Infektionen mit Helminthen kommen weltweit vor und verursachen bei kleinen Wiederkäuern neben den klassischen klinischen Symptomen wie Inappetenz und Diarrhöe auch bereits bei subklinischen Infektionen schlechte Mastentwicklung sowie Woll- und Milchverluste. Nach erfolgter Therapie erreichen die Tiere nur langsam wieder das Leistungsniveau nicht erkrankter Vergleichstiere. Dies führt zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Die Ansteckung erfolgt zumeist auf der Weide über mit infektiösen dritten Larven kontaminiertes Futter. Eine Bekämpfung der Helminthen ist notwendig, und diese erfolgte in den letzten Jahrzehnten meist mittels prophylaktischer/metaphylaktischer Gabe von Anthelminthika.
Die durch den regelmäßigen Gebrauch von Anthelminthika sprunghaft gestiegene Resistenzrate von Helminthen vor allem beim kleinen Wiederkäuer macht es nötig, nach alternativen Bekämpfungsstrategien zu suchen. Eine biologische Möglichkeit, neben Weidemanagement oder wechselnder Beweidung durch verschiedene Tierarten, ist die Fütterung von nematophagen Pilzen u. a. der Gattungen Athrobotrys und Duddingtonia. Diese bilden im Kot ein netzartiges Hyphengeflecht, in welchem sich die infektiösen Larven verfangen und dann von den Pilzen auf unterschiedliche Art verdaut werden. Somit kann der Infektionsdruck mit dritten Larven auf der Weide gesenkt werden. Vor allem die Art Duddingtonia flagrans ist durch ihre dickwandigen Chlamydosporen besonders geeignet, die Passage des Gastrointestinal-Traktes zu überstehen und eignet sich somit sehr gut zur einfachen Applikation mit dem Futter. In der hier vorgelegten Studie wurden in einem norddeutschen Betrieb Ziegen und Schafe drei Monate lang mit D. flagrans gefüttert und der Verlauf der Ei- und Larvenausscheidung sowie der Verlauf der Larvenentwicklung auf den Weideflächen über eine gesamte Weidesaison hin untersucht.
Ziel der regelmäßigen Kot- und Blutuntersuchungen war es, herauszufinden, inwieweit die Fütterung von D. flagrans die Belastung der Weiden mit infektiösen MDS-Larven und somit die Infektion der Weidetiere beeinflusst.
Einleitung 14 _______________________________________
Ferner sollte eine molekularbiologische Untersuchungsmethode entwickelt werden, welche eine direkte quantitative und qualitative Analyse von Feldproben auf ihre Larvenzahlen und Gattungszusammensetzungen ermöglicht.
____________________________________________________Literaturverzeichnis15 2. Literaturübersicht
2.1. Infektion mit Nematoden
Beim Wiederkäuer sind nach Anzahl der existierenden Arten, der Befallszahl (Anzahl der infizierten Tiere) und –stärke (Anzahl von Adulten einer Art in einem Tier) sowie der Pathogenität vor allem Rundwürmer aus der Klasse Nematoda die wichtigsten Helminthen. Besiedelt werden vornehmlich Gastrointestinal-Trakt (GIT) mit Vertretern der Familien der Trichostrongylidae, Strongyloididae, Trichuridae und Chabertiidae sowie Lunge mit den Familien der Dictiocaulidae und Protostrongylidae.
2.1.1. Trichostrongylidae 2.1.1.1. Erreger
Die wichtigsten Arten der Familie der Trichostrongylidae sind die Gattungen Haemonchus, Trichostrongylus, Teladorsagia, Ostertagia, Cooperia und Nematodirus, welche im Labmagen und Dünndarm parasitieren.
Bei den Gattungen der Trichostrongylidae handelt es sich um Bursanematoden, bei denen beide Geschlechter keine oder eine sehr kleine Mundkapsel aufweisen. Die Weibchen sind immer größer als die Männchen und die Größe der verschiedenen Gattungen liegt zwischen 5 und 30 mm. Beide Geschlechter besitzen auf der Kutikula Längsgrate und Querrillen, welche die Synlophe bilden. Diese ist artspezifisch und lässt eine Differenzierung der Weibchen zu (LICHTENFELS et al., 1988).
Die Weibchen, deren Vulva im hinteren Körperdrittel liegt, besitzen eine doppelte Geschlechtsanlage mit zwei Ovarien und zwei Uteri. Der Ovijektor wird von zwei Infundibula, zwei Sphinkteren, einem Vestibulum und einer Vagina gebildet.
Die Bursa der Männchen besteht aus 3 Lappen (2 breiten Seitenlappen, die über die Körperbreite hinausgehen und einem kleineren Dorsallappen). Diese Lappen werden von 5 Rippen gestützt. Des weiteren besitzen die Männchen 2 Spikula, welche spiegelbildlich symmetrisch angeordnet sind. Die Männchen lassen sich anhand der gattungsspezifischen Unterschiede leicht differenzieren (GIBBONS et al., 1982):
Nematodirus haben lange Spikula, welche über den Körper hinausragen, der Dorsallappen der Gattung Haemonchus ist asymmetrisch.
Literaturübersicht _____ _________________________________16
Teladorsagia besitzen akzessorische Lappen am Dorsallappen, Trichostrongylus besitzen ein Gubernakulum, aber kein Telamon, bei der Gattung Cooperia verhält es sich umgekehrt. Das Gubernakulum ist ein unpaares Organ, das den Spikula als Gleitschiene dient. Der Telamonapparat ist eng mit der Bursa copulatrix verbunden, seine Funktion ist unbekannt.
Die in Mitteleuropa dominierenden Arten bei Schafen und Ziegen sind Haemonchus contortus, der rote Magenwurm (Rudolphi 1803), der kleine Magenwurm Trichostrongylus axei (Cobbold 1871), Trichostrongylus colubriformis (Giles 1892), Teladorsagia circumcincta (Stadelmann 1894), Cooperia curticei (Giles 1892), sowie Nematodirus filicollis (Rudolphi 1803) und Nematodirus battus (Crofton und Thomas 1951).
2.1.1.2. Vorkommen
Die Trichostrongylidae kommen weltweit bei Wiederkäuern vor (BENESCH, 1993;
COX et al., 1962; REHBEIN et al., 1996), besiedeln vorwiegend den Labmagen und den Dünndarm und treten meistens als Mischinfektion auf.
BENESCH (1993) konnte 1993 für Schafe in Hessen folgende Befallsextensitäten aufzeigen: Der vorherrschende Vertreter der Trichostrongylidae war Teladorsagia circumcincta mit 60,0 %. Haemonchus contortus konnte bei 46,2 % aller untersuchten Tiere nachgewiesen werden, Trichostrongylus axei zu 23,8 %, andere Trichostrongylusarten zu 38,5 %, Nematodirus spp. mit 43,1 % und Cooperia spp. mit 23,8 %. Ähnliche Zahlen zeigten REHBEIN et al. (1996).
2.1.1.3. Lebenszyklus
Die Adulten der Trichostrongyliden besiedeln den Labmagen und den Dünndarm. Im Labmagen von kleinen Wiederkäuern findet man vor allem die Gattungen Haemonchus, Ostertagia und die Art Trichostrongylus axei, im Dünndarm die Gattungen Cooperia und Nematodirus sowie die Gattung Trichostrongylus spp.
____________________________________________________Literaturverzeichnis17 (ECKERT und BÜRGER, 1979; BENESCH, 1993; REHBEIN et al., 1996). Die Weibchen legen je nach Art unterschiedlich viele, bereits gefurchte Eier (McKENNA, 1997) in das Darmlumen ab, welche mit dem Kot in die Außenwelt gelangen. Hier entwickelt sich, abhängig von den äußeren klimatischen Umständen, im Ei die erste Larve, welche aktiv das Ei verlässt und sich im Kot weiterentwickelt. Als Nahrungsgrundlage dienen den Larven Kotbestandteile (PROSL, 1986). Sie häutet sich zur zweiten Larve, welche ebenfalls im Kot lebt und sich von diesem ernährt. Die Häutung zur dritten Larve erfolgt ohne Abstreifen der Kutikula, so dass eine bescheidete Larve entsteht. Diese nimmt keine Nahrung mehr auf, sondern lebt von eingelagerten Reservestoffen und muss nun vom Wirt oral aufgenommen werden.
Bei der Gattung Nematodirus vollzieht sich die Entwicklung bis zur dritten bescheideten Larve im Ei. Erst diese schlüpft und muss dann analog zu den übrigen Gattungen von einem Wirt aufgenommen werden. Im Labmagen wird die schützende Scheide abgestreift und die Larve wandert aktiv in den Zielorganen (Labmagen oder Dünndarm) in die Drüsenlumina, bzw. in die Schleimhautkrypten ein, wo sie sich innerhalb weniger Tage zur vierten Larve häutet. Die vierte Larve häutet sich und die Adulten parasitieren auf der Schleimhautoberfläche. Die Präpatenz beträgt zwischen 2 und 3 Wochen (ECKERT und BÜRGER, 1979; PROSL, 1986), bei Nematodirus liegt die Präpatenz bei 21-26 Tagen.
2.1.1.4. Epidemiologie
Die Entwicklung vom Ei zur infektiösen dritten Larve dauert unterschiedlich lange. Sie ist abhängig von den äußeren Umweltbedingungen und dauert mindestens 4-7 Tage (BÜRGER et al.,1966), bei Kälte und Trockenheit länger (GIBSON, 1971;
GOLDENSTEIN, 1978). Eine Ausnahme bildet hiervon die Gattung Nematodirus.
Hier dauert die minimale Entwicklungszeit mehrere Wochen, bei der Spezies Nematodirus battus ist ein Kältereiz durch den Winter obligat, so dass eine Kontamination der Weiden mit infektiösen Larven erst im nächsten Frühjahr erfolgt.
Die dritten Larven verbreiten sich sowohl aktiv durch Eigenbewegung als auch passiv über die Weide. Zur passiven Verbreitung tragen verschiedene Vektoren bei.
Regentropfen schwemmen die Larven vom Kot auf die Weide, durch die Passage
Literaturübersicht _____ _________________________________18 kleiner Lebewesen (wie z.B. Regenwürmer und Schnecken) werden die Larven über
die Weide verteilt. Die Kothaufen werden von Tieren zertreten und die Larven so verbreitet. Sowohl BAUER et al. (1988) als auch HERTZBERG (2000) bezeichnen den Zukauf bereits infizierter Tiere als eine weitere Möglichkeit zur Infektion einer Herde mit Trichostrongyliden.
Eine Ansteckung der Tiere erfolgt vorwiegend auf der Weide durch kontaminiertes Gras, nur sehr selten im Stall.
Auf der Weide sind die dritten Larven in der Lage zu überwintern (ROSE, 1965;
BÜRGER et al., 1966; GIBBS, 1979). Auf diese Weise und durch die vermehrte Ausscheidung der Muttertiere nach der Geburt (periparturienter Anstieg) werden empfängliche Jungtiere infiziert (GIBSON, 1971).
Nach THOMAS und BOAG (1973) gibt es für die Larvenanzahl auf der Weide über den Sommer drei Gipfel. Den ersten im Mai/Juni, verursacht durch überwinterte dritte Larven, den zweiten im Juli/August durch die Ausscheidung der Muttertiere und Selbstansteckung von Jungtieren untereinander und einen weiteren im September/Oktober durch die Selbstansteckung der Tiere untereinander.
Mit der Nahrung aufgenommene Larven haben zwei Möglichkeiten der Entwicklung.
Sie entwickeln sich entweder zu Adulten, oder sie unterbrechen im Wirt die Entwicklung (Hypobiose) und verbleiben als Dauerstadien über einen längeren Zeitraum in der Schleimhaut (ARMOUR und BRUCE, 1974; ARMOUR, 1980;
ECKERT und BÜRGER, 1979 und EYSKER, 1997). Als auslösende Faktoren für die Hypobiose werden die Immunitätslage der Wirtstiere, das Herdenmanagment (EYSKER, 1997) und vor allem der Einfluss niedriger Umgebungstemperaturen auf dritte Larven diskutiert (ARMOUR und BRUCE, 1974).
1980 beschrieb ARMOUR drei Haupteinflüsse für das Entstehen von Helmintheninfektionen: Der erste ist die Anzahl infektionsfähiger Larven pro Fläche, welche abhängig ist von der Reproduktionsrate der Erreger, der Immunlage der Wirte (ECKERT at al., 1968), dem Managment (wie z.B. Besatzdichte) (GIBSON, 1971) und der Verbreitung über die Weide.
Der zweite Einflussfaktor ist die Empfänglichkeit der Herde. So steigt während der Trächtigkeit und Laktation die Empfänglichkeit der Muttertiere für eine Parasitose an
____________________________________________________Literaturverzeichnis19 (GIBBS, 1979; PROSL, 1986). Ebenfalls reagiert eine Herde bei Stress, wie z.B.
Umstallung oder Defiziten in der Ernährung. Auch der Einsatz von Medikamenten, wie z.B. Glucokortikoiden, kann das Angehen einer Helmintheninfektion begünstigen (MAINGI et al., 1996).
Als dritter Weg ist das Einbringen einer empfänglichen Herde in ein kontaminiertes Areal genannt. Hier spielen vor allem die Empfänglichkeit juveniler Tiere sowie genetische Faktoren verschiedener Rassen eine Rolle.
2.1.1.5. Pathogenese und Klinik
Durch eine Infektion des Verdauungskanals mit Helminthen kommt es bei Wiederkäuern zu einer Störung der Digestion, wobei die Stärke der Symptome abhängig ist vom Alter des Tieres, dessen Immunitätslage, der Pathogenität der infizierenden Art und der Infektionsdosis.
Im Labmagen verursachen die Larven eine Zerstörung der Drüsen und der Salzsäure produzierenden Belegzellen. Hierdurch kommt es zu einem Anstieg des pH–Wertes im Labmagen auf bis zu pH 7. Das Proenzym Pepsinogen wird in saurem Milieu (bei einem pH-Wert von ca. 2) deutlich schneller zu Pepsin umgewandelt als bei höheren pH-Werten. Folglich sinkt die Fähigkeit Proteine zu verdauen. Der steigende pH–Wert selbst wirkt sich ebenfalls negativ auf die Proteinverdaulichkeit aus, da bei steigendem pH-Wert die Denaturierung der Proteine abnimmt. Die Tiere magern ab.
Durch den steigenden pH-Wert sinkt der bakteriostatische Effekt der Magensäure (ARMOUR, 1974). Es kann zu einer Dysbiose kommen, in deren Folge die Tiere inappetent werden, was ebenfalls zur Abmagerung führt. In vielen Fällen ist eine Diarrhöe zu beobachten.
Die Zerstörung der Hauptzellen durch die Nematoden führt ausserdem direkt zu einer verminderten Produktion von Pepsinogen, was ebenfalls einen negativen Einfluss auf die Proteinverdaulichkeit hat.
Zerstörte Zellen und Drüsen werden durch undifferenzierte Zellen ersetzt, und die Integrität der Oberfläche geht verloren. Aus dem umgebenden Gefäßsystem werden Makromoleküle, wie z.B. Albumine, in den Labmagen verloren (COOP et al., 1979),
Literaturübersicht _____ _________________________________20 andererseits tritt Pepsinogen in das Gefäßsystem über. Es kommt zu einer
Hypoalbuminämie und zu einem erhöhten Pepsinogenspiegel im Serum.
Bei hämatophagen Helminthen, besonders Haemonchus contortus, kommt es zu einem Abfall des Hämatokritwertes und den klinischen Symptomen einer Anämie (ROSS und TODD, 1965).
Der steigende pH-Wert bewirkt eine vermehrte Produktion von Gastrin, einem Enzym, das einen Einfluss auf die Motilität des Gastrointestinal-Traktes hat. Die Motilitätsabnahme vor allem der Vormägen kann zu einer Inappetenz der betroffenen Tiere führen (SCHILLHORN VON VEEN, 1988).
Bei den im Dünndarm parasitierenden Helminthen kommt es durch die Einwanderung der Larven in die Krypten der Schleimhaut zur Zerstörung der Schleimhautstruktur. Die Zotten sind verkürzt, und die Bürstensäume gehen verloren, wodurch es zu einer Verringerung der Resorptionsoberfläche kommt (COOP et al., 1979). Nachwachsende Zellen aus den Krypten gelangen wesentlich schneller an die Zottenoberfläche als bei einem nicht infizierten Tier und sind dementsprechend unausgereifter. Die Resorptionsfähigkeit der Schleimhaut sinkt, und die betroffenen Tiere zeigen Abmagerung und Durchfall.Es kommt zu einem zahlenmäßigen Anstieg der Becherzellen und damit zu einer vermehrten Muzinproduktion, was ebenfalls Diarrhöe zur Folge hat (COOP et al., 1979).
Klinisch lassen sich bei befallenen Tieren folglich Inappetenz, Diarrhöe, Abmagerung bis zur Kachexie, Anämie, Hypoalbuminämie und Ödeme nachweisen (ECKERT et al., 1968; COOP et al., 1979; ECKERT und BÜRGER, 1979; STEEL et al., 1982;
BEHRENS, 2001). Starke Infektionen können zum Tod der Wirtstiere führen.
Alle Symptome führen zu wirtschaftlichen Einbußen durch verminderte Mastzunahmen (HIEPE und ZIMMERMANN, 1966; STEEL et al., 1982), verringerte Milchleistung, herabgesetzte Fertilität (ZINSSTAG et al., 1997) und Wollmängeln hinsichtlich Qualität und Quantität (HIEPE und ZIMMERMANN, 1966; STEEL et al., 1982).
____________________________________________________Literaturverzeichnis21
2.1.1.6. Diagnose
2.1.1.6.1. Klassische Diagnostik
Beim kleinen Wiederkäuer erlauben bereits gehäuftes Auftreten von Diarrhöen, schlechte Herdenentwicklung und die sogenannten Flaschenhalsödeme den Verdacht auf eine Nematodeninfektion (HIEPE, 2001).
Nach Ablauf der Präpatenz ist es möglich, die Eier von Nematoden des Gastrointestinal-Traktes durch Flotationsmethoden nachzuweisen. Hierbei wird der Kot in einer Flotationsflüssigkeit, wie z.B. gesättigter NaCl oder ZnSO4, mit einem spezifischen Gewicht von >1,18 suspendiert und nach einer gewissen Flotationszeit die Eier mittels einer Öse von der Oberfläche abgenommen. Sie können dann unter dem Mikroskop ihrer Morphologie entsprechend differenziert werden.
Um eine Aussage über die quantitative Eiausscheidung der Tiere machen zu können, bedient man sich des McMaster-Verfahrens (GORDEN und WHITLOCK, 1939) z.B. in der Modifikation von WETZEL (1951) und SCHMIDT (1971). Hierbei wird eine definierte Menge Kot mit einer definierten Menge Flotationsflüssigkeit vermischt und ein Teil dieser Suspension in einer Kammer mit bekanntem Volumen unter dem Mikroskop ausgezählt. Ein Rückschluss von der Eizahl pro Gramm Kot auf die Wurmbürde im Tier ist aber bei den häufig auftretenden Mischinfektionen nicht möglich (McKENNA, 1997).
Die Eier der Magen-Darm-Strongyliden sind alle, mit Ausnahme der Gattung Nematodirus, 70-80 µm lang, dünnschalig, eiförmig und enthalten Furchungszellen.
Eine Gattungs- oder Artdifferenzierung ist mikroskopisch anhand der Eier nicht möglich. Die Eier von Nematodirus sind ca. 120 µm groß, dickschalig und enthalten wenige, große Furchungskugeln. Eine Abgrenzung dieser Gattung zu den anderen Magen-Darm-Strongyliden ist möglich. Weiterhin ist eine Identifikation der Art Nematodirus battus anhand der Eimorphologie eindeutig möglich, da die Eier dieser Art, verglichen mit den anderer Nematodirus-Arten, kleiner sind und parallele Seitenwände besitzen (BAUER, 1989).
Literaturübersicht _____ _________________________________22 Eine Gattungsunterscheidung ist bei den Magen-Darm-Strongyliden nur durch eine
mikroskopische Untersuchung dritter Larven möglich. Hierfür wird Kot für 8 Tage bei 28 °C inkubiert. Die Larven werden im Anschluss daran über ein Auswanderverfahren gewonnen. Die Differenzierung erfolgt anhand spezifischer Merkmale unter dem Mikroskop (BÜRGER und STOYE, 1968; ECKERT, 1960) und erfordert vom Untersuchenden ein hohes Maß an Erfahrung (GEORGI und McCULLOCH, 1989; GASSER, 1994).
Für eine Artdiagnose ist es nötig, Adulte zu gewinnen. Diese können dann unter dem Mikroskop differenziert werden. Bei einer alleinigen mikroskopischen Differenzierung der Arten anhand der Strukturen und Maße der Eier konnten Teladorsagia circumcincta zu 49,5 %, Trichostrongylus axei zu 76 %, Cooperia curticei zu 60 % und Haemonchus contortus zu 67 % wiedergefunden werden. Lediglich die Gattung Nematodirus spp. erreichte eine Erkennungsrate von 100 % (GEORGI und McCULLOCH, 1989). SOMMER (1996) erreichte bei einer digitalen Bildanalyse der Eier Erkennungsraten zwischen 76,3 % für Ostertagia ostertagi und 90,8 % für Cooperia oncophora.
Die bereits oben beschriebenen Blutwertveränderungen bei einer Infektion mit Nematoden können ein Hinweis auf eine bestehende Infektion sein. Die wichtigste Veränderung ist der erniedrigte, durch hämatophage Spezies verursachte Hämatokritwert. Bei der Untersuchung wird gerinnungsgehemmtes Blut zentrifugiert und so der Zellbestandteil des Blutes vom flüssigen Rest getrennt. Anhand von Messskalen kann der Hämatokrit (in l/l) abgelesen werden. Weitere wichtige Blutwertveränderungen bei einer Infektion mit Trichostrongyliden sind der steigende Pepsinogenspiegel und der sinkende Albuminspiegel. Das Pepsinogen kann mit der Methode von BERGHEN et al. (1987) bestimmt werden und wird in mU Tyrosin/µl angegeben.
HERTZBERG et al. (1993) beschreibt die Endoskopie des Labmagens als sinnvolle Ergänzung der Diagnostik. Dies ist vor allem im Bereich der Versuchstierkunde wichtig, um die Anzahl der Versuchstiere zu verringern.
____________________________________________________Literaturverzeichnis23 Weiterhin wurde als serologische Methode der ELISA beschrieben. Hierbei werden Antigene des Nematoden, die aus Adulten oder Larven gewonnen wurden, mit dem Serum infizierter Tiere auf Mikrotiterplatten inkubiert. Durch Zugabe eines Konjugates können die vom Tier gebildeten Antikörper an die entsprechenden Antigene binden.
Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass eine hohe Infektionsdosis als Schwellenwert nötig ist, um eine Antikörperbildung im Tier zu stimulieren (BERGHEN et al., 1993).
2.1.1.6.2. Molekularbiologische Diagnostik
Die Schwierigkeiten, einzelne Trichostrongylidengattungen anhand morphologischer Kriterien verschiedener Entwicklungsstadien (Eier oder Larven) zu identifizieren, wurden bereits dargestellt. Neben der Erfahrung durch den Untersucher benötigen Larvenkulturuntersuchungen auch eine gewisse Zeitspanne, bis erste Ergebnisse vorliegen. Die Möglichkeit, molekukargenetische Methoden einzusetzen, um schnelle und präzise Aussagen über die Art einer Infektion treffen zu können, bietet eine gute Alternative zur herkömmlichen klassischen Diagnostik.
Bereits 1994 konnten CHRISTENSEN et al. genusspezifische Reaktionen beim Screening von genomischen DNA-Banken von Ostertagia ostertagi, Haemonchus placei, Cooperia oncophora und Oesophagostomum radiatum beobachten. Hierbei wurde genomische DNA von den genannten Spezies aus Adulten und aus Eiern isoliert und mit radioaktiv markierter homologer und heterologer DNA im Southern Blot, sowie im Dot Blot durchgemustert. Nicht kreuzreagierende Klone wurden für weitere Untersuchungen mit genomischer DNA eingesetzt, und es konnte nachgewiesen werden, dass die Klone genusspezifisch binden. Auch eine Untersuchung mit DNA aus Eiern war erfolgreich.
Eine speziesspezifische Diagnose gelangen GASSER et al. (1994) mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) und einem Restriktionsfragmentlängen-polymorphismus (RFLP). Es wurde der zweite interne transkribierte Spacer (ITS-2) der einzelnen Spezies mit Hilfe der PCR amplifiziert und anschließend mit Restriktionsenzymen verdaut. Die unterschiedlichen Fragmente wurden auf einem Agarosegel voneinander getrennt und detektiert. Auf diese Weise konnten die Arten Cooperia oncophora, Trichostrongylus colubriformis, Trichostrongylus axei,
Literaturübersicht _____ _________________________________24 Trichostrongylus vitrinus, Teladorsagia circumcincta und Haemonchus contortus
identifiziert werden.
Weiter verbanden GASSER et al. (1997) die ITS-2 PCR mit einer SSCP-Analyse (Einzelstrangkonformationspolymorphismus). Hierbei wurde der amplifizierte Abschnitt der DNA denaturiert und auf einem Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Dies ergab spezifische Bandenmuster für die einzelnen untersuchten Spezies.
Auch ZARLENGA et al. (1994) gelangen die Differenzierung von Haemonchus contortus und Haemonchus placei mittels sequenzspezifischer Primer.
Mittels sequenzspezifischer Primer gelang 1999 die Identifizierung von verschiedenen Trichostrongylidenspezies (SCHNIEDER et al., 1999; HEISE, 1999).
Es konnte nachgewiesen werden, dass die Unterschiede der ITS-2 Sequenzen verschiedener Arten einer Gattung nur gering variieren (zwischen 0,83 und 2,60 %), im Gegensatz hierzu variieren die Sequenzen zwischen verschiedenen Gattungen zwischen 20-40 %. Es konnte DNA sowohl aus Eiern als auch aus Larvalstadien detektiert werden. Die Sensitivität für einzelne Gattungen war sehr hoch. Es konnten DNA-Mengen nachgewiesen werde, welche unter der DNA-Menge eines Eies lagen.
Alle diese Methoden haben den Nachteil, dass sie für ihre Durchführung mehrere Schritte benötigen, und somit sehr arbeitsaufwendig sind. Die Gefahr von Kontaminationen ist hoch (ZARLENGA und HIGGINGS, 2001). Sowohl falsch positive als auch falsch negative Resultate sind möglich. Zudem ist eine Quantifizierung nur bedingt möglich.
Die Echtzeit-PCR oder Real-time-PCR ist in der Lage, diese Nachteile zu umgehen (BUSTIN, 2000; HELPS et al., 2001). Sie bildet ein geschlossenes System, kann in einem Arbeitsschritt durchgeführt werden und bietet durch spezielle Software die Möglichkeit, die Ausgangsmengen an DNA zu ermitteln (BUSTIN, 2000;
HELPS et al., 2001). Grundlage der Quantifizierung ist die Markierung der DNA über Fluoreszenzfarbstoffe oder farbstoffmarkierte, sequenzspezifische Sonden. Die Farbstoffe lagern sich in die doppelsträngige DNA ein oder binden an die Zielsequenz. Anhand der Stärke des emittierten Lichts kann auf die Menge der Ziel-DNA geschlossen werden (ZARLENGA und HIGGINS, 2001). Bei einer solchen PCR ist der Thermocycler für die Amplifizierung der Ziel-Sequenz mit einem
____________________________________________________Literaturverzeichnis25 Fluoreszensdetektor gekoppelt. Der Fluoreszensdetektor liest die von den Proben emittierten Lichtsignale einer bestimmten Wellenlänge und eine spezielle Software analysiert anhand der Stärke des emittierten Lichts die Substratmengen. Besonders spezifisch sind sogenannte TaqMan®-Minor-groove-binder-Sonden (MGB-Sonden), welche aus komplementären Oligonukleotiden zur Ziel-DNA bestehen. An dieses Oligonukleotid sind zwei Farbstoffe gebunden, die Reporter und Quencher genannt werden. Während der PCR wird der Reporter zur Fluoreszenz angeregt, jedoch bei räumlicher Nähe zu dem Quencher wird dieses Licht unmittelbar absorbiert. Im
____________________________________________________Literaturverzeichnis25 Fluoreszensdetektor gekoppelt. Der Fluoreszensdetektor liest die von den Proben emittierten Lichtsignale einer bestimmten Wellenlänge und eine spezielle Software analysiert anhand der Stärke des emittierten Lichts die Substratmengen. Besonders spezifisch sind sogenannte TaqMan®-Minor-groove-binder-Sonden (MGB-Sonden), welche aus komplementären Oligonukleotiden zur Ziel-DNA bestehen. An dieses Oligonukleotid sind zwei Farbstoffe gebunden, die Reporter und Quencher genannt werden. Während der PCR wird der Reporter zur Fluoreszenz angeregt, jedoch bei räumlicher Nähe zu dem Quencher wird dieses Licht unmittelbar absorbiert. Im