muskelfasern im Tier wurden die dorsalen Extensormuskelfasern von Idotea, wie unter 2.5.1.1. beschrieben, freigelegt, ohne sofort aus dem Tier isoliert zu werden.

Das Präparat wurde dann in 1 ml ASW überführt und 3 µCi [³H]-Myo-Inositol (spezifische Aktivität 10-20 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech) wurden dazugegeben. Die Muskeln wurden bei RT für 90 min unter leichtem Schütteln inkubiert, um zu gewährleisten, dass sich das radioaktiv markierte Myo-Inositol in die Membranen der Muskelfasern einbaut. Anschließend wurde das Präparat zur Stimulation der Muskelfasern in ASW mit der entsprechenden Proctolin-Konzentration (10^-6 M) überführt. Nach einer Stimulation für 90 sec bei RT wurde das Präparat zum Beenden der Stimulation in ein Gemisch aus 50 % ASW (eisgekühlt) und 50 % Stopp-Lösung (eisgekühlt) überführt. Die Extensormuskelfasern wurden sogleich herauspräpariert und bis zur Weiterverarbeitung in 50 % ASW + 50 % Stopp-Lösung bei -20°C aufbewahrt.

Um eine Präparation der Muskelfasern nach der radioaktiven Markierung zu vermeiden, wurden die dorsalen Extensormuskelfasern (Nr. 5) von Idotea wie unter 2.5.1.1. beschrieben, direkt aus dem Tier herauspräpariert. Jeweils 8 isolierte, jedoch noch intakte Fasern aus einem Tier wurden in ein Eppendorfgefäß mit 300 µl ASW überführt. Dazu wurde je 3 µCi [³H]-Myo-Inositol (spezifische Aktivität 10-20 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech) dazugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 90 min bei RT und unter leichtem Schütteln wurden die Fasern 2 mal mit 1 ml ASW gewaschen, wobei die Fasern nach jedem Waschschritt mit 2000 g kurz abzentrifugiert wurden, um das überschüssige [³H]-Myo-Inositol zu entfernen. Die Fasern wurden dann in 300 µl ASW, welches den Neuromodulator Proctolin (10^-6 M) oder den G-Protein Aktivator NaF (20 mM) enthielt, überführt und für 90 sec bei RT stimuliert. Zum Stoppen der Stimulation wurde

300 µl eisgekühlte Stopp-Lösung dazugegeben und die Proben bis zur Weiterverarbeitung bei -20°C aufbewahrt.

Stimulation der Muskelmembranen

Die Extensormuskelfasern (Nr. 5) von Idotea wurden, wie unter 2.5.1.1. beschrieben, aus dem Tier herauspräpariert. Anschließend wurden 40 Muskelfasern in 3 ml Puffer A überführt und für 15 min auf Eis mit einem Glas-Handhomogenisator homogenisiert. Das Homogenat wurde für 20 min bei 20 000 g und 4°C zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 3 ml Puffer A (ohne EDTA) gelöst. Nach einer nochmaligen Zentrifugation von 20 min bei 20 000 g und 4°C, wurde der Überstand wieder verworfen und das Pellet in 2,5 ml Puffer B gelöst. Zu dieser Membranpräparation wurden 20 µCi [³H]-Myo-Inositol (spezifische Aktivität 10-20 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech) hinzugegeben und die Lösung wurde auf einem Schüttler bei RT für 90 min inkubiert. Anschließend wurden jeweils Aliquote von 350 µl abgenommen und mit 50 µl der Stimulationslösung (Puffer B + jeweilige Konzentration des Neuromodulators) versetzt. Der Neuromodulator Proctolin lag in der Stimulationslösung in einer entsprechenden Stamm-Konzentration vor, um die gewünschte Endkonzentration des Modulators (10^-6-10^-9 M) während der Stimulation zu erreichen. Die Kontrollen wurden in gleicher Weise ohne die Neuromodulatoren durchgeführt. Nach einer Stimulationszeit von 90 sec bei RT wurde die Reaktion durch die Zugabe von 400 µl eisgekühlter Stopp-Lösung gestoppt. Die Proben wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei -20°C aufbewahrt.

Als Kontrolle wurden auch Membranen der Mandibularmuskulatur von Locusta migratoria mit Proctolin (10^-6, 10^-8, 10^-9 M) und 10^-6 M 5-HT stimuliert, um anschließend die radioaktiv markierten Inositolphosphate messen zu können. Von der Mandibularmuskulatur wurde beschrieben, dass Proctolin den intrazellulären Spiegel von InsP3 um maximal 32 % erhöht (Baines et al., 1990).

Die Mandibularmuskulatur wurde nach dem Herunterkühlen und Decapitieren der Heuschrecke in einer Locusta-Blutersatzlösung (siehe 2.2.) entfernt, sogleich in 3 ml Puffer A überführt und für 15 min auf Eis mit einem Glas-Handhomogenisator homogenisiert. Die restlichen Schritte zur Herstellung der Membranen und der Stimulation wurden wie oben, für die Extensormuskulatur von Idotea beschrieben, durchgeführt. Diese Vorgehensweise entspricht der Methode, die von Baines et al. (1990) beschrieben wurde.

Durchführung der Messung

Die Isolierung der radioaktiv markierten Inositolphosphate über Anionen-Austausch-Säulen wurde direkt anschließend an die Stimulation der Muskeln durchgeführt, da sich nach einigen Experimenten herausstellte, dass das Lagern der Proben bei -20°C und über Nacht zum Verlust von Inositolphosphaten führte. Alle Proben wurden kurz bei 20 000 g zentrifugiert und 600 µl des Überstands wurden abgenommen. Der Überstand wurde jeweils mit der entsprechenden Menge an Neutralisierungslösung versetzt, um die Proben auf einen pH-Wert von 7 oder höher zu bringen.

Nach der Neutralisierung der Proben wurden die Säulen vorbereitet. Die Säulen wurden mit 2 ml Säulenmaterial beladen, welches zuvor aus 10 ml Dowex-1 (X8, Chlorid-Form, 100-200 Maschen) und 10 ml H2Otridest hergestellt wurde. Nachdem sich das Säulenmaterial in der Säule abgesetzt hatte (Endvolumen 1 ml), wurden die Säulen erst mit 10 ml 1 M HCl, dann 2 mal mit je 10 ml H2Otridest gewaschen. Nun wurden die neutralisierten Proben jeweils über eine Säule gegeben, um die Inositolphosphate an das Säulenmaterial zu binden. Anschließend wurden die Säulen 2 mal mit je 10 ml H2Otridest gewaschen, um ungebundenes Inositol zu entfernen. Die gebundenen Inositolphosphate wurden mit je 3,5 ml 1 M HCl von den Säulen abgelöst und jeweils in speziellen Szintillationsgefäßen aufgefangen. Um die an die Inositolphosphate gebundene Radioaktivität bzw. die β-Strahlung des [³H] mit einem Szintillationszähler messen zu können, wurden je Probe 18 ml der Szintillationsflüssigkeit in die Gefäße gegeben. Die erhaltene Lichtemission wurde in dpm (disintegrations per minute) aufgezeichnet.

Da nicht ausgeschlossen werden konnte, dass Proctolin nur einen Effekt auf die Konzentration eines einzelnen Inositolphosphats hat und dieser Effekt in der gesamten Menge aller Inositolphosphate nicht nachzuweisen ist, wurden die Phosphate nacheinader von der Säule abgelöst und getrennt gemessen.

Dazu musste das Säulenmaterial, das in der Chlorid-Form vorlag, in die Formiat-Form überführt werden. 2 ml des Chlorid-Dowex-1 Säulenmaterials wurde, wie zuvor beschrieben, in die Säule eingefüllt und anschließend wurde mit 10 ml H2Otridest gewaschen. Es wurden nacheinander 2 ml 1 M NaOH, 4 ml H2Otridest, 4 ml 1 M Ameisensäure, 4 ml H2Otridest und 10 ml H2Otridest über die Säule gegeben. Um ein erfolgreiches Umpuffern des Säulenmaterials gewährleisten zu können, sollte nach Zugabe der Ameisensäure auf die Säule der pH der Säure anschließend kleiner als pH 2 sein. Die Inositolphosphate wurden wie bei Baines et al. (1990) nach einer Methode von Berridge et al. (1983) einzeln aus der Säule eluiert. Zuvor wurde, wie auch oben beschrieben, ungebundenes Inositol durch zweimalige Zugabe von 10 ml H2Otridest entfernt. Anschließend

wurden je 5 ml der folgenden Lösungen über die Säule gegeben: (1) 5 mM di-Na-Tetraborat/60 mM Na-Formiat, (2) 0,2 M Formiat/0.1 M Ameisensäure, (3) 0,4 M Ammonium-Formiat/0,1 M Ameisensäure, und (4) 1 M Ammonium-Ammonium-Formiat/0,1 M Ameisensäure. Dabei wurden folgende Komponeneten eluiert: (1) Glyceroinositolphosphat, (2) InsP, (3) InsP2 und (4) InsP3. Diese wurden getrennt in Szintillationsgefäßen aufgefangen, mit 18 ml Szintillationsflüssigkeit versetzt und die Radioaktivität (in dpm) mit einem Szintillationszähler gemessen.

Da die gemessenen Werte (in dpm) von Versuchsansatz zu Versuchsansatz unterschiedlich waren, wurden nur Proben eines Versuchsansatzes (d.h. eine Messung an einem Tag mit verschiedenen Proben) untereinander verglichen. Die Abweichungen von der Kontrolle (ohne Stimulation) wurden in Prozent angegeben. Bei jedem Versuchsansatz wurde je Probe die gleiche Menge an etwa gleich großen Muskelfasern bzw. die gleiche Menge an Muskelhomogenat eingesetzt, da aufgrund der radioaktiven Markierung anschließend eine Proteinbestimmung nicht möglich war.

So war die Vergleichbarkeit der Ergebnisse je Versuchsansatz gewährleistet.

Lösungen

Stopp-Lösung: 15 ml 1 M HCl

125 ml Methanol

Puffer A: 10 mM Tris-HCl pH 7,0

1 mM DTT 1 mM EDTA

Puffer B: 0,1 mM Tris-HCl pH 7,6

12 mM MgCl2

0,2 mM ATP 1 µM GTP-γ-S 1 mM Pefabloc

Neutralisierungslösung: 110 ml 25 mM Tris-HCl pH 7,0 15 ml 0,5 M NaOH