Aus dem Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Einfluss nematophager Pilze auf das Nematoden- Infektionsrisiko bei Schafen und Ziegen
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Christine Rita Holst aus Hamburg
Hannover 2005
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Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. T. Schnieder
1. Gutachter: Prof. Dr. T. Schnieder 2. Gutachter: Prof. Dr. M. Ganter
Tag der mündlichen Prüfung: 23.05.2005
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Meinen Eltern in Erinnerung
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Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt:
Christine Holst, Regine Koopmann, Michael Larsen, Thomas Schnieder, Georg von Samson-Himmelstjerna, Christian Epe (2003):
„Einfluss nematophager Pilze auf den Trichostongyliden-Infektionsdruck für weidende Milchschafe und –ziegen.“
Tagung der deutschen veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V. (DVG), Leipzig, 20./21. 03.2003
Christian Epe (2003):
„Parasites problems on organic sheep/goat-farms in Germany.“
W.A.A.V.P., New Orleans, 10.-14. 08.2003
Regine Koopmann und Christine Holst (2003):
„Die „FAMACHA® Eye-Colour-Chart“ in einer Feldstudie mit Schafen und Ziegen in Norddeutschland.“
Tagung der deutschen veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V. (DVG), Grub bei München, 24./25. 06.2003
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ... 7
1. Einleitung...13
2. Literaturübersicht...15
2.1. Infektion mit Nematoden ...15
2.1.1. Trichostrongylidae ...15
2.1.1.1. Erreger ...15
2.1.1.2. Vorkommen...16
2.1.1.3. Lebenszyklus ...16
2.1.1.4. Epidemiologie ...17
2.1.1.5. Pathogenese und Klinik ...19
2.1.1.6. Diagnose...21
2.1.1.6.1. Klassische Diagnostik ...21
2.1.1.6.2. Molekularbiologische Diagnostik...23
2.1.1.7. Bekämpfung...26
2.1.1.7.1. Weidemanagement ...26
2.1.1.7.2. Anthelminthika ...27
2.1.1.7.2.1. Resistenzproblematik ...29
2.1.1.7.3. Impfungen...30
2.1.1.7.4. Biologische Kontrolle ...31
2.1.2. Strongyloididae ...32
2.1.3. Trichuridae ...33
2.1.4. Chabertidae...34
2.1.5. Dictyocaulidae und Protostrongylidae ...35
2.1.5.1. Erreger ...35
2.1.5.2. Vorkommen...35
2.1.5.3. Epidemiologie ...36
2.1.5.4. Pathogenese und Klinik ...37
2.1.5.5. Diagnose...38
2.1.5.6. Bekämpfung...38
2.2. Nematophage Pilze...39
2.2.1. Vorkommen und Morphologie ...39
2.2.2. Geschichte ...41
___________________________________________________________________
2.2.3. Wirkungsweise ...41
2.2.4. Gewinnung...42
2.2.5. in-vitro-Untersuchungen mit Duddingtonia flagrans...43
2.2.6. Andere nematophage Pilze...45
2.2.7. Einsatz bei kleinen Wiederkäuern ...46
2.2.8. Einsatz bei anderen Haussäugetieren ...47
2.3. Isolation von DNA aus Grasauswaschproben zum Einsatz in der Real-time- PCR 49 3. Material und Methoden...54
3.1. Material ...54
3.1.1. Versuchsaufbau ...54
3.1.2. Versuchstiere ...55
3.1.3. Versuchsweiden...56
3.1.4. Duddingtonia flagrans...57
3.1.5. Material für koproskopische Untersuchungen ...57
3.1.5.1. Mehrwegmaterial für koprokopische Methoden ...57
3.1.5.2. Einwegmaterial für koprokopische Methoden ...58
3.1.5.3. Lösungen für koproskopische Methoden ...59
3.1.5.4. Geräte für koproskopische Methoden ...59
3.1.6. Material für molekularbiologische Untersuchungen...59
3.1.6.1. Mehrwegartikel für molekularbiologische Untersuchungen...59
3.1.6.2. Einwegartikel für molekularbiologische Untersuchungen...60
3.1.6.3. Chemikalien für molekularbiologische Untersuchungen...60
3.1.6.4. Enzyme für molekularbiologische Untersuchungen ...60
3.1.6.5. DNA, Primer, Sonden ...60
DNA...60
Trichostrongylus ...61
Sonden ...61
Haemonchus...61
5´- FAM-TGG CGA CGA TGT TC- MGB –3´ ...61
3.1.6.6. Kits...62
3.1.6.7. Geräte...62
3.2. Methoden ...63
3.2.1. Probengewinnung ...63
________________________________________
3.2.1.1. Kotproben ...63
3.2.1.2. FAMACHA®-Wert...63
3.2.1.3. Gewicht ...64
3.2.1.4. Weidegrasproben...64
3.2.1.5. Blutproben...64
3.2.2. Koproskopische Methoden...64
3.2.2.1. Eizahl pro g Kot...64
3.2.2.2. Auswanderverfahren...65
3.2.2.3. Quantitative Larvenkultur ...65
3.2.2.4. Qualitative Larvenkultur ...66
3.2.2.5. Gewinnung 3. Larven von Magen-Darm-Strongyliden aus Weidegrasproben...67
3.2.3. Blutuntersuchungen ...68
3.2.3.1. Serumpepsinogenbestimmung ...68
3.2.3.2. Hämatokritbestimmung ...69
3.2.4. Gewinnung und Identifizierung von adulten Magen-Darm-Strongyliden der Tracer...69
3.2.4. Gewinnung genomischer DNA aus L3...70
3.2.4.1. Einstellung der Larvenkonzentration...70
3.2.5.2. Entscheidung der Larven ...71
3.2.5.3. Herstellung einer Larvenverdünnung ...72
3.2.5.4. Extraktion der DNA ...72
3.2.6. Gewinnung genomischer DNA aus Weidegrasproben ...74
3.2.6.1. Gewinnung von Grasproben mit oder ohne definierten Larvengattungen...74
3.2.6.2. Entscheidung der infektiösen Larven in der Grasprobe ...75
3.2.6.3. Extraktion der DNA aus den Grasauswaschproben...75
3.2.7. Real-time PCR der Larvenproben ...76
3.2.8. Real-time PCR der Grasauswaschproben ...78
3.2.9. Statistische Auswertung...79
4. Ergebnisse ...80
4.1. Allgemeines...80
4.2. Klassische Methoden ...83
4.2.1. Körpergewichte ...83
___________________________________________________________________
Schafe...83
4.2.2. Famacha®-Werte...86
Schafe...86
4.2.3. Kotproben ...88
4.2.3.1. EpG...88
Magen-Darm-Strongyliden...88
Schafe...88
Nematodirus...93
Schafe ...93
Ziegen...95
Strongyloides papillosus...96
4.2.3.2. Auswanderverfahren...101
4.2.3.3. quantitative Larvenkultur ...101
4.2.3.4. Larvenkultur qualitativ ...103
Schafe...103
Ziegen...104
4.2.4. Grasauswaschproben ...105
4.2.5. Blutproben...107
4.2.5.1. Hämatokrit...107
4.2.5.2. Serumpepsinogenwerte ...109
4.2.6. Tracer...111
4.2.6.1. Tracer 1 vom 01.08.02-10.09.02...111
4.2.6.2. Tracer 2 vom 25.09.02 - 06.11.02...112
4.3. Wetterdaten...114
4.3.1. Temperatur...115
4.3.2. Niederschlag ...116
4.4. Molekularbiologischer Teil...117
4.4.1. Larven-PCR ...117
4.4.1.1. Gattungsspezifische PCR ...117
Cooperia...117
Haemonchus...118
Trichostrongylus...120
4.4.2. Larventitration ...121
4.4.3. Vergleich zwischen Mikroskopie und PCR...121
________________________________________
4.4.4. Grasauswaschproben ...122
4.4.4.1. Vorversuche...122
4.4.4.2. Gattungsnachweis in der Auswaschprobe ...123
4.4.4.3. Wiederholbarkeit und Mischproben...123
4.4.4.4. Feldproben des Versuches 2002 ...124
5. Diskussion ...127
5.1. Quantitative Kotbefunde/Eiausscheidung...128
5.1.1. Magen-Darm-Strongyliden ...128
5.1.2. Nematodirus-Eizahlen...130
5.1.3. Strongyloides-Eizahlen ...131
5.2. Lungenwürmer ...132
5.3. Larvenzahlen pro g Kot ...133
5.4. Qualitative Larvenkulturen...134
5.5. Larvenzahlen in Grasauswaschproben ...134
5.7. Parasitologische Ergebnisse der Tracertiere...138
5.8. Serumpepsinogen ...139
5.9. Hämatokrit...140
5.11. Beurteilung und Ausblick ...142
5.12. Real-time PCR der Larvenkulturen ...144
5.13. Real-time PCR der Grasauswaschproben...146
6. Zusammenfassung...149
7. Summary ...152
8. Literaturverzeichnis ...154
9. Anhang ...184
9.1. Tabellenverzeichnis...213
9.2. Abbildungsverzeichnis...215
9.3. Abkürzungsverzeichnis ...216
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Einleitung13
1. Einleitung
Infektionen mit Helminthen kommen weltweit vor und verursachen bei kleinen Wiederkäuern neben den klassischen klinischen Symptomen wie Inappetenz und Diarrhöe auch bereits bei subklinischen Infektionen schlechte Mastentwicklung sowie Woll- und Milchverluste. Nach erfolgter Therapie erreichen die Tiere nur langsam wieder das Leistungsniveau nicht erkrankter Vergleichstiere. Dies führt zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Die Ansteckung erfolgt zumeist auf der Weide über mit infektiösen dritten Larven kontaminiertes Futter. Eine Bekämpfung der Helminthen ist notwendig, und diese erfolgte in den letzten Jahrzehnten meist mittels prophylaktischer/metaphylaktischer Gabe von Anthelminthika.
Die durch den regelmäßigen Gebrauch von Anthelminthika sprunghaft gestiegene Resistenzrate von Helminthen vor allem beim kleinen Wiederkäuer macht es nötig, nach alternativen Bekämpfungsstrategien zu suchen. Eine biologische Möglichkeit, neben Weidemanagement oder wechselnder Beweidung durch verschiedene Tierarten, ist die Fütterung von nematophagen Pilzen u. a. der Gattungen Athrobotrys und Duddingtonia. Diese bilden im Kot ein netzartiges Hyphengeflecht, in welchem sich die infektiösen Larven verfangen und dann von den Pilzen auf unterschiedliche Art verdaut werden. Somit kann der Infektionsdruck mit dritten Larven auf der Weide gesenkt werden. Vor allem die Art Duddingtonia flagrans ist durch ihre dickwandigen Chlamydosporen besonders geeignet, die Passage des Gastrointestinal-Traktes zu überstehen und eignet sich somit sehr gut zur einfachen Applikation mit dem Futter. In der hier vorgelegten Studie wurden in einem norddeutschen Betrieb Ziegen und Schafe drei Monate lang mit D. flagrans gefüttert und der Verlauf der Ei- und Larvenausscheidung sowie der Verlauf der Larvenentwicklung auf den Weideflächen über eine gesamte Weidesaison hin untersucht.
Ziel der regelmäßigen Kot- und Blutuntersuchungen war es, herauszufinden, inwieweit die Fütterung von D. flagrans die Belastung der Weiden mit infektiösen MDS-Larven und somit die Infektion der Weidetiere beeinflusst.
Einleitung 14 _______________________________________
Ferner sollte eine molekularbiologische Untersuchungsmethode entwickelt werden, welche eine direkte quantitative und qualitative Analyse von Feldproben auf ihre Larvenzahlen und Gattungszusammensetzungen ermöglicht.
____________________________________________________Literaturverzeichnis15 2. Literaturübersicht
2.1. Infektion mit Nematoden
Beim Wiederkäuer sind nach Anzahl der existierenden Arten, der Befallszahl (Anzahl der infizierten Tiere) und –stärke (Anzahl von Adulten einer Art in einem Tier) sowie der Pathogenität vor allem Rundwürmer aus der Klasse Nematoda die wichtigsten Helminthen. Besiedelt werden vornehmlich Gastrointestinal-Trakt (GIT) mit Vertretern der Familien der Trichostrongylidae, Strongyloididae, Trichuridae und Chabertiidae sowie Lunge mit den Familien der Dictiocaulidae und Protostrongylidae.
2.1.1. Trichostrongylidae 2.1.1.1. Erreger
Die wichtigsten Arten der Familie der Trichostrongylidae sind die Gattungen Haemonchus, Trichostrongylus, Teladorsagia, Ostertagia, Cooperia und Nematodirus, welche im Labmagen und Dünndarm parasitieren.
Bei den Gattungen der Trichostrongylidae handelt es sich um Bursanematoden, bei denen beide Geschlechter keine oder eine sehr kleine Mundkapsel aufweisen. Die Weibchen sind immer größer als die Männchen und die Größe der verschiedenen Gattungen liegt zwischen 5 und 30 mm. Beide Geschlechter besitzen auf der Kutikula Längsgrate und Querrillen, welche die Synlophe bilden. Diese ist artspezifisch und lässt eine Differenzierung der Weibchen zu (LICHTENFELS et al., 1988).
Die Weibchen, deren Vulva im hinteren Körperdrittel liegt, besitzen eine doppelte Geschlechtsanlage mit zwei Ovarien und zwei Uteri. Der Ovijektor wird von zwei Infundibula, zwei Sphinkteren, einem Vestibulum und einer Vagina gebildet.
Die Bursa der Männchen besteht aus 3 Lappen (2 breiten Seitenlappen, die über die Körperbreite hinausgehen und einem kleineren Dorsallappen). Diese Lappen werden von 5 Rippen gestützt. Des weiteren besitzen die Männchen 2 Spikula, welche spiegelbildlich symmetrisch angeordnet sind. Die Männchen lassen sich anhand der gattungsspezifischen Unterschiede leicht differenzieren (GIBBONS et al., 1982):
Nematodirus haben lange Spikula, welche über den Körper hinausragen, der Dorsallappen der Gattung Haemonchus ist asymmetrisch.
Literaturübersicht _____ _________________________________16
Teladorsagia besitzen akzessorische Lappen am Dorsallappen, Trichostrongylus besitzen ein Gubernakulum, aber kein Telamon, bei der Gattung Cooperia verhält es sich umgekehrt. Das Gubernakulum ist ein unpaares Organ, das den Spikula als Gleitschiene dient. Der Telamonapparat ist eng mit der Bursa copulatrix verbunden, seine Funktion ist unbekannt.
Die in Mitteleuropa dominierenden Arten bei Schafen und Ziegen sind Haemonchus contortus, der rote Magenwurm (Rudolphi 1803), der kleine Magenwurm Trichostrongylus axei (Cobbold 1871), Trichostrongylus colubriformis (Giles 1892), Teladorsagia circumcincta (Stadelmann 1894), Cooperia curticei (Giles 1892), sowie Nematodirus filicollis (Rudolphi 1803) und Nematodirus battus (Crofton und Thomas 1951).
2.1.1.2. Vorkommen
Die Trichostrongylidae kommen weltweit bei Wiederkäuern vor (BENESCH, 1993;
COX et al., 1962; REHBEIN et al., 1996), besiedeln vorwiegend den Labmagen und den Dünndarm und treten meistens als Mischinfektion auf.
BENESCH (1993) konnte 1993 für Schafe in Hessen folgende Befallsextensitäten aufzeigen: Der vorherrschende Vertreter der Trichostrongylidae war Teladorsagia circumcincta mit 60,0 %. Haemonchus contortus konnte bei 46,2 % aller untersuchten Tiere nachgewiesen werden, Trichostrongylus axei zu 23,8 %, andere Trichostrongylusarten zu 38,5 %, Nematodirus spp. mit 43,1 % und Cooperia spp. mit 23,8 %. Ähnliche Zahlen zeigten REHBEIN et al. (1996).
2.1.1.3. Lebenszyklus
Die Adulten der Trichostrongyliden besiedeln den Labmagen und den Dünndarm. Im Labmagen von kleinen Wiederkäuern findet man vor allem die Gattungen Haemonchus, Ostertagia und die Art Trichostrongylus axei, im Dünndarm die Gattungen Cooperia und Nematodirus sowie die Gattung Trichostrongylus spp.
____________________________________________________Literaturverzeichnis17 (ECKERT und BÜRGER, 1979; BENESCH, 1993; REHBEIN et al., 1996). Die Weibchen legen je nach Art unterschiedlich viele, bereits gefurchte Eier (McKENNA, 1997) in das Darmlumen ab, welche mit dem Kot in die Außenwelt gelangen. Hier entwickelt sich, abhängig von den äußeren klimatischen Umständen, im Ei die erste Larve, welche aktiv das Ei verlässt und sich im Kot weiterentwickelt. Als Nahrungsgrundlage dienen den Larven Kotbestandteile (PROSL, 1986). Sie häutet sich zur zweiten Larve, welche ebenfalls im Kot lebt und sich von diesem ernährt. Die Häutung zur dritten Larve erfolgt ohne Abstreifen der Kutikula, so dass eine bescheidete Larve entsteht. Diese nimmt keine Nahrung mehr auf, sondern lebt von eingelagerten Reservestoffen und muss nun vom Wirt oral aufgenommen werden.
Bei der Gattung Nematodirus vollzieht sich die Entwicklung bis zur dritten bescheideten Larve im Ei. Erst diese schlüpft und muss dann analog zu den übrigen Gattungen von einem Wirt aufgenommen werden. Im Labmagen wird die schützende Scheide abgestreift und die Larve wandert aktiv in den Zielorganen (Labmagen oder Dünndarm) in die Drüsenlumina, bzw. in die Schleimhautkrypten ein, wo sie sich innerhalb weniger Tage zur vierten Larve häutet. Die vierte Larve häutet sich und die Adulten parasitieren auf der Schleimhautoberfläche. Die Präpatenz beträgt zwischen 2 und 3 Wochen (ECKERT und BÜRGER, 1979; PROSL, 1986), bei Nematodirus liegt die Präpatenz bei 21-26 Tagen.
2.1.1.4. Epidemiologie
Die Entwicklung vom Ei zur infektiösen dritten Larve dauert unterschiedlich lange. Sie ist abhängig von den äußeren Umweltbedingungen und dauert mindestens 4-7 Tage (BÜRGER et al.,1966), bei Kälte und Trockenheit länger (GIBSON, 1971;
GOLDENSTEIN, 1978). Eine Ausnahme bildet hiervon die Gattung Nematodirus.
Hier dauert die minimale Entwicklungszeit mehrere Wochen, bei der Spezies Nematodirus battus ist ein Kältereiz durch den Winter obligat, so dass eine Kontamination der Weiden mit infektiösen Larven erst im nächsten Frühjahr erfolgt.
Die dritten Larven verbreiten sich sowohl aktiv durch Eigenbewegung als auch passiv über die Weide. Zur passiven Verbreitung tragen verschiedene Vektoren bei.
Regentropfen schwemmen die Larven vom Kot auf die Weide, durch die Passage
Literaturübersicht _____ _________________________________18 kleiner Lebewesen (wie z.B. Regenwürmer und Schnecken) werden die Larven über
die Weide verteilt. Die Kothaufen werden von Tieren zertreten und die Larven so verbreitet. Sowohl BAUER et al. (1988) als auch HERTZBERG (2000) bezeichnen den Zukauf bereits infizierter Tiere als eine weitere Möglichkeit zur Infektion einer Herde mit Trichostrongyliden.
Eine Ansteckung der Tiere erfolgt vorwiegend auf der Weide durch kontaminiertes Gras, nur sehr selten im Stall.
Auf der Weide sind die dritten Larven in der Lage zu überwintern (ROSE, 1965;
BÜRGER et al., 1966; GIBBS, 1979). Auf diese Weise und durch die vermehrte Ausscheidung der Muttertiere nach der Geburt (periparturienter Anstieg) werden empfängliche Jungtiere infiziert (GIBSON, 1971).
Nach THOMAS und BOAG (1973) gibt es für die Larvenanzahl auf der Weide über den Sommer drei Gipfel. Den ersten im Mai/Juni, verursacht durch überwinterte dritte Larven, den zweiten im Juli/August durch die Ausscheidung der Muttertiere und Selbstansteckung von Jungtieren untereinander und einen weiteren im September/Oktober durch die Selbstansteckung der Tiere untereinander.
Mit der Nahrung aufgenommene Larven haben zwei Möglichkeiten der Entwicklung.
Sie entwickeln sich entweder zu Adulten, oder sie unterbrechen im Wirt die Entwicklung (Hypobiose) und verbleiben als Dauerstadien über einen längeren Zeitraum in der Schleimhaut (ARMOUR und BRUCE, 1974; ARMOUR, 1980;
ECKERT und BÜRGER, 1979 und EYSKER, 1997). Als auslösende Faktoren für die Hypobiose werden die Immunitätslage der Wirtstiere, das Herdenmanagment (EYSKER, 1997) und vor allem der Einfluss niedriger Umgebungstemperaturen auf dritte Larven diskutiert (ARMOUR und BRUCE, 1974).
1980 beschrieb ARMOUR drei Haupteinflüsse für das Entstehen von Helmintheninfektionen: Der erste ist die Anzahl infektionsfähiger Larven pro Fläche, welche abhängig ist von der Reproduktionsrate der Erreger, der Immunlage der Wirte (ECKERT at al., 1968), dem Managment (wie z.B. Besatzdichte) (GIBSON, 1971) und der Verbreitung über die Weide.
Der zweite Einflussfaktor ist die Empfänglichkeit der Herde. So steigt während der Trächtigkeit und Laktation die Empfänglichkeit der Muttertiere für eine Parasitose an
____________________________________________________Literaturverzeichnis19 (GIBBS, 1979; PROSL, 1986). Ebenfalls reagiert eine Herde bei Stress, wie z.B.
Umstallung oder Defiziten in der Ernährung. Auch der Einsatz von Medikamenten, wie z.B. Glucokortikoiden, kann das Angehen einer Helmintheninfektion begünstigen (MAINGI et al., 1996).
Als dritter Weg ist das Einbringen einer empfänglichen Herde in ein kontaminiertes Areal genannt. Hier spielen vor allem die Empfänglichkeit juveniler Tiere sowie genetische Faktoren verschiedener Rassen eine Rolle.
2.1.1.5. Pathogenese und Klinik
Durch eine Infektion des Verdauungskanals mit Helminthen kommt es bei Wiederkäuern zu einer Störung der Digestion, wobei die Stärke der Symptome abhängig ist vom Alter des Tieres, dessen Immunitätslage, der Pathogenität der infizierenden Art und der Infektionsdosis.
Im Labmagen verursachen die Larven eine Zerstörung der Drüsen und der Salzsäure produzierenden Belegzellen. Hierdurch kommt es zu einem Anstieg des pH–Wertes im Labmagen auf bis zu pH 7. Das Proenzym Pepsinogen wird in saurem Milieu (bei einem pH-Wert von ca. 2) deutlich schneller zu Pepsin umgewandelt als bei höheren pH-Werten. Folglich sinkt die Fähigkeit Proteine zu verdauen. Der steigende pH–Wert selbst wirkt sich ebenfalls negativ auf die Proteinverdaulichkeit aus, da bei steigendem pH-Wert die Denaturierung der Proteine abnimmt. Die Tiere magern ab.
Durch den steigenden pH-Wert sinkt der bakteriostatische Effekt der Magensäure (ARMOUR, 1974). Es kann zu einer Dysbiose kommen, in deren Folge die Tiere inappetent werden, was ebenfalls zur Abmagerung führt. In vielen Fällen ist eine Diarrhöe zu beobachten.
Die Zerstörung der Hauptzellen durch die Nematoden führt ausserdem direkt zu einer verminderten Produktion von Pepsinogen, was ebenfalls einen negativen Einfluss auf die Proteinverdaulichkeit hat.
Zerstörte Zellen und Drüsen werden durch undifferenzierte Zellen ersetzt, und die Integrität der Oberfläche geht verloren. Aus dem umgebenden Gefäßsystem werden Makromoleküle, wie z.B. Albumine, in den Labmagen verloren (COOP et al., 1979),
Literaturübersicht _____ _________________________________20 andererseits tritt Pepsinogen in das Gefäßsystem über. Es kommt zu einer
Hypoalbuminämie und zu einem erhöhten Pepsinogenspiegel im Serum.
Bei hämatophagen Helminthen, besonders Haemonchus contortus, kommt es zu einem Abfall des Hämatokritwertes und den klinischen Symptomen einer Anämie (ROSS und TODD, 1965).
Der steigende pH-Wert bewirkt eine vermehrte Produktion von Gastrin, einem Enzym, das einen Einfluss auf die Motilität des Gastrointestinal-Traktes hat. Die Motilitätsabnahme vor allem der Vormägen kann zu einer Inappetenz der betroffenen Tiere führen (SCHILLHORN VON VEEN, 1988).
Bei den im Dünndarm parasitierenden Helminthen kommt es durch die Einwanderung der Larven in die Krypten der Schleimhaut zur Zerstörung der Schleimhautstruktur. Die Zotten sind verkürzt, und die Bürstensäume gehen verloren, wodurch es zu einer Verringerung der Resorptionsoberfläche kommt (COOP et al., 1979). Nachwachsende Zellen aus den Krypten gelangen wesentlich schneller an die Zottenoberfläche als bei einem nicht infizierten Tier und sind dementsprechend unausgereifter. Die Resorptionsfähigkeit der Schleimhaut sinkt, und die betroffenen Tiere zeigen Abmagerung und Durchfall.Es kommt zu einem zahlenmäßigen Anstieg der Becherzellen und damit zu einer vermehrten Muzinproduktion, was ebenfalls Diarrhöe zur Folge hat (COOP et al., 1979).
Klinisch lassen sich bei befallenen Tieren folglich Inappetenz, Diarrhöe, Abmagerung bis zur Kachexie, Anämie, Hypoalbuminämie und Ödeme nachweisen (ECKERT et al., 1968; COOP et al., 1979; ECKERT und BÜRGER, 1979; STEEL et al., 1982;
BEHRENS, 2001). Starke Infektionen können zum Tod der Wirtstiere führen.
Alle Symptome führen zu wirtschaftlichen Einbußen durch verminderte Mastzunahmen (HIEPE und ZIMMERMANN, 1966; STEEL et al., 1982), verringerte Milchleistung, herabgesetzte Fertilität (ZINSSTAG et al., 1997) und Wollmängeln hinsichtlich Qualität und Quantität (HIEPE und ZIMMERMANN, 1966; STEEL et al., 1982).
____________________________________________________Literaturverzeichnis21
2.1.1.6. Diagnose
2.1.1.6.1. Klassische Diagnostik
Beim kleinen Wiederkäuer erlauben bereits gehäuftes Auftreten von Diarrhöen, schlechte Herdenentwicklung und die sogenannten Flaschenhalsödeme den Verdacht auf eine Nematodeninfektion (HIEPE, 2001).
Nach Ablauf der Präpatenz ist es möglich, die Eier von Nematoden des Gastrointestinal-Traktes durch Flotationsmethoden nachzuweisen. Hierbei wird der Kot in einer Flotationsflüssigkeit, wie z.B. gesättigter NaCl oder ZnSO4, mit einem spezifischen Gewicht von >1,18 suspendiert und nach einer gewissen Flotationszeit die Eier mittels einer Öse von der Oberfläche abgenommen. Sie können dann unter dem Mikroskop ihrer Morphologie entsprechend differenziert werden.
Um eine Aussage über die quantitative Eiausscheidung der Tiere machen zu können, bedient man sich des McMaster-Verfahrens (GORDEN und WHITLOCK, 1939) z.B. in der Modifikation von WETZEL (1951) und SCHMIDT (1971). Hierbei wird eine definierte Menge Kot mit einer definierten Menge Flotationsflüssigkeit vermischt und ein Teil dieser Suspension in einer Kammer mit bekanntem Volumen unter dem Mikroskop ausgezählt. Ein Rückschluss von der Eizahl pro Gramm Kot auf die Wurmbürde im Tier ist aber bei den häufig auftretenden Mischinfektionen nicht möglich (McKENNA, 1997).
Die Eier der Magen-Darm-Strongyliden sind alle, mit Ausnahme der Gattung Nematodirus, 70-80 µm lang, dünnschalig, eiförmig und enthalten Furchungszellen.
Eine Gattungs- oder Artdifferenzierung ist mikroskopisch anhand der Eier nicht möglich. Die Eier von Nematodirus sind ca. 120 µm groß, dickschalig und enthalten wenige, große Furchungskugeln. Eine Abgrenzung dieser Gattung zu den anderen Magen-Darm-Strongyliden ist möglich. Weiterhin ist eine Identifikation der Art Nematodirus battus anhand der Eimorphologie eindeutig möglich, da die Eier dieser Art, verglichen mit den anderer Nematodirus-Arten, kleiner sind und parallele Seitenwände besitzen (BAUER, 1989).
Literaturübersicht _____ _________________________________22 Eine Gattungsunterscheidung ist bei den Magen-Darm-Strongyliden nur durch eine
mikroskopische Untersuchung dritter Larven möglich. Hierfür wird Kot für 8 Tage bei 28 °C inkubiert. Die Larven werden im Anschluss daran über ein Auswanderverfahren gewonnen. Die Differenzierung erfolgt anhand spezifischer Merkmale unter dem Mikroskop (BÜRGER und STOYE, 1968; ECKERT, 1960) und erfordert vom Untersuchenden ein hohes Maß an Erfahrung (GEORGI und McCULLOCH, 1989; GASSER, 1994).
Für eine Artdiagnose ist es nötig, Adulte zu gewinnen. Diese können dann unter dem Mikroskop differenziert werden. Bei einer alleinigen mikroskopischen Differenzierung der Arten anhand der Strukturen und Maße der Eier konnten Teladorsagia circumcincta zu 49,5 %, Trichostrongylus axei zu 76 %, Cooperia curticei zu 60 % und Haemonchus contortus zu 67 % wiedergefunden werden. Lediglich die Gattung Nematodirus spp. erreichte eine Erkennungsrate von 100 % (GEORGI und McCULLOCH, 1989). SOMMER (1996) erreichte bei einer digitalen Bildanalyse der Eier Erkennungsraten zwischen 76,3 % für Ostertagia ostertagi und 90,8 % für Cooperia oncophora.
Die bereits oben beschriebenen Blutwertveränderungen bei einer Infektion mit Nematoden können ein Hinweis auf eine bestehende Infektion sein. Die wichtigste Veränderung ist der erniedrigte, durch hämatophage Spezies verursachte Hämatokritwert. Bei der Untersuchung wird gerinnungsgehemmtes Blut zentrifugiert und so der Zellbestandteil des Blutes vom flüssigen Rest getrennt. Anhand von Messskalen kann der Hämatokrit (in l/l) abgelesen werden. Weitere wichtige Blutwertveränderungen bei einer Infektion mit Trichostrongyliden sind der steigende Pepsinogenspiegel und der sinkende Albuminspiegel. Das Pepsinogen kann mit der Methode von BERGHEN et al. (1987) bestimmt werden und wird in mU Tyrosin/µl angegeben.
HERTZBERG et al. (1993) beschreibt die Endoskopie des Labmagens als sinnvolle Ergänzung der Diagnostik. Dies ist vor allem im Bereich der Versuchstierkunde wichtig, um die Anzahl der Versuchstiere zu verringern.
____________________________________________________Literaturverzeichnis23 Weiterhin wurde als serologische Methode der ELISA beschrieben. Hierbei werden Antigene des Nematoden, die aus Adulten oder Larven gewonnen wurden, mit dem Serum infizierter Tiere auf Mikrotiterplatten inkubiert. Durch Zugabe eines Konjugates können die vom Tier gebildeten Antikörper an die entsprechenden Antigene binden.
Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass eine hohe Infektionsdosis als Schwellenwert nötig ist, um eine Antikörperbildung im Tier zu stimulieren (BERGHEN et al., 1993).
2.1.1.6.2. Molekularbiologische Diagnostik
Die Schwierigkeiten, einzelne Trichostrongylidengattungen anhand morphologischer Kriterien verschiedener Entwicklungsstadien (Eier oder Larven) zu identifizieren, wurden bereits dargestellt. Neben der Erfahrung durch den Untersucher benötigen Larvenkulturuntersuchungen auch eine gewisse Zeitspanne, bis erste Ergebnisse vorliegen. Die Möglichkeit, molekukargenetische Methoden einzusetzen, um schnelle und präzise Aussagen über die Art einer Infektion treffen zu können, bietet eine gute Alternative zur herkömmlichen klassischen Diagnostik.
Bereits 1994 konnten CHRISTENSEN et al. genusspezifische Reaktionen beim Screening von genomischen DNA-Banken von Ostertagia ostertagi, Haemonchus placei, Cooperia oncophora und Oesophagostomum radiatum beobachten. Hierbei wurde genomische DNA von den genannten Spezies aus Adulten und aus Eiern isoliert und mit radioaktiv markierter homologer und heterologer DNA im Southern Blot, sowie im Dot Blot durchgemustert. Nicht kreuzreagierende Klone wurden für weitere Untersuchungen mit genomischer DNA eingesetzt, und es konnte nachgewiesen werden, dass die Klone genusspezifisch binden. Auch eine Untersuchung mit DNA aus Eiern war erfolgreich.
Eine speziesspezifische Diagnose gelangen GASSER et al. (1994) mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) und einem Restriktionsfragmentlängen- polymorphismus (RFLP). Es wurde der zweite interne transkribierte Spacer (ITS-2) der einzelnen Spezies mit Hilfe der PCR amplifiziert und anschließend mit Restriktionsenzymen verdaut. Die unterschiedlichen Fragmente wurden auf einem Agarosegel voneinander getrennt und detektiert. Auf diese Weise konnten die Arten Cooperia oncophora, Trichostrongylus colubriformis, Trichostrongylus axei,
Literaturübersicht _____ _________________________________24 Trichostrongylus vitrinus, Teladorsagia circumcincta und Haemonchus contortus
identifiziert werden.
Weiter verbanden GASSER et al. (1997) die ITS-2 PCR mit einer SSCP-Analyse (Einzelstrangkonformationspolymorphismus). Hierbei wurde der amplifizierte Abschnitt der DNA denaturiert und auf einem Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Dies ergab spezifische Bandenmuster für die einzelnen untersuchten Spezies.
Auch ZARLENGA et al. (1994) gelangen die Differenzierung von Haemonchus contortus und Haemonchus placei mittels sequenzspezifischer Primer.
Mittels sequenzspezifischer Primer gelang 1999 die Identifizierung von verschiedenen Trichostrongylidenspezies (SCHNIEDER et al., 1999; HEISE, 1999).
Es konnte nachgewiesen werden, dass die Unterschiede der ITS-2 Sequenzen verschiedener Arten einer Gattung nur gering variieren (zwischen 0,83 und 2,60 %), im Gegensatz hierzu variieren die Sequenzen zwischen verschiedenen Gattungen zwischen 20-40 %. Es konnte DNA sowohl aus Eiern als auch aus Larvalstadien detektiert werden. Die Sensitivität für einzelne Gattungen war sehr hoch. Es konnten DNA-Mengen nachgewiesen werde, welche unter der DNA-Menge eines Eies lagen.
Alle diese Methoden haben den Nachteil, dass sie für ihre Durchführung mehrere Schritte benötigen, und somit sehr arbeitsaufwendig sind. Die Gefahr von Kontaminationen ist hoch (ZARLENGA und HIGGINGS, 2001). Sowohl falsch positive als auch falsch negative Resultate sind möglich. Zudem ist eine Quantifizierung nur bedingt möglich.
Die Echtzeit-PCR oder Real-time-PCR ist in der Lage, diese Nachteile zu umgehen (BUSTIN, 2000; HELPS et al., 2001). Sie bildet ein geschlossenes System, kann in einem Arbeitsschritt durchgeführt werden und bietet durch spezielle Software die Möglichkeit, die Ausgangsmengen an DNA zu ermitteln (BUSTIN, 2000;
HELPS et al., 2001). Grundlage der Quantifizierung ist die Markierung der DNA über Fluoreszenzfarbstoffe oder farbstoffmarkierte, sequenzspezifische Sonden. Die Farbstoffe lagern sich in die doppelsträngige DNA ein oder binden an die Zielsequenz. Anhand der Stärke des emittierten Lichts kann auf die Menge der Ziel- DNA geschlossen werden (ZARLENGA und HIGGINS, 2001). Bei einer solchen PCR ist der Thermocycler für die Amplifizierung der Ziel-Sequenz mit einem
____________________________________________________Literaturverzeichnis25 Fluoreszensdetektor gekoppelt. Der Fluoreszensdetektor liest die von den Proben emittierten Lichtsignale einer bestimmten Wellenlänge und eine spezielle Software analysiert anhand der Stärke des emittierten Lichts die Substratmengen. Besonders spezifisch sind sogenannte TaqMan®-Minor-groove-binder-Sonden (MGB-Sonden), welche aus komplementären Oligonukleotiden zur Ziel-DNA bestehen. An dieses Oligonukleotid sind zwei Farbstoffe gebunden, die Reporter und Quencher genannt werden. Während der PCR wird der Reporter zur Fluoreszenz angeregt, jedoch bei räumlicher Nähe zu dem Quencher wird dieses Licht unmittelbar absorbiert. Im Verlauf einer PCR werden die TaqMan®-Sonden durch die 5´-3´-Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase hydrolysiert. Dadurch kann die Reporterfluoreszenz detektiert werden (ZARLENGA und HIGGINS, 2001). MGB-Sonden sind ebenfalls kurzkettige Oligonukleotide, welche in freier Form eine knäuelförmige Sekundärstruktur einnehmen. Durch diese Struktur kommt es zum Quenchen. Lagern sich diese Sonden an die Zielsequenz an, kommt es zum Lösen der Sekundärstruktur. Auch in diesem Fall werden Reporter und Quencher durch die Exonuklease-Aktivität der Taq- Polymerase räumlich voneinander getrennt. Der Vorteil dieser MGB-Sonden liegt in ihrer hohen Bindungsstabilität. An ein Ende der Sonde ist ein Peptid konjugiert, welches sich bei Anlagerung an die DNA in deren kleine Kurvatur einlagert und die Bindung durch zwischenmolekulare Kräfte, die „van-der-Waal´s“-Kräfte, stabilisiert.
Durch diese Stabilisierung kann die Anlagerungstemperatur der PCR erhöht werden und die Spezifität wird somit verbessert (AFONINA et al., 1997; KUTYAVIN et al., 2000). Ein weiterer Vorteil dieser Sonden liegt in der niedrigen Hintergrundfluoreszenz, welche eine Quantifizierung der Produkte erleichtert (KUTYAVIN et al., 2000). Des weiteren wird eine Sondenform verwendet, bei welcher die Fluoreszenz bei Anlagerung an den DNA-Strang ermittelt werden kann. Diese Sondenform ist der Molecular Beacon (TYAGI und KRAMER, 1996). Durch eine spezifische, komplementäre Sequenzfolge am Anfang und Ende der Sonde, wird eine Haarnadelform der Sonde bedingt, solange sich diese in Lösung befindet.
Reporter und Quencher liegen in enger räumlicher Nähe zueinander. Bei Anlagerung an die Zielsequenz der DNA kommt es zum Lösen der Haarnadelform, die Sonde wird gestreckt und der absorbierende Effekt des Quenchers entfällt. Die Fluoreszenz kann detektiert werden. Während der Real-time-PCR wird während jedes Zyklus die Fluoreszenz der spezifischen Sonde und die Hintergrundfluoreszenz gemessen. Ein Vielfaches dieser Hintergrundfluoreszenz wird als Schwellenwert (Threshold) der
Literaturübersicht _____ _________________________________26 Berechnung der Ziel-DNA-Menge zugrundegelegt. Entscheidend ist, in welchem
Zyklus eine Probe diesen Schwellenwert überschreitet (Ct-Wert). Die Ct-Werte der einzelnen Proben werden mit den Ct-Werten von Standard-Konzentrationen verglichen und ermöglichen so die Errechnung der Ausgangskonzentration der Ziel- DNA.
Der Vorteil dieser Real-time PCR ist neben der Vereinfachung von Arbeitsschritten auch der hohe Probendurchsatz. Eine Probe wird mit geringen Mengen an Substraten untersucht und die verwendeten Geräte zur quantitativen PCR bieten die Möglichkeit, mit sogenannten Mikrotiterplatten zu arbeiten, welche Platz für 96 Reaktionen haben.
V. SAMSON-HIMMELSTJERNA et al. zeigten 2002, dass der Einsatz von gattungsspezifischen Primern und Sonden für die wichtigsten Trichostrongyliden der Wiederkäuer in der Real-time-PCR möglich ist. Es gelang der Nachweis von 100 Kopien DNA, entsprechend einem Zehntel eines DNA-Äquivalentes von einer ersten Larve (L1).
2.1.1.7. Bekämpfung
Die Bekämpfung der Infektionen von Wiederkäuern mit Helminthen hat sich in den letzten Jahrzehnten von der reinen Heilbehandlung zum prophylaktischen Einsatz der Anthelminthika mit entsprechenden Strategien entwickelt, um die wirtschaftlichen Verluste möglichst gering zu halten (ROMMEL und SCHNIEDER, 1989). Diese Strategien richten sich nach den betriebswirtschaftlichen Voraussetzungen und müssen diesen individuell angepasst werden (GIBSON, 1971).
2.1.1.7.1. Weidemanagement
Die Hauptinfektionsquelle für kleine Wiederkäuer mit Helminthen stellt das mit infektiösen Larven kontaminierte Gras dar, welches durch Ausscheider über die Weidesaison hin kontaminiert wird (GIBSON, 1971) oder durch Überwinterung der infektiösen Larven bereits bei Weideaustrieb kontaminiert ist (ROSE, 1965; BÜRGER et al., 1966; GIBBS, 1979).
____________________________________________________Literaturverzeichnis27 Kontaminierte Weideflächen sollten in der folgenden Saison nicht wieder von kleinen Wiederkäuern beweidet werden. Eine Mähnutzung reduziert die Larvenzahl auf der Weide, und diese kann im folgenden Jahr wieder von kleinen Wiederkäuern beweidet werden.
Als Weidemanagement gibt es drei Möglichkeiten, deren jeweiliger Einsatz von den Betriebsstrukturen abhängt.
Wichtigster Aspekt ist das Weiden von infektionsgefährdeten Jungtieren auf sauberen Flächen, welche im vorigen Jahr nicht schon mit kleinen Wiederkäuern beweidet wurden. Im günstigsten Fall werden die Jungtiere alle 14 Tage auf eine saubere Weide umgetrieben. Da die Präpatenz der Nematoden länger als zwei Wochen dauert, wird durch diese kurze Zeit eine Kontamination der Fläche und im darauffolgenden Jahr der Tiere vermieden/-mindert. Der Nachteil dieses Systems ergibt sich aus dem Zeitaufwand, der großen benötigen Fläche und der Notwendigkeit, die Weiden zu portionieren. Dies ist nicht in jedem Betrieb möglich.
Eine andere Möglichkeit, die Kontamination von Weideflächen einzuschränken, ist die wechselnde Beweidung mit anderen Tierarten, welche nicht empfänglich für Helminthen der kleinen Wiederkäuer sind. Die hierfür notwendigen Strukturen sind ebenfalls nicht in jedem Betrieb gegeben.
Eine weitere, weniger arbeitsintensive Möglichkeit ist das sogenannte Weybridger Dose-and-Move-System (MICHEL, 1976). Hierbei werden die Tiere nach einer anthelmintischen Behandlung in der Mitte der Weidezeit (Juli) auf eine saubere Weide umgetrieben. Bei diesem System kann nach WILLIAMS (1997) auch eine Aufstallungsbehandlung entfallen.
2.1.1.7.2. Anthelminthika
Die relativ niedrige Gewinnspanne bei der Nutzung kleiner Wiederkäuer sollte einen seltenen, wohldosierten Einsatz von anthelminthischen Chemotherapeutika bedingen. Sie gelangen hauptsächlich in Kombination mit Weidemanagement zum Einsatz. Wichtig ist auch in diesem Fall, dass empfängliche Jungtiere wenig Kontakt zu infektiösen dritten Larven haben.
Literaturübersicht _____ _________________________________28 Den größten prophylaktischen Erfolg erreicht man mit einer einmaligen Therapie
aller Muttertiere vor dem Lammen bzw. vor dem Austrieb auf die Weide, um den parturienten Anstieg der Larvenausscheidung der Muttertiere einzuschränken.
THOMAS und BOAG (1973) erreichten mit diesem System eine, allerdings nur kurzzeitige, 97 %ige Reduktion der Eiausscheidung. Eine sinnvolle Ergänzung wäre ein Umweiden der Tiere, um eine Reinfektion zu verhindern.
Bis zum Zeitpunkt des Absetzens der Jungtiere in der Mitte der Weidezeit haben sich auf den Muttertierweiden häufig hohe Larvenzahlen im Gras angesammelt. Die Jungtiere werden, abhängig von den Möglichkeiten des Betriebes, auf saubere oder bereits kontaminierte Weiden verbracht. Nach dem Verbringen auf saubere Weiden für den Rest der Saison genügt in der Regel eine Aufstallungsbehandlung. Wenn keine sauberen Weiden zu Verfügung stehen, sollten die Tiere im Abstand von drei Wochen über den Sommer bis zu drei mal behandelt werden. Eine Aufstallungsbehandlung erfolgt auch in diesem Fall.
Dies entspricht dem Glasgower Modell der Rinder. Eine Immunität der Tiere kann sich ausbilden und es kommt nicht zu klinischen Schäden (TAYLOR und HUNT, 1988).
Als Chemotherapeutika kommen beim kleinen Wiederkäuer vier Gruppen von Wirkstoffen zum Einsatz: (Pro-)Benzimidazole wie z.B. Albendazol, Febantel oder Fenbendazol, die zyklischen Amidine wie Pyrantel und Morantel, das Imidazothiazol (Levamisol) und die makrozyklischen Laktone wie Ivermectin, Doramectin oder Moxidectin (BAUER et al., 1988). Alle diese Gruppen zeigen eine gute Wirksamkeit gegen adulte Stadien der Nematoden. Zyklische Amidine und Imidazothiazole sind aber nur bedingt, bzw. nicht wirksam gegen hypobiotische Stadien. Die Applikation erfolgt zumeist oral als Drencher und vereinzelt mit dem Futter. Parenteral können makrozyklische Laktone und Imidazothiazole verabreicht werden. Zusätzlich kann bei Ziegen eine Behandlung mit makrozyklischen Laktonen auch noch im Pour-on- Verfahren erfolgen.
Die Applikation eines Bolus zur Behandlung der Tiere über die gesamte Weidesaison wurden erprobt, ist in Deutschland jedoch nicht zugelassen (HIEPE, 2001).
Bei dem therapeutischen und prophylaktischen Einsatz von Anthelminthika hat es sich als vorteilhaft erwiesen, eine 24-stündige Nahrungskarenz vor der Behandlung
____________________________________________________Literaturverzeichnis29 durchzuführen, da sich so die Wirkstoffspiegel im Blut der Tiere erhöhen (ALI und HENNESSY, 1993).
2.1.1.7.2.1. Resistenzproblematik
Vermutlich durch zu häufigen und strategisch falschen Einsatz ist es in den letzten Jahren zu einem vermehrten Auftreten von Anthelminthikaresistenzen gekommen.
Bereits 1964 berichtete CONWAY von wechselnden Erfolgen bei der Therapie von Haemonchus contortus mittels Thiabendazol. Auch andere Autoren berichteten von Resistenzen (BAUER et al., 1988; LACEY, 1988; OBENDORF et al., 1991; WALLER, 1997; WARUIRU 1997). Die Resistenzen haben sich besonders gegen die Gruppe der Benzimidazole weit verbreitet und sind zu einem erheblichen Problem bei Weidetieren geworden (LACEY, 1988). Resistenzen treten aber nicht nur gegen die Gruppe der Benzimidazole auf, sondern konnten in der Vergangenheit gegen nahezu alle Anthelminthikagruppen nachgewiesen werden (WALLER, 1997). So berichtet WARUIRU (1997) über einen Ivermectin-resistenten Stamm von Haemonchus contortus, welcher sich besonders bei oralem Einsatz dieses Wirkstoffes entwickelte.
BORGSTEEDE et al. (1997) stellten 1997 bei einer Untersuchung von niederländischen Schaffarmen Resistenzen gegen Oxfendazol, Ivermectin und Levamisol fest.
Auch können bei einem Helminthenstamm Resistenzen gegen mehrere Anthelminthikagruppen gleichzeitig vorliegen (WARUIRU, 1997).
Nachgewiesen werden können Resistenzen nach den Vorgaben der W.A.A.V.P.
(COLES et al., 1992) über den in vivo durchzuführenden Eizahlreduktionstest und die in vitro Methode des Entwicklungshemmtests. Bei dem Eizahlreduktionstest wird die Eizahl pro Gramm Kot vor und nach der Behandlung bestimmt. Bei einer Eizahlreduktion von weniger als 95 % gelten die Stämme als resistent.
Als problematisch ist in diesem Fall zu werten, dass bei den häufig vorkommenden Mischinfektionen einzelne Stämme resistent und andere sensibel sind, dies aber durch die morphologische Ähnlichkeit der Eier nicht erkannt wird. Daher empfiehlt McKENNA (1997) nicht nur eine Zählung der Eier, sondern zeitgleich das Anlegen einer Larvenkultur, damit die einzelnen Gattungen vor und nach der Behandlung differenziert werden können.
Literaturübersicht _____ _________________________________30 Beim Entwicklungshemmtest werden frische Eisuspensionen mit verschiedenen
Konzentrationen eines Test-Benzimidazols über 48 Stunden inkubiert, die Entwicklung der Larven danach abgestoppt und die ED50 (effektive Dosis) berechnet.
Diese gibt die Konzentration von Benzimidazol an, bei der noch 50 % der Larven aus den Eiern geschlüpft sind. Nach WHITLOCK et al. (1980) gilt eine Population mit einer ED50 von 0,2 ppm Thiabendazol als resistent.
Für die Resistenz gegen Benzimidazole wird eine Punktmutation des β-Tubulins an der Bindungsstelle der Wirkstoffe verantwortlich gemacht. Dies wurde von LACEY (1988) für Haemonchus contortus untersucht haben. OBENDORF et al. (1991) vermuteten einen ähnlichen Mechanismus für Nematodirus spp.
Resistenzen treten weltweit und bei verschiedenen Trichostrongylidengattungen auf.
Besonders in Gebieten mit sehr hoher Anzahl von kleinen Wiederkäuern, wie z.B. in Australien, Neuseeland oder Afrika, hat die Anzahl von Resistenzen beängstigend hohe Werte angenommen (MAINGI et al., 1996; WALLER et al., 1997). In Mitteleuropa hatte man der Resistenzproblematik in der Vergangenheit nur eine untergeordnete Rolle zugemessen, doch zeigen Studien, dass das Vorkommen von Resistenzen beim kleinen Wiederkäuer auch hier zunimmt (BAUER et al., 1988). In den Niederlanden konnte mittels Eizahlreduktionstests bei 69 % der untersuchten Bestände eine Resistenz gegen Oxfendazol, bei 51 % gegen Ivermectin und bei 36 % gegen Levamisol nachgewiesen werden (BORGSTEEDE et al., 1997).
In Dänemark wiesen MAINGI et al. (1996) ebenfalls Resistenzen gegen Benzimidazole (12,5 %), Levamisol (25 %) und Ivermectin (12,5 %) nach.
2.1.1.7.3. Impfungen
Bei einer Impfung werden drei Hauptziele verfolgt (EMERY und WAGLAND, 1991):
Zum einen ist es eine Verminderung der Weidekontamination, um die Reinfektion der Tiere zu vermindern. Zum zweiten sollen vor allem die hochempfänglichen Jungtiere geschützt werden, und ein weiteres Ziel ist die Reduktion des Anthelminthikaeinsatzes. Bei der Impfung gegen Helminthen nutzt man die Tatsache aus, dass Tiere, die über einen längeren Zeitraum Kontakt mit den Parasiten hatten,
____________________________________________________Literaturverzeichnis31 eine Immunität entwickeln, die das Aufbauen einer pathogenen Wurmbürde verhindert (EMERY und WAGLAND, 1991).
Bereits 1968 berichteten BÜRGER et al. von Infektionsversuchen mit röntgenbestrahlten infektiösen Larven der Gattungen Ostertagia und Cooperia beim Rind. Sie stellten fest, dass in Abhängigkeit von der Strahlendosis die Anzahl der Adulten abnahm, was jedoch die Tiere nicht vor einer Infektion schützte.
Gegen Haemonchus contortus und Trichostrongylus colubriformis konnte ein bis zu 80 %iger Schutz bei einer Applikation von 2x104 bestrahlten Larven bei immunkompetenten Tieren erreicht werden (ADAMS et al., 1989; SMITH et al., 1980). Die Gewinnung und Aufbereitung der Larven ist jedoch sehr zeitaufwendig, ebenso wie die Applikation an das Tier. Daher ist dieses Verfahren in praxi unpraktikabel. Aus diesem Grund wurden Vakzinen unter Verwendung verschiedener Antigenextrakte der Helminthen hergestellt. Besonders hervorzuheben ist hierbei der Erfolg von MUNN (1993), dem es mittels des Membranglykoproteins H110D von Haemonchus contortus gelang, einen 90 %igen Schutz der Schafe gegen diese Spezies in Versuchen zu demonstrieren. Es ist jedoch keine Vakzine erhältlich, da reduziertes Antigen keine Protektivität besitzt.
2.1.1.7.4. Biologische Kontrolle
Aufgrund der oben angesprochenen Probleme der Anthelminthikaresistenzen sucht man in den letzten Jahren verstärkt nach alternativen, biologischen Bekämpfungsstrategien. Eine erfolgversprechende Möglichkeit ist die Applikation nematophager Pilze (siehe auch 2.2. Nematophage Pilze). Einige Sporen dieser Pilze bleiben auch nach einer Passage des Gastrointestinaltraktes keimfähig (LARSEN et al., 1997). Sie keimen im Kot auf der Weide und bilden ein netzartiges Hyphengeflecht aus, mit dem sie auch dritte Larven von Trichostrongyliden fangen (LARSEN et al., 1996). So wird die Kontamination der Weidefläche mit infektiösen dritten Larven vermindert. Mikroskopische Studien zeigen, dass die so „gefangenen“
Larven als Nahrung genutzt werden. Bestimmte Strukturen des Hyphengeflechts wachsen regelrecht in die Larven ein und lysieren das Gewebe (GRØNVOLD et al., 1996a).
Literaturübersicht _____ _________________________________32 2.1.2. Strongyloididae
Der zur Ordnung der Rhabditida gehörende Zwergfadenwurm Strongyloides papillosus (Wedl 1856) ist der einzige, allerdings weltweit vorkommende Krankheitserreger aus dieser Familie bei Schafen und Ziegen. Es parasitiert lediglich Weibchen. Diese sind bis zu 6 mm lang, haben eine flache Mundhöhle, und der Ösophagus nimmt in der Ausdehnung ca. 1/3 der Körperlänge ein. Die Genitalöffnung liegt hinter der Körpermitte. Die bereits embryoniert ausgeschiedenen Eier entwickeln sich unter guten klimatischen Bedingungen innerhalb kurzer Zeit zu infektionsfähigen Larven, welche über dünne, ungeschützte Hautbezirke, wie z.B.
den Kronsaum oder den Zwischenschenkelspalt perkutan in den Wirt gelangen. Von hier vollziehen sie eine Blut-Lungen-Wanderung und gelangen über den Larynx in den Verdauungstrakt, wo sie sich zu Adulten entwickeln.
Ein Teil der ausgeschiedenen Eier entwickelt sich zur freilebenden Generation (Männchen ca. 0,8 mm, Weibchen ca. 0,9 mm). Nach kurzer Zeit legen diese Weibchen Eier, aus denen sich ausnahmslos infektionsfähige Larven entwickeln. Ein weiterer Infektionsweg ist die galaktogene Infektion. Präpartal wandern die Larven in das Euter und gelangen nach der Geburt mit der Milch in das Jungtier. Diese Larven vollziehen keine Blut-Lungen-Wanderung und die Präpatenz ist verkürzt. Bereits nach einer Woche können die Jungtiere Eier ausscheiden. Durch die Körperwanderung können unterschiedliche Schäden und Symptome am Tier auftreten. Im Bereich der Haut kann es zu Dermatitiden kommen, die Wanderstadien schädigen die Lunge, so dass es zu einer interstitiellen Pneumonie kommen kann, und im Verdauungstrakt schädigen die Adulten die Schleimhaut. Es kommt zu Absorptionsstörungen und in der Folge zu Diarrhöe (FONSECA et al., 1994).
Eine Diagnose erfolgt durch Flotation der Eier aus einer Kotprobe analog zu den Trichostrongyliden. In einer Kotkultur können relativ einfach die unbescheideten Larven mit dem typischen langen Ösophagus nachgewiesen werden (ECKERT, 1960; BÜRGER und STOYE, 1968).
Für die anthelminthische Therapie sind alle gegen die Trichostrongyliden wirksamen Medikamente einsetzbar. Abweichend ist zu beachten, dass die Tiere sich frühzeitig infizieren, entsprechend auch frühzeitig behandelt werden müssen. Zur Prophylaxe
____________________________________________________Literaturverzeichnis33 eignet sich eine gründliche Reinigung und Desinfektion von Jungtierställen vor dem Besatz.
2.1.3. Trichuridae
Zur Familie der Trichuridae gehören die bei Schaf und Ziege in Mitteleuropa vorkommenden Arten Trichuris ovis (Abildgaard 1795), Trichuris capreoli (Artjuch 1948) und Capillaria longipes (Ransom 1911) . Bei den Helminthen der Gattung Trichuris handelt es sich um bis zu 8 cm lange Würmer. Zwei Drittel nimmt der sehr dünne Anfangsabschnitt ein, welcher in der Schleimhaut des Dickdarm verborgen liegt, während das dicke Hinterende in das Lumen des Darmes hineinragt. Die Männchen haben nur ein Spikulum, die Vulva der Weibchen liegt am Übergang zwischen dem dünnen und dicken Teil. Die Form des Spikulums sowie die Vaginalstrukturen dienen der Artdifferenzierung.
Beim kleinen Wiederkäuer ist eine Infektion mit Helminthen der Gattung Trichuris recht häufig.
Die Entwicklung ist monoxen und erfolgt im Ei. Innerhalb von einigen Wochen entwickelt sich im Ei eine infektionsfähige Larve, welche nicht schlüpft. Das Ei wird mit der Nahrung vom Wirt aufgenommen. Hauptinfektionsquelle ist kontaminiertes Weidegras. Aus den aufgenommenen Eiern schlüpfen die ersten Larven, welche in die Schleimhaut des Dünndarms eindringen und sich dort über zweite und dritte Larvenstadien zu Adulten entwickeln. Durch die Lage der Parasiten zum Teil innerhalb der Schleimhaut kommt es zu Entzündungen des Dickdarms, in dessen Folge es zu Abmagerung und Exsikkose der Tiere kommen kann. Durch Blutverluste sind Anämien möglich.
Zum sicheren koproskopischen Nachweis der typischen, zitronenförmigen Eier ist die Verwendung einer Flotationsflüssigkeit mit einem spezifischen Gewicht von >1,2 nötig. Für eine Therapie verwendet man Präparate aus den Wirkstoffgruppen der Benzimidazole oder Avermectine.
Literaturübersicht _____ _________________________________34 2.1.4. Chabertidae
Die zur Familie der Chabertidae gehörenden Knötchenwurmgattungen, Chabertia und Oesophagostomum, sind im Vergleich mit den Trichostrongyliden mit bis zu 2 cm relativ große Endoparasiten, welche vornehmlich im Dickdarm parasitieren. Die Mundkapsel ist von zwei sägezahnartigen Blätterkränzen umgeben, die Spikula sind lang. Bei den kleinen Wiederkäuern kommen in Mitteleuropa hauptsächlich die Arten Chabertia ovina (Frabricius 1794) und Oesophagostomum venulosum (Rudolphi 1809) vor. REHBEIN et al. konnten 1996 für bayrische Schlachtschafe eine Befallsintensität von 63,2 % für Knötchenwürmer nachweisen. Hingegen war die Beffallstärke 1991 für Schlachtschafe in Hessen mit 13 % deutlich geringer (BENESCH, 1991).
Die Entwicklung entspricht der der Trichostrongyliden. Eine Infektion erfolgt hauptsächlich über kontaminiertes Gras auf der Sommerweide. Abweichend von den Trichostrongyliden überwintern die Knötchenwürmer jedoch nicht auf der Weide, und eine Kontamination erfolgt ausschließlich über ältere Ausscheider im Frühjahr. Die infektiösen dritten Larven entscheiden sich im Dünndarm und wandern in die Mukosa des Darms ein. Hier erfolgt die Häutung zur vierten Larve. Diese bleibt entweder über Monate inhibiert und reaktionslos in der Schleimhaut, oder sie bohrt sich in das Lumen des Darms und heftet sich als (prä-)adultes Stadium an die Schleimhaut des Zäkums (Oesophagostomum) oder des Kolons (Chabertia). Die Adulten heften sich mit der Mundkapsel an die Schleimhaut an und verdauen diese enzymatisch.
Dadurch kommt es zu Schleimhautschädigungen und Blutungen, in der Folge zu blutig-schleimigen Durchfällen, Abmagerung und Inappetenz (HIEPE, 2001).
Der Nachweis von Parasitenstadien im Kot erfolgt analog zu den Trichostrongyliden über eine Flotation der Eier und mikroskopische Detektion. Die Eier sind morphologisch nicht von denen der Trichostrongyliden zu unterscheiden. Erst eine Larvenkultur gibt Auskunft über das Vorhandensein von Knötchenwürmern. Die dritten Larven sind groß, bis zu 800 µm lang, bescheidet und besitzen einen langen Scheidenschwanz und 32 Mitteldarmzellen (BÜRGER und STOYE, 1968).
Eine Therapie erfolgt analog zu der Therapie der Trichostrongylidae mit Präparaten der Wirkstoffgruppen Benzimidazole, Avermectine, Pyrrimidine und Imidazothiazole.
____________________________________________________Literaturverzeichnis35 2.1.5. Dictyocaulidae und Protostrongylidae
2.1.5.1. Erreger
In den Lungen von kleinen Wiederkäuern parasitieren Gattungen der Familie der Dictyocaulidae (der große Lungenwurm) und Protostrongylidae (die kleinen Lungenwürmer). Aus der Gruppe der großen Lungenwürmer ist bei Schaf und Ziege lediglich die Art Dictyocaulus filaria (Rudolphi 1909) zu finden. Diese getrenntgeschlechtliche Wurmart ist zwischen 3 und 10 cm lang, weiß, rund und zwirnfadenstark. Die Mundhöhle der Dictyocaulidae ist klein und unbewaffnet. Die männlichen Adulten weisen eine Bursa auf, die von kurzen, stämmigen Rippen gestützt wird. Die beiden kuzen, dicken Spicula enden mit einer Kappe. Die Vulva der Weibchen befindet sich nahe der Körpermitte.
Von den zahlreichen Arten der kleinen Lungenwürmer lassen sich in Mitteleuropa bei Schafen und Ziegen hauptsächlich fünf Arten nachweisen (nach REHBEIN et al., 1996): Protostrongylus rufescens (Leuckart 1865), Protostrongylus brevispiculum (Mikacic 1940), Muellerius capillaris (Mueller 1889), Cystocaulus ocratus (Raillet und Henry 1907) und Neostrongylus linearis (Marotel 1913). Die Protostrongyliden sind kleine, haarfeine Nematoden mit fehlender Mundkapsel, die zwischen 0,5 und 9,5 cm lang sind. Die Farbe differiert von weiß bis braun. Die Bursa der Männchen ist sehr klein, zum Teil rudimentär.
2.1.5.2. Vorkommen
Lungenwürmer kommen weltweit bei kleinen Wiederkäuern vor. Selten tritt eine Art alleine auf, meistens liegen Mischinfektionen verschiedener Protostrongylidenarten bzw. kleine und große Lungenwürmer zusammen vor. Im Jahre 1977 wiesen 81,9 % aller in Österreich von EL-MOUKDAD et al. (1978) untersuchten Lungenhälften sowohl große als auch kleine Lungenwürmer auf. Hierbei waren 33,3 % mit 2 Arten, 12,05 % mit 3 Arten und 2,83 % mit 4 und 1,41 % mit 5 Arten infiziert. Es wurden in wechselnden Kombinationen die Arten Cystocaulus ocreatus, Dictyocaulus filaria, Muellerius capillaris, Neostrongylus linearis und Protostrongylus rufescens gefunden.
Literaturübersicht _____ _________________________________36
Bei der Verteilung der Arten liegt ein Nord-Süd Gefälle vor (EL-MOUKDAD et al., 1978). In Süddeutschland war die am häufigsten gefundene
Art Muellerius capillaris, in Norddeutschland (nach POHL, 1960) Muellerius capillaris und Protostrongylus rufescens. In Österreich war die am häufigsten vertretene Art Dictyocaulus filaria (EL-MOUKDAD et al., 1978).
In einer neueren Untersuchung von REHBEIN et al. (1996) konnten keine Lungenwürmer an 136 insgesamt untersuchten Schafen in Oberbayern festgestellt werden.
2.1.5.3. Epidemiologie
In der Epidemiologie unterscheiden sich die großen und kleinen Lungenwürmer stark. Bei den großen Lungenwürmern schlüpfen die ersten Larven bereits in der Trachea des Wirtes. Von dort gelangen die Larven mittels Zilienschlag der Trachealschleimhaut in den Bereich des Larynx und werden abgeschluckt oder ausgehustet. In der Außenwelt entwickeln sie sich bei günstigen klimatischen Bedingungen innerhalb weniger Tage zu infektionsfähigen dritten Larven. Diese werden zumeist passiv mittels Geohelminthen, Käfer, Regen oder koprophilen Pilzen über die Weide verteilt und von den Tieren bei der Nahrungsaufnahme mit aufgenommen. Die Larven dringen auch in Regenwürmer ein und bleiben in diesen Tieren inaktiv, bis sie von einem kleinen Wiederkäuer aufgenommen werden. Bei feuchtwarmem Sommerwetter sind die Larven 3 Monate in der Außenwelt überlebensfähig, bei Trockenheit sinkt dieser Wert.
Die Larven von Dictyocaulus filaria überwintern nicht auf der Weide. Eine erneute Infektion im Frühjahr erfolgt durch im Vorjahr infizierte Ausscheider. Im Tier dringen die Larven in die Mesenteriallymphknoten ein und häuten sich dort zur vierten Larve.
Diese gelangt mit Blut- und Lymphstrom in die Lunge. Hier bohren sich die Larven in die Alveolen ein. Die Ansiedelung adulter Dictyocaulus filaria erfolgt im Bereich der Bronchien. Bei kühlen klimatischen Bedingungen findet im Wirt zum Teil keine Weiterentwicklung zu Adulten statt. Erst im nächsten Frühjahr setzen diese Larven ihre Entwicklung fort (Hypobiose).
Die Tiere entwickeln eine Immunität gegen Dictyocaulus filaria, die aber nicht vor patenten Infektionen schützt.
____________________________________________________Literaturverzeichnis37 Bei den Protostrongyliden verläuft die Entwicklung anders. Die ersten Larven schlüpfen ebenfalls in der Trachea und werden bei Husten abgeschluckt. Im Kot sind die Larven mehrere Monate überlebensfähig. Sie bohren sich in den Fuß von Nackt- und Gehäuseschnecken ein und entwickeln sich in der Schnecke zur infektionsfähigen dritten Larve. Eine Infektion der Wirte erfolgt über die Schneckenaufnahme. Nach Aufnahme der Larven durch die Wirte erfolgt die Entwicklung zum Adulten analog zu der Entwicklung von Dictyocaulus filaria. Im Wirt können die kleinen Lungenwürmer bis zu 6 Jahre patent bleiben. Es entsteht keine Immunität.
2.1.5.4. Pathogenese und Klinik
Bei einer Infektion mit Dictyocaulus filaria kommt es durch die Anheftung der Würmer an die Schleimhaut der Bronchien zu Reizungen und Entzündungen der Schleimhaut. Bei einer hohen Anzahl von Adulten in den Bronchien kann es durch das Verlegen der luftführenden Wege mit Wurmknäueln und Exsudat zu Emphysemen besonders in den peripheren Lungenbezirken kommen (GEISEL und BOCH, 1977). Die Tiere zeigen ein gestörtes Allgemeinbefinden, sind inappetent und magern ab. Häufig kommt es zu einer sekundären Besiedlung der Lunge mit Bakterien und in der Folge zu katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonien mit Nasenausfluss und Fieber (BOSTEDT und DEDIÉ, 1996).
Eine Infektion mit kleinen Lungewürmern verläuft bei Schafen und Ziegen zumeist subklinisch. Die Tiere zeigen eine verminderte Mast und bei der Sektion bzw.
Fleischbeschau können subpleural herdförmige, entzündliche Lungenveränderungen nachgewiesen werden. Hierbei unterscheidet man Wurmknoten und Brutherde.
Wurmknoten sind meist abgestorbene, sterile adulte Würmer, die von entzündlichem Gewebe umgeben sind. Unter Brutknoten versteht man eine entzündliche Gewebsreaktion um Eier, Larven und geschlechtsreife Parasiten. Diese sind nach Lage und Morphologie arttypisch (GEISEL und BOCH, 1977).
Literaturübersicht _____ _________________________________38 2.1.5.5. Diagnose
Eine Diagnose des Lungenwurmbefalls kann koproskopisch mittels eines Auswanderungsverfahrens erfolgen (BAERMANN, 1917; WETZEL, 1930). Die ersten Larven weisen morphologische, arttypische Besonderheiten auf, was eine Differenzierung zu Erdnematoden und ersten Larven von Magen-Darm-Strongyliden ermöglicht. Dictyocaulus filaria besitzt am Kopf einen hervorstehenden protoplasmatischen Knopf, das Hinterende ist stumpf. Die verschiedenen Arten der Protostrongyliden besitzen ein charakteristisches, unterschiedlich geformtes Schwanzende. Außerdem ist laut GEISEL und BOCH (1977) auch eine Differenzierung anhand des Sektionsbildes der Lunge möglich. Nach einer Kotkultur lassen sich die doppelt bescheideten dritten Larven von Dictyocaulus filaria gut mikroskopisch identifizieren.
2.1.5.6. Bekämpfung
Beim kleinen Wiederkäuer sind alle Arten von Lungenwürmern gegen dieselben Anthelminthikaklassen empfindlich wie die Magen-Darm-Strongyliden. Allerdings sind die nicht in den Bronchien lebenden kleinen Lungenwürmer schwerer zu therapieren, und es müssen höhere Dosierungen angewendet werden.
Eine Prophylaxe mittels Weidemanagement ist aufgrund der Epidemiologie nur bei den großen Lungenwürmern sinnvoll. Aufgrund der kurzen Entwicklungszeit der Larven ist ein Umtreiben von empfänglichen Tieren alle 14 Tage anzuraten.
Eine Bekämpfung der Schnecken zur Einschränkung der Verbreitung der kleinen Lungenwürmer ist aufgrund der großen Zahl und der weiten Verbreitung der Schnecken nicht praktikabel.
____________________________________________________Literaturverzeichnis39 2.2. Nematophage Pilze
Nematopathogene Pilze sind eine sehr artenreiche Gruppe von Mikropilzen mit mehr als 150 beschriebenen Arten (BARRON, 1977). WALLER und LARSEN (1993) teilten 1993 die nematopathogenen Pilze auf der Grundlage der Arbeit von BARRON (1977) in drei Gruppen ein. Die erste Gruppe wird gebildet von den nematophagen Pilzen, die Nematodenlarven mittels unterschiedlicher dreidimensionaler Strukturen „fangen“
und deren Hyphen dann durch die Kutikula in die Larve eindringen und diese so zerstören. Die zweite Gruppe wird gebildet von den endoparasitischen Pilzen. Die Sporen dieser Pilze werden von den Nematoden mit der Nahrung aufgenommen. Im Wirt keimen die Pilze aus und zerstören diesen von innen. Die letzte Gruppe wird gebildet von Ei-zerstörenden Pilzen. Diese wachsen in Nematodeneier ein und zerstören sie (NORDBRING-HERTZ et al., 1988). Auch GRØNVOLD et al. (1996a) übernahmen diese Systematik.
Im folgenden wird hauptsächlich auf die parasitologisch am intensivsten untersuchte Gruppe der nematophagen Pilze eingegangen. Hierbei wird insbesondere die in diesem Versuch eingesetzte Art Duddingtonia flagrans berücksichtigt. Andere Arten dieser Gruppe werden in Abschnitt 2.2.6. beschrieben. Es wurden wenige Untersuchungen zu den anderen beiden Gruppen publiziert, und die Ergebnisse sind noch nicht vergleichbar mit den Erfolgen der nematophagen Pilze (LARSEN, 2000).
2.2.1. Vorkommen und Morphologie
Nematophage Pilze kommen weltweit vor. Sie existieren in verschiedenen Habitaten, können aber besonders zahlreich auf nährstoffreichen Substraten wie z.B.
Komposterde oder Kot angetroffen werden (WALLER und FAEDO, 1993; LARSEN, 2000). Es konnten in Ländern unterschiedlichster Klimazonen verschiedene Isolate einer Art nachgewiesen werden. So gibt es Berichte über nematophage Pilze aus Australien, den Fiji-Inseln, Indien, Malaysia, sowie Nord- und Mitteleuropa (LARSEN et al., 1994; FAEDO et al., 1997; MANUELI et al., 1999; SANYAL, 2000;
CHANDRAWATHANI et al., 2002; GRØNVOLD et al., 1988, LARSEN et al., 1991;
PELOILLE et al., 1991).
