Geräte

Thermobad 1083 Jürgens Gesellschaft für

Labortechnik m.b.H., Hannover

Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg

Thermomixer Micro-4 13170 Hybaid limited, UK

Tischzentrifugen

Omnifuge 2. ORS Heraeus, Sepatech

Centrifuge 5415 C Eppendorf, Hamburg

Eppendorfpipetten research pro Eppendorf, Hamburg 0,5-10µl; 5-100µl; 20-300µl; 50-1000µl

MX 4000 Stratagene, La Jolla, USA

______________________________________Eigene Untersuchungen: Methoden63 3.2. Methoden

3.2.1. Probengewinnung

3.2.1.1. Kotproben

Die Probennahme begann mit dem Tag des Austriebs (07.05.02). Aus Gründen der Praktikabilität wurden die Tiere ab dem 18.06.02 immer am Abend vor der Probennahme nach Gruppen getrennt aufgestallt und nach Beendigung der Probennahme wieder auf die Weide gelassen. Die Tiere wurden einzeln in einen Treibgang getrieben und dort von einem Helfer fixiert. Die Gewinnung der Kotproben erfolgte zumeist rektal. In Einzelfällen wurde auch Kot vom Boden aufgenommen, wenn dieser frisch abgesetzt war, keine groben Verunreinigungen zu erkennen waren und die Probe einem Tier zweifelsfrei zuzuordnen war. Die gewonnenen Proben wurden in Urinbecher verpackt und in einer Kühlbox für den Transport gelagert. Im Institut für Parasitologie wurden die Proben bis zu Aufbereitung bei 4 °C gelagert.

3.2.1.2. FAMACHA^®-Wert

Zur Ermittlung des FAMACHA^©-Wertes wurde die Farbe der Konjunktivalschleimhäute eines Auges individuell mit einer Farbskala verglichen und einem Wert zwischen 1 und 5 zugeordnet. Diese Farbskala beschreibt die Stärke eine Anämie, die anhand der Farbe der Konjunktivalschleimhäute bestimmt wird. Der Wert 1 beschreibt eine rosa-rote Schleimhaut, der Wert 5 eine weiße, porzellanfarbene und somit anämische Schleimhaut. Es wird davon ausgegangen, dass bei einer vorherrschenden Infektion mit Haemonchus contortus die Stärke der Anämie mit der Befallsstärke der Tiere mit diesem Helminthen korreliert. Alle Tiere mit einem Wert 4 oder 5 werden anthelminthisch therapiert. Somit bietet diese Methode eine schnelle und wenig arbeitsintensive Möglichkeit, den Gesundheitszustand einer Herde zu prüfen und stark befallene Tiere zu erkennen und zu therapieren.

Die Bestimmung und Zuordnung des FAMACHA^©-Wertes wurde wechselnd von Tierärzten oder Landwirten durchgeführt.

Eigene Untersuchungen: Methoden _______________________________________64 3.2.1.3. Gewicht

Nach rektaler Entnahme der Kotprobe wurden die Tiere über eine elektronische Waage (SR 2000 von der Firma TRU-TEST) getrieben und das angezeigte Gewicht sowohl handschriftlich notiert als auch in einer Computerdatei gespeichert.

3.2.1.4. Weidegrasproben

Die Gewinnung der Weidegrasproben erfolgte nach der von SIEVERS PREKEHR (1971) beschriebenen Methode. Hierbei wird die Weide in zwei Diagonalen abgegangen und beprobt. Jede Diagonale ergibt eine Probe. Alle 10 Schritte werden an vier Punkten (vor, hinter, links und rechts des Probennehmers) einige (ca. 20-30) Halme dicht über dem Erdboden ausgezupft. Das Gras einer Diagonalen wird zu einer Sammelprobe in einem Gardinenstoffbeutel zusammengefaßt, so dass pro Weide zwei Proben entstehen. Diese Proben wurden für den Transport in einen Einmalrektalisierungshandschuh verpackt und bis zur Aufbereitung bei 4 °C gelagert.

3.2.1.5. Blutproben

An vier Terminen (07.05.02, 02.07.02, 27.08.02 und 22.10.02) wurden den Tieren je eine Serumblutprobe (10 ml) und eine Plasmablutprobe (5 ml, gerinnungsgehemmt mit Li-Heparin) aus der Vena jugularis entnommen. Die Serumprobe diente der Analyse des Pepsinogengehaltes, anhand der Plasmaprobe wurde der Hämatokrit der Tiere bestimmt.

3.2.2. Koproskopische Methoden 3.2.2.1. Eizahl pro g Kot

Die Aufbereitung der Kotproben für die Bestimmung der Eizahlen erfolgte 1-3 Tage nach der Probengewinnung. Die quantitative Analyse der Eiausscheidung erfolgte nach dem von GORDEN und WHITLOCK 1939 beschriebenen McMaster-Verfahren

______________________________________Eigene Untersuchungen: Methoden65 mit den Modifikationen nach WETZEL (1951) und SCHMIDT (1971). Hierbei wurden 4 g Kot mit gesättigter NaCl-Lösung homogen vermengt und durch ein Metallsieb in einem Standzylinder auf 60 ml aufgefüllt. Wenn nicht genügend Kot vorhanden war, wurde die Menge Lsg. entsprechend angeglichen (1 g Kot auf 15 ml NaCl-Lösung). Nach Überführung dieser Suspension in eine Schliffstopfenflasche und guter Durchmischung wurden mit einer Einmalpipette drei McMaster-Zählfelder gefüllt. Die Probe wurde zur Flotation für einige Minuten stehen gelassen und dann erfolgte die Untersuchung der Zählkammern in 65-facher Vergrößerung unter dem Mikroskop. Gezählt wurden alle Parasitenstadien. Die Anzahl der gefundenen Parasitenstadien wurde mit 33,3 multipliziert und ergab so die Eizahl pro g Kot (siehe Formel). Die Sensitivität dieser Methode lag bei 33 Eiern pro g Kot.

Formel zur Berechnung der Eizahl/g Kot:

3.2.2.2. Auswanderverfahren

Dieses von WETZEL (1930) in Anlehnung an die Beschreibung von BAERMANN (1917) entwickelte Verfahren diente der Untersuchung von Kotproben auf das Vorhandensein von Larvenstadien von Lungenwürmern. Einige Gramm Kot wurden in ein Sieb gegeben, welches zu 2/3 in einem mit Wasser gefüllten und mittels einer Schlauchklemme verschlossenen Trichter stand. Die Larven von Lungenwürmern wanderten in 12 Stunden in der Feuchtigkeit aus dem Kot aus und sackten der Schwerkraft folgend in das verschlossene Schlauchende. Durch einfaches Öffnen der Klemme konnten die Larven mit wenigen Tropfen Wasser gewonnen und unter dem Mikroskop untersucht werden.

3.2.2.3. Quantitative Larvenkultur

Um die Larvenzahlen pro g Kot zu bestimmen, wurden die Versuchstiere aus organisatorischen Gründen zu konstanten Gruppen von 3-5 Tieren zusammengefasst und der so gepoolte Kot nach der Methode von HENRIKSEN und KORSHOLM (1983) untersucht. Hierfür wurden 4 g Mischkot mit 3 ml

Eizahl/g Kot

=

Gezählte Parasitenstadien

3 x100

Eigene Untersuchungen: Methoden _______________________________________66 Leitungswasser vermengt und in einen speziell präparierten Plastikbecher mit

Luftlöchern überführt. Dieser wurde mit Gaze überzogen und in einen zweiten Plastikbecher gestellt, in welchem sich zur Aufrechterhaltung der Feuchtigkeit 10 ml Leitungswasser befanden. Diese Kulturen wurden für 8-10 Tage bei 28 °C und 85 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Danach wurde die Kotmenge auf einen Baermann-Trichter übertragen und die Larven nach 24 h durch Öffnen der Schlauchklemme gewonnen.

Unter dem Mikroskop konnten die Larven nach Zugabe einiger Tropfen Lugol´scher Lösung ausgezählt werden. Die gefundene Anzahl durch 4 dividiert entsprach der Larvenanzahl pro g Kot (vgl. Formel).

Formel zur Berechnung der Larvenzahlen/g Kot:

Für die einzelnen Termine wurde die Reduktion der Larvenzahlen in den Versuchsgruppen nach folgender Formel, vergleichbar mit den Untersuchungen von FERNANDEZ et al. (1999) und PEÑA et al. (2002), errechnet.

Larvenzahlreduktion (in %) = 100 -

3.2.2.4. Qualitative Larvenkultur

Da eine Gattungsdifferenzierung der Magen-Darm-Strongyliden anhand der Eier mikroskopisch nicht möglich ist, erfolgte eine Unterscheidung der verschiedenen Gattungen durch Analyse der 3. Larven. Zur Gewinnung der Larven erfolgte die Kultur der Proben nach der Methode von ROBERTS und O´SULLIVAN (1950).

Zu diesem Zweck wurden die Kotproben zu konstanten Gruppen von 3-5 Tieren zusammengefasst und eine ungefähre Menge von 10 g mit etwas Leitungswasser zu einen dicken Brei vermengt. Zu dieser Masse wurden autoklavierte Sägespäne gegeben und mit einem Handrührgerät untergerührt, bis eine feuchte, grob krümelige Masse entstand. Diese Masse wurde auf Marmeladengläser locker verteilt und zugedeckt bei 28 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 85 % für 8-10 Tage inkubiert.

Nach der Inkubation wurden die Gläser bis zum Rand mit Leitungswasser gefüllt und über eine Petrischale gestürzt. Diese wurde ebenfalls zur Hälfte mit Wasser gefüllt.

Larvenzahl/g Kot Kontrolle Larvenzahl/g Kot

=

Gefundene Larven

4

Larvenzahl/g Kot Versuch * 100

______________________________________Eigene Untersuchungen: Methoden67 Nach 24 h waren die dritten Larven in die Petrischale ausgewandert und die Flüssigkeit der Petrischalen konnte über einen Trichter in einen Standzylinder abgegossen werden. Nach weiteren 24 h waren die Larven durch Sedimentation am Boden konzentriert und es konnte der Überstand im Zylinder mit einer Wasserstrahlpumpe abgesogen werden. Ein Anteil dieser Larvensuspension wurde unter Zugabe einiger Tropfen Lugol´scher Lösung unter dem Mikroskop auf ihre Gattungszugehörigkeit nach dem Schlüssel von STOYE und BÜRGER (1968) untersucht. Ausgezählt wurden wenn möglich immer 100 Larven. Die Anzahl Larven einer Gattung ergab somit deren Anteil in Prozent.

3.2.2.5. Gewinnung 3. Larven von Magen-Darm-Strongyliden aus Weidegrasproben

Die Weidegrasproben wurden mit dem Verfahren nach SIEVERS PREKEHR (1971) aufbereitet und untersucht. Hierbei wurden die Proben mit einer speziell präparierten Waschmaschine gewaschen und das ablaufende Spülwasser in einem 25 µm weitmaschigem Sieb aufgefangen. Nach 3 erfolgten Spülgängen wurde der Grasbeutel aus der Maschine genommen und über das Sieb zum Abtropfen gehängt.

Es folgte ein weiterer Spülgang zum Ausspülen der Maschine. Das Sediment aus dem Sieb wurde mit konz. MgSO4-Lösung in ein elastisches Gummisäckchen überführt, welches über einen speziell präparierten Plastikring in einen Zentrifugenbecher eingespannt war. Die Probe wurde bei 250 g 2 min zentrifugiert, danach wurde mittels einer gepolsterten Darmklemme das flotierte Material in dem Gummisäckchen vom Sediment abgeklemmt und in ein Becherglas mit Leitungswasser überführt. Der verbliebene Rest wurde erneut mit MgSO4-Lösung aufgeschwemmt und zentrifugiert. Dieser Schritt wurde 3 mal wiederholt. Das dekantierte Material wurde nach dem Zentrifugieren über ein Sieb (Ø 25 µm) konzentriert und mittels Leitungswasser in ein Reagenzglas überführt. So präpariert, wurden die Proben bis zur mikroskopischen Untersuchung bei 4 °C gelagert. Das gewaschene Gras wurde bei 60 °C über mindestens 72 Stunden getrocknet und das Trockengewicht jeder Probe bestimmt. Unter dem Mikroskop konnten dann die 3.

Larven von Magen-Darm-Strongyliden analysiert und gezählt werden. Als Maß für die Kontaminationsrate einer Weide wurde die Anzahl der Larven pro 100 g

Eigene Untersuchungen: Methoden _______________________________________68 Trockengewicht Gras pro Probe ermittelt und der Mittelwert beider Proben einer

Weide gebildet.

3.2.3. Blutuntersuchungen

3.2.3.1. Serumpepsinogenbestimmung

Nach der Entnahme wurden die Serumblutproben bei 4 °C gekühlt gelagert und 12-24 Stunden nach der Entnahme zur Serumgewinnung verwendet. Hierzu wurden die Proben bei 3000 U/min (2415 g) 10 min zentrifugiert. Im Anschluss daran wurde das überstehende Serum mit einer Pipette aufgenommen und in ein Einmalreaktionsgefäß überführt. Das so gewonnene Serum wurde bei –20 °C bis zur weiteren Untersuchung gelagert.

Die Menge an Pepsinogen im Blut gilt als Maßstab für die Wurmbürde im Labmagen eines Wirtes. Im Labor kann man das Pepsinogen photometrisch bestimmen (BERGHEN et al., 1987). Dazu wurden von einer Probe zweimal 0,5 ml mit dem Substrat BSA (Bovines-Serum-Albumin) versetzt und ein Ansatz bei 37 °C 24 h inkubiert, ein Ansatz ohne Inkubation mit Trichloressigsäure gefällt und abfiltriert. Das Filtrat wurde dann für 24 h bei 4 °C gelagert. Nach der Inkubation des ersten Ansatzes wurden auch in diesem analog zum zweiten die Proteine ausgefällt und die Suspension filtriert. Von jedem Filtrat (inkubiert und nicht inkubiert) wurde 1 ml mit 10 ml einer 0,25 M NaOH-Lösung und 1,5 ml einer Farbstofflösung (Folin-Reagenz) vermischt, und nach einer Inkubation von 30 min wurde die Extinktion der Lösungen photometrisch bestimmt. Aus den ermittelten Extinktionen von inkubiertem und nicht inkubiertem Serum sowie verschiedenen Leerwerten aus BSA (inkubiert und nicht inkubiert) wurde der Tyrosingehalt einer Probe anhand der Extinktion von Standardwerten verschiedener Tyrosinverdünnungen (0,1; 0,2; 0,3 µmol/ml) errechnet. Hierfür bediente man sich folgender Formel:

______________________________________Eigene Untersuchungen: Methoden69 Ext. = Extintion Tyr. = Tyrosin Ink. = inkubiert n.ink. = nicht inkubiert T = Tyrosin in mU/ml P = Probe

Faktor1 = [(Konz.Tyr.1/Ext.Tyr.Ink)+(Konz.Tyr.2/Ext.Tyr.Ink)+( Konz.Tyr.3/Ext.Tyr.Ink)]/3 Faktor2=[(Konz.Tyr.1/Ext.Tyr.n.ink)+(Konz.Tyr.2/Ext.Tyr.n.ink)+(Konz.Tyr.3/Ext.Tyr.n.ink)/3 BSA i = (Ext. BSA-Standard1 Ink + Ext. BSA-Standard2 Ink + Ext. BSA-Standard3 Ink)/3 BSA ni = (Ext. BSA-Standard1n.ink + Ext. BSA-Standard2n.ink + Ext. BSA-Standard3n.ink)/3

T=[(Ext.P Ink * Faktor 1-Ext.P n.ink *Faktor 2) – (BSA i * Faktor 1-BSA ni * Faktor 2)]

*5560

3.2.3.2. Hämatokritbestimmung

Die Hämatokritbestimmung erfolgte nach der Mikromethode. Hierfür wurden die Plasmaproben zentrifugiert (10 min bei 10.000 g) und der Anteil der zellulären Bestandteile an einer Skala abgelesen. Dies erfolgte im Labor des Institutes für ökologischen Landbau in Trenthorst.

3.2.4. Gewinnung und Identifizierung von adulten Magen-Darm-Strongyliden der Tracer

Die parasitologischen Sektionen erfolgten nach Ablauf der Präpatenz 3 Wochen nach dem Aufstallen der Tracer. Die Weidedauer der Tiere betrug jeweils 3 Wochen.

Am 10.09.02 und am 06.11.02 wurden die parasitologischen Sektionen im Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Der Gastrointestinaltrakt der Tiere wurde am Ostium retikulo-omasicum und am Rektum abgebunden und in toto entnommen. Ebenso wurde die Lunge zusammen mit dem Herz und den abgehenden großen Gefäßen entnommen. Der Gastrointestinaltrakt wurde durch Ligaturen in die einzelnen Teile Labmagen, Dünndarm und Dickdarm getrennt. Danach wurden diese voneinander getrennt und in separaten Wannen eröffnet. Die Schleimhaut wurde unter fließendem Wasser gründlich abgespült und das Spülwasser mit dem Darminhalt aufgefangen. Die angesammelte Spülflüssigkeit wurde auf 10 Liter aufgefüllt und gründlich durchmischt. Hiernach wurde mit einer Schöpfkelle von jedem Abschnitt ein 10 %-Aliquot entnommen und mit Wasser durch

Eigene Untersuchungen: Methoden _______________________________________70 ein Metallsieb mit einer Maschenweite von 100 µm durchgesiebt. Der so gewonnene

Siebrückstand wurde mit wenig Wasser in verschließbare Marmeladengläser gefüllt und im Verhältnis 1:1 mit 10 %-igem Formalin aufgefüllt. Die dermaßen präparierten Proben wurden bei 4 °C bis zur mikroskopischen Untersuchung gelagert.

Zur Entfernung des Formalins für die mikroskopische Untersuchung wurden die Proben erneut durch ein Metallsieb mit einer Maschenweite von 100 µm gesiebt und das ablaufende Formalin aufgefangen. Die Proben wurden mit Leitungswasser gewaschen und dann in kleinen Portionen mit etwas Wasser unter der Stereolupe in 4-facher Vergrößerung auf adulte Stadien von Magen-Darm-Strongyliden durchgemustert. Die gefundenen Stadien wurden auf einen Objektträger verbracht, und unter dem Mikroskop wurde eine Artdiagnose nach der Beschreibung von BARTH und VISSER (1991) durchgeführt.

Zum Nachweis adulter Stadien von Lungenwürmern wurde eine von INDERBITZIN (1976) entwickelte Perfusionsmethode angewandt. Hierfür wurde die Vena cava cranialis dicht vor der Mündung in die rechte Herzkammer abgeklemmt. In den Truncus pulmonalis wurde ein weicher Gummiwasserschlauch in Richtung Lunge geschoben und in dem Gefäß durch eine Ligatur fixiert. Unter leichtem Wasserdruck wurde dann die Lunge durchgespült und das durch die Aorta ablaufende Spülwasser aufgefangen. Dieses Spülwasser wurde vollständig durch ein Metallsieb mit 100 µm Maschenweite gesiebt, der Siebrückstand in Wasser aufgenommen und bei 4 °C für 12 h gelagert oder sofort unter der Stereolupe untersucht.

3.2.4. Gewinnung genomischer DNA aus L3

3.2.4.1. Einstellung der Larvenkonzentration

Mit der Real-time PCR sollten die prozentualen Anteile der Gattungen Cooperia, Haemonchus, Trichostrongylus und Ostertagia in den Larvenkulturen ermittelt werden. Hierfür wurden 20 Larvenkulturen exemplarisch ausgewählt. Es wurden Kulturen ausgewählt, welche mindestens eine Gesamtlarvenzahl von 3000 aufwiesen, so dass ausreichend Material für eventuelle weitere Präparationen zur Verfügung stand. Weiterhin sollten die Proben nach der mikroskopischen Analyse

______________________________________Eigene Untersuchungen: Methoden71 möglichst viele verschiedene Gattungen anteilig aufweisen. Die DNA wurde wie im folgenden präpariert. Von den 20 Kulturen wurden 10 nach der Analyse bei 4 °C gelagert, die übrigen 10 waren bei –20 °C tiefgefroren. Um die Proben miteinander vergleichen zu können und eine Aussage über die quantitativen Anteile der einzelnen Gattungen treffen zu können, wurden die Proben in Portionen von je ca. 1000 dritten Larven geteilt und in Reaktionsgefäße gefüllt. Hierfür wurde die Larvendichte einer Kultur folgendermaßen bestimmt: Fünf mal 10 µl der Larvensuspension wurden unter dem Mikroskop ausgezählt und der Mittelwert berechnet. Anhand dieses Wertes konnte dann die erforderliche Menge Larvensuspension mit 1000 enthaltenen Larven ermittelt werden. Diese Menge wurde mit einer Pipette aufgenommen und in ein 1,5 ml fassendes Einmalreaktionsgefäß überführt. Tabelle 1 zeigt die verwendeten Proben und deren Nummerierung.

3.2.5.2. Entscheidung der Larven

Infektiöse dritte Larven von Magen-Darm-Stronglyiden sind mit einer Scheide umgeben, welche die Larven vor äußeren Einwirkungen schützen soll. Zur Gewinnung der DNA der lebenden dritten Larven wurde die Scheide mit Hilfe von Natriumhypochlorid (12 % Cl^-) entfernt. Durch Zugabe dieser Lösung werden die Larven veranlasst, aktiv aus ihrer Scheide zu wandern. Sie sind dann für die DNA-Extraktion zugänglich. Bis zu 1000 Larven wurden in einem 1,5 ml- Reaktionsgefäß 10 min bei 3500 U/min (2800 g) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde ein

Eigene Untersuchungen: Methoden _______________________________________72 Larvenpellett sichtbar und das überstehende Wasser wurde bis auf einen kleinen

Rest unter sorgfältiger Schonung des Pellets abgesaugt. Zu dieser jetzt stark konzentrierten Larvensuspension wurden 20 µl Natriumhypochlorid-Lösung gegeben und die Mischung bei Raumtemperatur 2 min unter Schütteln inkubiert. Da Natriumhypochlorid in der Lage ist, DNA zu zerstören, musste es nach dem Entscheiden wieder aus der Suspension ausgewaschen werden. Hierzu wurde das Reaktionsgefäß mit Leitungswasser aufgefüllt und die Mischung erneut 10 min bei 3500 U/min (2800 g) zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand vorsichtig abpipettiert und das Gefäß erneut mit Leitungswasser aufgefüllt. Dieser Waschschritt wurde viermal wiederholt.

Am Ende wurde der Erfolg der Entscheidung kontrolliert. 10 µl Larvensuspension wurden unter dem Mikroskop durchgemustert. Alle gefundenen Larven mussten unbescheidet sein, ansonsten wurde der Vorgang wiederholt.

3.2.5.3. Herstellung einer Larvenverdünnung

Zum Vergleich der in der PCR ermittelten Quantitäten mit den Larvenzahlen wurde für jede Gattung eine Larvenverdünnungsreihe hergestellt und diese ebenso wie die Proben behandelt und untersucht. Unter dem Mikroskop wurden die entscheideten, lebendigen Larven der vier zu untersuchenden Gattungen einzeln mit der Pipette aufgenommen und zu Portionen von 1, 10 und 100 Larven zusammengefasst. Eine weitere Portion wurde mit 1000 Larven angefertigt. Das Vorgehen entsprach dem der Probenportionen. Nach Ermittlung der Larvendichte wurde die nötige Menge Larvensuspension mit der Pipette aufgenommen und in ein Einmalreaktionsgefäß gegeben. Aus diesen Proben wurde die DNA analog zur Präparation der Mischkulturproben gewonnen.

3.2.5.4. Extraktion der DNA

Die DNA-Präparation wurde mit dem NucleoSpin^®Tissue Kit der Firma Macherey und Nagel durchgeführt. Hierfür wurden die beigelegten Puffer und Proteinase K verwendet. Zur Vorbereitung auf den Proteinase-K-Verdau wurden die Larven kurzzeitig bei 95 °C erhitzt. Hierfür wurde das Larvenpellett mit möglichst wenig

______________________________________Eigene Untersuchungen: Methoden73 Wasser in 180 µl T1-Puffer suspendiert. Diese Suspension wurde danach bei 95°C für 10 min inkubiert. Nach erfolgter Abkühlung auf Raumtemperatur wurde jeder Probe 25 µl Proteinase K zugesetzt und die Mischung für mindestens 12 h, in der Regel über Nacht bei 56 °C und mäßigen Schütteln (550 rpm) im Thermomixer verdaut.

Nach dem Verdau erfolgte die Inaktivierung der Proteinase K durch Zugabe des B3-Puffer und eine weitere Inkubation für 10 min bei 70 °C. Im Anschluss an diese Inkubation erfolgte die Fällung der DNA. Zu diesem Zweck wurde die Probe für wenige Sekunden bei Höchstgeschwindigkeit anzentrifugiert, und im Anschluss wurden 210 µl Ethanol 99,6 % hinzupipettiert und die Probe vorsichtig gemischt.

Dann wurde die Probe vollständig über die Schleudersäulen des Kits gegeben und bei 10.000 U/min (8.400 g) für 60 sec zentrifugiert. Hierbei band die DNA an die Silicamembran der Säule und wurde so vom Durchfluss getrennt, welcher verworfen wurde. Wenn nach einmaliger Zentrifugation noch nicht alles Probengemisch aus der Säule entfernt war, wurde der Zentrifugationsschritt mit einer Geschwindigkeit von 14.000 U/min (16.464 g) wiederholt. An die Bindung der DNA an die Säule schloss sich ein zweimaliges Waschen der Membran an. Im ersten Waschschritt wurden 500 µl BW-Puffer auf die Säule pipettiert und diese bei 10.000 U/min (11760 g) für 60 sec zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Im Anschluss wurde die Probe mit 600 µl B5 Puffer gewaschen und erneut bei 10.000 U/min (11760 g) 60 sec lang zentrifugiert. Um die Silicamembran zu trocknen und alle Reste des Ethanols aus der Membran zu entfernen, wurden die Proben dann bei 14.000 U/min (16464 g) für 3 min zentrifugiert.

Zur Elution der DNA wurde die Säule auf ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß gesteckt und 25 µl autoklaviertes destiliertes Wasser mit einer Temperatur von 70 °C hinzupipettiert. Die Probe wurde dann für 60 sec bei Raumtemperatur inkubiert und bei 14.000 U/min (16464 g) 60 sec zentrifugiert. Dieser Elutionsschritt wurde wiederholt, so dass die gewonnene DNA in 50 µl gelöst vorlag. Die so isolierte DNA wurde bis zum Gebrauch bei –20 °C gefroren gelagert.

Eigene Untersuchungen: Methoden _______________________________________74 3.2.6. Gewinnung genomischer DNA aus Weidegrasproben

3.2.6.1. Gewinnung von Grasproben mit oder ohne definierten Larvengattungen Um Grasproben ohne Parasitenstadien untersuchen zu können, wurden Grasproben von Flächen, die nie mit kleinen Wiederkäuern beweidet worden waren, gesammelt.

Diese Proben wurden entsprechend den Weideproben aus dem Versuch 2002 nach der Methode von SIEVERS PREKEHR (1971) aufbereitet.

Weiterhin wurden Proben benötigt, welche definierte Ausgangskonzentrationen der einzelnen Gattungen aufwiesen. Hierfür wurden erneut Grasproben von bekannt parasitennegativen Flächen gesammelt und diese im Labor mit der gewünschten Zahl lebender Larven versetzt. Hierfür wurden die Larven aus der Stammhaltung des Instituts für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover verwendet. Zum Einsatz kamen die Arten Cooperia oncophora, Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta und Trichostrongylus colubriformis. Um eine möglichst gleichmäßige Verteilung der Larven in der Probe zu erreichen, wurden die Proben nach Zugabe der Larven bei Raumtemperatur für mindestens drei Stunden ruhen gelassen. Im Anschluss erfolgte die Gewinnung der Larven nach der Methode von SIEVERS PREKEHR (1971).

Angefertigt wurden insgesamt 9 Proben. 4 Proben enthielten jeweils 5000 infektiöse Larven einer Art. Weiter wurden eine Probe mit 2000 L3 Haemonchus contortus, eine mit je 2000 L3 Haemonchus contortus und Trichostrongylus colubriformis, eine mit je 2000 Larven der Gattung Haemonchus, Trichostrongylus und Cooperia und eine Probe mit je 2000 Larven jeder Gattung. Es wurde zudem eine Probe mit je 1000 Larven einer Gattung angefertigt.

Aus der Probennahme im Jahr 2002 wurden exemplarisch 6 Proben ausgewählt und mittels PCR untersucht. In Tabelle 2 sind die Proben dem jeweiligen Probentermin

Aus der Probennahme im Jahr 2002 wurden exemplarisch 6 Proben ausgewählt und mittels PCR untersucht. In Tabelle 2 sind die Proben dem jeweiligen Probentermin

Im Dokument Untersuchungen zum Einfluss nematophager Pilze auf das Nematoden-Infektionsrisiko bei Schafen und Ziegen (Seite 62-0)