Kultivierung

Campylobacter spp. gelten als empfindliche Bakterien, da sie hohe Anforderungen an die Wachstumsbedingungen stellen (PARK 2002). In der Tat gelang die Kultivierung aus Stuhlproben erst in den 1970er Jahren mit der Entwicklung von Spezialnährböden auf Blutbasis (SKIRROW 1977). Davor wurden Kultivierungs-versuche auf nicht selektiven Nährböden unter Zuhilfenahme der Membranfiltration angewandt (DEKEYSER et al. 1972, BUTZLER et al. 1973). Die Nährböden zur Isolierung von Campylobacter enthalten neben einer Nähragarbasis einen Zusatz von Blut (SKIRROW 1977, BOLTON u. ROBERTSON 1982) oder Kohle (KARMALI et al. 1986). Diese Zusätze sollen die Wirkung toxischer Sauerstoffverbindungen abschwächen, auf die Campylobacter sehr empfindlich reagieren. Die Entwicklung

der Nährböden und Anreicherungsmedien für die Kultivierung von Campylobacter geschah gegenüber den frühen Medien der 70er Jahre mit Veränderungen in der Rezeptur und Supplementzusammensetzung, um die Wiederfindungsrate zu erhöhen und die Begleitflora zu unterdrücken. Die unterschiedlichen Medien wurden in verschiedenen Studien auf ihre Eignung hinsichtlich dieser Eigenschaften untersucht (BEUCHAT 1985, CORRY et al. 1995, BAYLIS et al. 2000).

Der direkte Ausstrich auf feste Nährmedien eignet sich am besten für Untersu-chungsmaterial, in dem mit hohen Konzentrationen von Campylobacter gerechnet werden kann. Sind jedoch geringere Keimzahlen zu erwarten oder ist davon auszugehen, dass die Bakterien unterschiedlichen Formen von „Stress“ wie Aus-trocknung, Hitze- oder Kälteeinwirkungen ausgesetzt waren, so ist ein vorge-schalteter Anreicherungsschritt erforderlich. Dies ist besonders bei Umgebungs- oder Lebensmittelproben zu erwarten. Aber auch wenn eine hohe Begleitflora vorhanden ist, kann eine Anreicherung erforderlich sein (HUMPHREY 1986, LOEWENHERZ 1995, WAAGE et al. 1999).

Untersuchungen mit dem Vergleich verschiedener Nährböden zur Campylobacter-Isolierung durch GUN-MUNRO et al. (1987) ergaben eine höhere Campylobacter-Isolierungsrate von Campylobacter mit gleichzeitiger Unterdrückung der fäkalen Begleitflora bei den mCCDA- und Karmalinährböden. Sie scheinen demnach für die Isolierung von Campylobacter besonders geeignet.

Campylobacter spp. wachsen am besten in einer sauerstoffreduzierten Atmosphäre mit CO2-Anreicherung (5 % O2, 10 % CO2, 85 % N2) (BOLTON u. COATES 1983, DOYLE 1984, THOMPSON et al. 1990, CORRY et al. 1995). Unter Zusatz bestimmter Substrate war es auch möglich, ein aerobes oder anaerobes Wachstum von C. jejuni zu erreichen (JONES et al. 1993). Die Vermehrungstemperaturen liegen im Bereich von 30 bis 45 °C, das Wachstumsoptimum der so genannten thermo-philen Campylobacter wird mit 42 °C angegeben (SKIRROW u. BENJAMIN 1980a, SMIBERT 1984, SKIRROW 1994). Von DOYLE u. ROMAN (1981) wurde das Wachstum von C. jejuni bei Temperaturen zwischen 35,5 und 45 °C bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 im mikroaeroben Millieu beschrieben. Campylobacter sind

nicht in der Lage, Kohlenhydrate zu fermentieren oder zu oxidieren und werden daher als chemoorganotroph bezeichnet (HENSYL 1994).

Die zur Kultivierung von Campylobacter eingesetzten festen und flüssigen Nähr-medien haben eine Nährbasis, die aus unterschiedlichen Anteilen und Herkünften von Peptonen und Salzen besteht. Der Zusatz von Blut, Kohle oder FBP (Ferrum-II-Phosphat) dient der Abschwächung der Wirkung von Superoxiden und toxischen Sauerstoffverbindungen. Durch den gezielten Zusatz von Supplementen, vornehm-lich in Form von Antibiotika, wird versucht, die Ausprägung und Ausbildung der Gram-positiven und Gram-negativen Begleitflora zu reduzieren, welche ebenfalls in den zu untersuchenden Proben vorhanden ist.

Bei der Isolierung von Campylobacter ist jedoch zu berücksichtigen, dass einige Spezies empfindlich auf die Zusammensetzung und Konzentration der Supplemente reagieren oder diese einen negativen Einfluss auf das Wachstum der zu isolierenden Campylobacter ausüben können. GOOSSENS et al. (1990) zeigten, dass Isolate von C. upsaliensis auf den gängigen Isolierungsmedien für Campylobacter nicht wuchsen, da sie empfindlich gegenüber den zugesetzten Antibiotika wie Cefo-perazon und Vancomycin waren.

Zur Generierung der benötigten mikroaeroben Atmosphäre bieten sich verschiedene Systeme an. Im Laborgebrauch können Gefäße zur Flutung mit voreingestellten Gasgemischen und Katalysatorsystemen genommen werden (BUCK et al. 1982, BOLTON et al. 1997).

2.3.3.1 Standard-Methoden – ISO 10272

Eine Vereinheitlichung der Untersuchung auf Campylobacter ist durch die Methoden nach ISO gegeben. Die Methode ISO 10272 beschreibt die Bearbeitung und Isolierung von thermophilen Campylobacter spp. aus Lebensmitteln und tierischen Futtermitteln. Diese Methode wird regelmäßig von einem Fachgremium überprüft und aktualisiert und stellt den aktuellen Stand der Forschung und Wissenschaft dar. In der Version von 1995 (ISO) wurde die Anreicherung von Lebensmittelproben für 18 h

± 2 h bei 42 °C ± 0,5 °C in Preston-Bouillon empfohlen, wenn nicht erwartet wird,

dass die zu isolierenden Campylobacter spp. widrigen Bedingungen ausgesetzt waren. Im Fall von Vorschädigungen durch ungünstige Umwelteinflüsse sollte die Park-Sanders-Bouillon mit einer Vorbebrütung für 4 h bei 32 °C ± 0,5 °C ohne antimikrobielle Zusätze benutzt werden. Erst dann folgte die Bebrütung in der Bouillon mit allen Zusätzen bei höheren Temperaturen (2 h / 37 °C ± 0,5 °C, 40 - 42 h ± 2 h / 42 °C ± 0,5 °C). Für die Kultivierung auf Platten wurden das Karmalimedium und ein anderer fester Nährboden mit Bebrütung bei 42 °C ± 0,5 °C bis zu 5 Tagen empfohlen. Die Draft-Version ISO/CD-10272-1 (qualitativer Nachweis, ISO 2002a) und ISO/CD-10272-2 (Quantifizierung, ISO 2002b) empfiehlt die Anreicherung in Bolton-Bouillon (4 h / 37 °C ± 0,5 °C, 42 - 44 h ± 2 h / 41,5 °C

± 0,5 °C) oder Preston-Bouillon (24 - 48 h ± 2 h / 41,5 °C ± 0,5 °C) in einer mikro-aeroben Atmosphäre. Der Ausstrich der Anreicherungen erfolgt auf mCCD-Agar und einem zweiten Selektivmedium nach Wahl (qualitativer Nachweis) mit Inkubation für 48 h ± 2 h / 41,5 °C ± 0,5 °C.

Eine spätere Draft-Version (ISO 2004) empfiehlt die Anreicherung in Bolton-Bouillon (4 h ± 2 h / 37 °C ± 0,5 °C, 42 - 44 h ± 2 h / 41,5 °C ± 0,5 °C) mit anschließendem Kulturausstrich auf mCCD-Agar und einem zweiten Medium nach Wahl. Eine vereinfachte Darstellung ist in Abbildung 1 gegeben.

Für die Quantifizierung von Campylobacter wird auf den Anreicherungsschritt in einer Selektiv-Bouillon verzichtet. Stattdessen wird die Probe in einer Verdünnungslösung gespült und eine dezimale Verdünnungsreihe hergestellt. 0,1 ml einer jeden Verdün-nungsstufe werden dann im Oberflächenspatelverfahren auf feste Selektiv-nährmedien im Doppelansatz ausgestrichen. Nach einer Inkubationszeit von 48 h ± 2 h bei 41,5 °C ± 0,5 °C werden die Platten auf verdächtige Kolonien untersucht und dann bestätigt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Campylobacter-Nachweises nach der ISO-Methode.