in-vitro-Untersuchungen mit Duddingtonia flagrans

In verschiedenen in-vitro-Studien ist das Verhalten des Pilzes unter verschiednen Umweltsituationen untersucht worden. Ziel dieser Studien war es, das wirksamste Isolat herauszufinden und dessen Eigenschaften und Verhalten zu charakterisieren.

So konnte in verschiedenen Studien gezeigt werden, dass Duddingtonia flagrans in seiner Umgebung bewegliche Larven braucht, um optimales Wachstum zu zeigen (MORGAN et al., 1997; FAEDO et al., 2002; WAGHORN et al., 2003). GRØNVOLD et al. (1999) fanden darüber hinausgehend heraus, dass 50 infektiöse Larven maximal 600 Netzstrukturen/cm² induzieren können. Allerdings gibt es für die Fangaktivität auch Grenzen. Zuwenig Larven induzieren keine Netzbildung und entgehen so der Fangaktivität. Gleichzeitig können bei sehr hohen Zahlen dem Pilz einige Larven „entkommen“ (BIRD et al., 1995).

Dass Duddingtonia flagrans bewegliche Larven braucht, um optimal wachsen und damit wirken zu können, wird auch dadurch belegt, dass im Vergleich mit den Trichostrongylidenlarven eine schlechtere Wirkung auf Larven von Dictyocaulus viviparus besteht. Diese Larven sind relativ träge und bewirken daher eine reduzierte Wachstumsstimulation des Pilzes (FERNANDEZ et al., 1999b). Einen ähnlichen Zusammenhang vermuten auch WAGHORN et al. (2003) für die geringere Fangaktivität des Pilzes gegenüber dritten Larven von Teladorsagia circumcincta, da auch diese Larven im Vergleich zu anderen Trichostrongylidenlarven deutlich weniger aktiv sind.

Keine Wirkung zeigt der Pilz gegen Larven, die sich noch im Ei befinden, z.B.

Nematodirus spp. (GITHINGIA et al., 1997; FAEDO et al., 2000).

Literaturübersicht _____ _________________________________44 Hieraus leitet sich auch direkt die Notwendigkeit ab, dass der Zeitpunkt der Gabe des

Pilzes von hoher Bedeutung für die Reduktionsraten ist. Nur wenn Pilz und Larven zeitgleich im Kot vorliegen, kann der Pilz wirken (FAEDO et al., 2000).

Wichtig für einen optimalen Umgang mit Duddingtonia flagrans ist eine genaue Kenntnis der Umwelteinflüsse auf das Verhalten des Pilzes. So zeigt Duddingtonia flagrans abhängig von der Umgebungstemperatur unterschiedlich schnelles Wachstum. Generelles Wachstum erfolgt bei Temperaturen zwischen 15 und 35 °C, wobei optimale Wachstumsraten bei Temperaturen zwischen 25 und 30 °C erreicht werden (GRØNVOLD et al., 1996b; MORGAN et al., 1997; SANYAL, 2000;

FONTENOT et al., 2003). GRØNVOLD et al. zeigten 1999, dass bei Temperaturen um die 30 °C der Pilz zwar sehr schnelles Wachstum zeigt, aber die Kultur auch schnell abstirbt. Vorteilhafter sind Wachstumsbedingungen von 20 °C, bei denen der Pilz zwar langsamer wächst, dafür aber länger aktiv bleibt. Gleichzeitig konnten sie nachweisen, dass der Pilz kurzzeitig anaerobe Bedingungen unbeschadet überstehen kann. Für das Wachstum und die Ausbildung von Fangstrukturen ist eine aerobes Milieu notwendig, doch war die Aktivität des Pilzes nach mehreren Wochen in anaeroben Verhältnissen nicht vermindert. Allerdings wirkt sich direkte Lichteinwirkung negativ auf die Aktivität aus.

Diese Ergebnisse konnten FAEDO et al. (2002) bestätigen. Sie zeigten, dass Duddingtonia flagrans ähnliche Bedingungen wie infektiöse Larven überleben kann und danach immer noch Fangaktivität zeigt.

Diese Befunde weisen weiterhin darauf hin, dass der Pilz in der Lage ist, die Bedingungen einer Gastrointestinaltrakt-Passage zu überstehen und danach noch im Kot aktiv zu werden (LLERANDI-JUAREZ und MENDOZA-de GIVES, 1998;

SANYAL, 2000).

Allerdings wird das Wachstum des Pilzes durch verschiedene Mikroorganismen im Kot, wie z.B. Bacillus subtilis-Isolaten, Pseudomonas spp. oder verschiedenen Pilzgattungen wie Cladosporum und Trichoderma gehemmt (GRØNVOLD et al., 2004).

____________________________________________________Literaturverzeichnis45 2.2.6. Andere nematophage Pilze

Aus der Gruppe der nematophagen Pilze ist besonders die Gattung Arthrobotrys weiterhin sehr gut untersucht. Hierbei sticht besonders Arthrobotrys oligospora hervor, welche die am häufigsten vorkommende nematophage Pilzart in Dänemark ist (GRØNVOLD et al., 1988).

Arthrobotrys oligospora kann saprophytisch leben und verhält sich in Anwesenheit von infektiösen Larven ähnlich wie Duddingtonia flagrans. Der Pilz bildet ein netzförmiges Hyphensystem, in welchem sich die Larven verfangen. Er dringt durch die Kutikula in die Larven ein und verdaut sie von innen heraus. Besonders aktive Larven induzieren die Netzbildung (NANSEN et al., 1988). Im Unterschied zu Duddingtonia flagrans bildet Arthrobotrys oligospora nicht sehr viele Chlamydosporen sondern nur reichlich dünnwandige Konidien (GRØNVOLD et al., 1993).

Die Menge an Konidien/g Kot, die nötig ist, um eine signifikante Larvenzahlreduktionen zu bewirken, wurde kontrovers diskutiert. WALLER et al.

(1993) reichten zehn Konidien, HASHMI et al. (1989) kamen zu ähnlichen Ergebnissen. Sie benötigten 20-50 Konidien. Bereits 1985 wurden von GRØNVOLD et al. (1985) 250 Konidien verwendet, drei Jahr später berichtete die gleiche Gruppe von der Notwendigkeit, 2000 Konidien zu verwenden. GRØNVOLD et al. (1988) konnten mit der Dosierung von 2000 Konidien/g Kot ebenfalls eine Larvenzahlreduktion im Gras nachweisen.

WALLER et al. (1994) testeten verschiedene Arthrobotrys-Arten. Alle zeigten ein gutes Wachstum auf Kot-Agar-Platten, lediglich Arthrobotrys oligospora konnte nach einer Gastrointestinaltrakt-Passage noch isoliert werden. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu den Resultaten von SANYAL (2000), welcher Arthroborys oligospora nicht mehr nach einer Passage durch den Gastrointestinaltrakt isolieren konnte. Dies ist begründet durch das relativ geringe Vorkommen von Dauerstadien. FAEDO et al.

(1997) konnten nachweisen, dass Duddingtonia flagrans Arthrobotrys oligospora in der reduzierenden Wirkung auf Larven überlegen ist. Zu dem gleichen Ergebnis kamen FLORES-CRESPO et al. (2003), als sie die Wirksamkeit von Duddingtonia flagrans und Arthrobotrys oligospora gegen Larven von Haemonchus contortus verglichen.

Literaturübersicht _____ _________________________________46 GONZALEZ-CRUZ et al. (1998) untersuchten die Wirkung der nematophagen Pilze

Monacrosporium gephyropagum und Arthrobotrys robusta auf infektiöse Larven von Strongyloides papillosus in vitro. Sie konnten einen reduzierenden Effekt durch Monacosporium gephyropagum nachweisen, aber keinen Effekt von Arthrobotrys robusta.

2.2.7. Einsatz bei kleinen Wiederkäuern

Nachdem erste Studien mit Rindern Erfolg versprachen (s.u.), begann ab 1997 die Untersuchung der Verhältnisse bei Schaf und Ziege. Die meisten Untersuchungen mit nematophagen Pilzen bei kleinen Wiederkäuern wurden an Schafen durchgeführt. Allerdings zeigten WAGHORN et al. (2003), dass die Fangaktivität von Duddingtonia flagrans bei Schafen und Ziegen keine Unterschiede aufweist.

Verschiedenfach konnte nachgewiesen werden, dass die Sporen von Duddingtonia flagrans auch eine Passage des Gastointestinaltraktes bei Schafen überstehen (CHANDRAWATHANI et al., 2002; LLERANDI-JUAREZ und MENDOZA-de GIVES et al., 1998; SANYAL, 2001; WALLER et al., 2001). Die Dosierung der Sporen, die zu einer Reduktion der Larvenzahlen führte, war unterschiedlich. Allerdings zeigte sich, dass nur wenige Dosierungen nötig waren, um die angegebenen Reduktionen zu erreichen. So zeigten WALLER et al. (2001), dass eine Dosis von 3x10⁶ Sporen/Tier/Tag eine vollständige Reduktion der Larvenzahlen bewirkte. Höhere Dosierungen brachten gleiche Ergebnisse. Andere Autoren setzten die Dosierung Körpergewichtsabhängig ein und dosierten zwischen 1x10⁵ und 6,25x10⁶ Sporen/kg KGW/Tag (CHANDRAWATHANI et al., 2002; FAEDO et al., 1997; GITHINGIA et al., 1997; KNOX et al., 2001; PE A et al., 2002 und SANYAL, 2001).

PE A et al. (2002) untersuchten unterschiedliche Dosierungen und fanden eine 80-100 %ige Larvenzahlreduktionen über den Zeitraum der Fütterung des Pilzes.

In verschiedenen Feldversuchen konnte eine Wirkung nach der Fütterung von Duddingtonia flagrans auf die Larvenzahlen im Kot und auf der Weide nachgewiesen werden (FAEDO et al., 1998; GITHINGIA et al., 1997; KNOX et al., 2001 und PARAUD und CHARTIER, 2002). PARAUD und CHARTIER (2002) untersuchten weiterhin die Wirkung des Pilzes bei Ziegen und konnten zeigen, dass eine

____________________________________________________Literaturverzeichnis47 Dosierung von 5x10⁵ Sporen/kg KGW/Tag die Larvenzahl von Teladorsagia circumcincta um bis zu 90 % reduzierten. Eine Wirkung des Pilzes auf den kleinen Lungenwurm Muellerius capillaris konnte nicht nachgewiesen werden.

2.2.8. Einsatz bei anderen Haussäugetieren RIND

Bereits 1992 wiesen LARSEN et al. (1992) nach, dass oral applizierte Sporen verschiedener nematophager Pilze in der Lage waren, die Gastrointestinaltrakt-Passage bei Rindern zu überstehen. Von 10 untersuchten Arten konnten 9 reisoliert werden. 7 zeigten weiterhin noch eine gute Fangaktivität.

Ein Jahr später konnten GRØNVOLD et al. (1993) die Ergebnisse dieser Studie bestätigen. Sie konnten eine bis zu 85 %ige Reduktion der Larvenzahlen von Ostertagia ostertagi bei einer Dosierung von 1x10⁹ Sporen/Tier/Tag im Gras nachweisen.

Ähnliche Ergebnisse erreichten WOLSTRUP et al. (1994). Sie verfütterten 2 Monate lang Gerste mit darauf kultiviertem D. flagrans an Kälber und erreichten so eine deutliche Reduktion der Larvenzahlen im Gras. Ein Vergleich mit anderen Studien ist jedoch nicht möglich, da keine genaue Dosierung des Pilzes beschrieben ist.

Es folgten weitere Versuche mit Rindern, und es konnte ausnahmslos eine im Vergleich mit den Kontrolltieren bessere Entwicklung der Versuchsgruppen nachgewiesen werden (FERNANDEZ et al., 1999c; FERNANDEZ et al., 1999d;

LARSEN et al., 1995; NANSEN et al., 1995; SARKUNAS et al., 2000). Im Gegensatz hierzu steht ein Versuch aus Schweden, der drei Jahre lang die Einflüsse verschiedener Strategien zur Helminthenkontrolle untersuchte (DIMANDER et al., 2003). Hierbei zeigten die mit Duddingtonia flagrans in einer Dosierung von 1x10⁶ Sporen/kg KGW im ersten Jahr und 5x10⁵ Sporen/kg KGW im zweiten Jahr über die Saison gefütterten Tiere die ersten zwei Jahre keine signifikanten Unterschiede zu den Kontrollgruppen. Diese konnten erst im dritten Jahr beobachtet werden.

Literaturübersicht _____ _________________________________48 Keine Unterschiede zwischen den gefütterten und nicht gefütterten Gruppen konnten

bei den Untersuchungen der Wirkung auf Nematodirus spp. nachgewiesen werden (LARSEN et al., 1995). Dies liegt an der Epidemiologie dieses Trichostrongyliden.

Die Entwicklung zur infektiösen Larve erfolgt im Ei und ist so vor dem Zugriff des Pilzes geschützt.

Weiterhin konnte in keinem Versuch eine reduzierende Wirkung des Pilzes auf die Eiausscheidung der Tiere nachgewiesen werden (LARSEN et al., 1995; NANSEN et al., 1995; WOLSTRUP et al., 1994).

PFERD

LARSEN et al. (1995) konnten nachweisen, dass eine Dosierung von 10⁶ Sporen/kg KGW/Tag ausreichend ist, um eine Reduktion der Larvenentwicklung zu erreichen.

Niedrigere Dosierungen zeigten diesen Effekt nicht. Bis zu 80 Stunden nach der Applikation des Pilzes konnte dieser im Kot der Versuchstiere nachgewiesen werden.

Mittels eines Feldversuches konnte diese Gruppe im selben Jahr diese Ergebnisse bestätigen. FERNANDEZ et al. (1997) gelangen 1997 gleiche Ergebnisse.

Weitere Versuche mit Pferden folgten durch FERNANDEZ et al. (1999a) und BAUDENA et al. (2000). Letztere konnten zeigen, dass in einem Beobachtungszeitraum von einem Jahr der Pilz auch in subtropischen Klimazonen signifikant niedrigere Larvenzahlen bewirkt. Während der heißen Sommermonate, in denen sich nur wenige Larven entwickeln, war die Wirkung jedoch eingeschränkt, da wenige Larven auch eine geringere Stimulation für das Wachstum des Pilzes bieten, welches bei hohen Temperaturen ohnehin nur eingeschränkt möglich ist.

FERNANDEZ et al. (1999a) zeigten, dass eine Dosierung von 1x10⁶ Sporen/kg KGW/Tag eine Reduktion der Anzahl von infektiösen Larven auf der Weide um 94,8 % bewirkt.

SCHWEIN

Auch die Wirkung von Duddingtonia flagrans auf die Helminthen des Schweines konnte belegt werden. So fütterten NANSEN et al. (1996) Schweinen Sporen von D. flagrans in einer Dosierung von 5x10⁶ Sporen/kg/KGW/Tag, und erhielten signifikant niedrigere Larvenzahlen von Oesophagostomum dentatum und

____________________________________________________Literaturverzeichnis49

Hyostrongylus rubidus auf der Weide der Versuchstiere gegenüber den Kontrolltieren sowie niedrigere Wurmbürden bei den Tracertieren der Versuchsgruppen.

Mit einem in-vitro-Versuch wurde nachgewiesen, dass 5000 Chlamydosporen verschiedener Duddingtonia flagrans Isolate/g Schweinekot eine bis zu 89%ige Reduktion der Larvenzahlen von Oesophagostomum dentatum bewirkten, unabhängig von der Fütterung der Tiere (PETKEVI IUS et al., 1998).

2.3. Isolation von DNA aus Grasauswaschproben zum Einsatz in der Real-time-PCR

Ebenso wie die mikroskopische Diagnostik der Larvenkulturen ein hohes Maß an Erfahrung durch den Untersucher voraussetzt, ist auch die Analyse von infektiösen Larven aus Grasauswaschproben unter dem Mikroskop einem Unsicherheitsfaktor durch den Untersucher unterworfen. Ferner ist die mikroskopische Diagnostik sehr zeitaufwendig und für die Routinediagnostik nicht geeignet. Eine Aussage über den parasitologischen Zustand einer Weide treffen zu können, ist jedoch für die vorzunehmende Bekämpfungsstrategie von großem Interesse.

Molekularbiologische Möglichkeiten bieten sich auch in diesem Fall an, vergleichbar mit der Diagnose von Helmintheninfektionen (vgl. 2.1.1.6.2). Die Gewinnung von DNA aus Boden und Sedimentproben wurde bereits in einigen Studien untersucht und beschrieben (STEFFAN et al., 1988; TSAI und OLSEN, 1992a; KUSKE et al., 1998). Das vorrangige Ziel aller Untersuchungen war die Gewinnung von qualitativ möglichst hochwertiger DNA in Mengen, die eine molekulare Untersuchung ermöglichten. Des weiteren sollten die Verfahren möglichst schnell, wenig arbeitsaufwendig und wenig kostenintensiv sein.

Eine Gewinnung von DNA aus Umweltproben wurde in den letzten Jahren hauptsächlich zur Diagnostik von im Labor nur schwer kultivierbaren Mikroorganismen angewandt. Hauptsächlich wurden Methoden zur Isolation von Bakterien (TORSVIK et al., 1980; PICARD et al., 1992; SZABO et al., 1994a;

SABAT et al., 2000), Viren (STRAUB et al., 1995; MORAES et al., 1999) und Pilzen

Literaturübersicht _____ _________________________________50 (HOLBEN et al., 1988; TEBBE und VAHJEN, 1993; KUSKE et al., 1998)

beschrieben. Aber auch die Isolation der DNA von Nematodenstadien (Eier von Toxocara canis, Toxascaris leonina und Ancylostoma caninum) aus Sandproben wurde beschrieben (PAQUET-DURAND, 2001; KRÄMER et al., 2002).

DNA wurde hauptsächlich aus Proben gewonnen, deren Grundlage Boden- (HOLBEN et al., 1988; PICARD et al., 1992; SZABO et al., 1994b; DEGRANGE und BARDIN, 1995), Sand- (MORAES et al., 1999, PAQUET-DURAND, 2001; KRÄMER et al., 2002) oder Sedimentproben (STEFFAN et al., 1988; STEFFAN und ATLAS, 1988; HERRIK et al., 1993 u.a.) darstellten.

Die Gewinnung der DNA aus den Umweltproben kann auf zwei unterschiedlichen Wegen erfolgen. Zum einen werden die Zellen direkt in der Probe lysiert, und es folgen verschiedene Aufreinigungsschritte der DNA (TSAI und OLSON; 1991;

BRUCE et al., 1992; PICARD et al., 1992; SMALLA et al., 1992; ZHOU et al., 1996, PAQUET-DURAND, 2001; KRÄMER et al., 2002), zum anderen werden die zu bearbeitenden Zellen erst von der Probengrundlage (Sand oder Sediment) getrennt und anschließend erfolgte die Isolation der DNA (HOLBEN et al., 1988; STEFFAN und ATLAS, 1988; PILLAI et al., 1991). Die direkte Lyse der Zellen in den Umweltproben erzielt eine deutlich höhere Ausbeute an DNA verglichen mit der Abtrennung der Zellen aus der Probe vor der DNA-Isolation (STEFFAN et al., 1988).

Ein Nachteil ist jedoch, dass bei einer direkten DNA-Extraktion immer auch andere Bodenkomponenten, vorrangig die Huminsäuren, mit extrahiert werden, welche durch Interaktionen mit der DNA (STEFFAN et al., 1988) die PCR-Polymerase hemmen (TSAI und OLSON, 1992 b).

Eine notwendige Lyse der Zellen zur Isolation der DNA wird hauptsächlich auf zwei Wegen durchgeführt. Zum einen kann die Lyse enzymatisch mit Hilfe von Lysozym (TORSVIK et al., 1990; TSAI und OLSON, 1991; SMALLA et al., 1993; CLEGG et al., 1997 u.a.), oder mittels Proteinaseverdau erfolgen (TEBBE und VAHJEN, 1993;

ZHOU et al., 1996; HENNE et al., 1999; PAQUET-DURAND, 2001; KRÄMER et al., 2002). Eine andere Möglichkeit zur Isolation der DNA ist die physikalische Lyse der Zellen. Hierbei fanden vor allem die Temperatur-Schockbehandlung (PILLAI et al., 1991; CHO et al., 1996), die mechanische Zerstörung der Zellen in einer

____________________________________________________Literaturverzeichnis51 Glasperlenmühle (YEATES et al., 1997), der Einsatz von Ultraschall (PICARD et al., 1992) und das Zermahlen in flüssigem Stickstoff (JOHNSTON et al., 1994;

VOLOSSIUK et al., 1995; ZHOU et al., 1996) Verwendung. Auch wurden die einzelnen Methoden miteinander kombiniert. Ausschlaggebend für die Wahl des Verfahrens war die jeweilige Zellgrundlage, aus welcher die DNA isoliert werden sollte. Für die Lyse von Pilzen zur Gewinnung von DNA war der Einsatz von flüssigem Stickstoff notwendig (JOHNSTON et al., 1994). Bei einem Vergleich der unterschiedlichen Lyse-Verfahren von LEFF et al. (1995) zeigte sich, dass eine mechanische Zerstörung der Zellen durch eine Glasperlenmühle zwar eine deutlich höhere Menge an DNA ergibt als Temperatur-Schockbehandlungen, allerdings ist hierbei auch der Anteil an Kontaminationen höher. Eine Behandlung der Proben mit Schallwellen führte zu relativ kleinen DNA-Fragmenten von 100-500 bp, ein Resultat der starken Scherkräfte, die auf die DNA während dieser Prozedur einwirken.

Es wurden auch verschiedenfach kommerzielle Testsysteme zur DNA-Extraktion eingesetzt. So verwendeten TEBBE und VAHJEN (1993) das Genomic-Tip 500^TM -System. Das FastPrep-System^TM wurde von BORNEMAN et al. (1996) und MESEARCH et al. (2000) verwendet.

Ein grundlegendes Problem bei der Isolation von DNA aus Umweltproben ist die Kontamination mit Inhibitoren, vor allem mit Huminsäuren. Bereits 10 ng auf 100 µl inhibieren die Polymerase in der PCR (TSAI und OLSON, 1992). Es ist folglich notwendig, die DNA nach der Isolierung zu reinigen, ohne dabei allzu große Verluste an DNA zu verursachen. Eine Möglichkeit der Aufreinigung der DNA stellt die Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation dar (HOLBEN et al., 1988; STEFFAN et al., 1988; BRUCE et al., 1992; SMALLA et al., 1993; CLEGG et al., 1997). Weiterhin wurde versucht, die DNA über Hydroxylapatit-Säulen aufzureinigen (TORSVIK et al., 1990; TEBBE und VAHJEN, 1993; HENNE et al., 1999). Allerdings sind diese Methoden sehr zeitaufwendig, es können nur begrenzte Anzahlen von Proben untersucht werden und sie sind für die Routinediagnostik nicht einsetzbar.

Um den Zeitaufwand zu verringern, setzten PILLAI et al. (1991) die über eine Sucrase-Gradienten-Zentrifugation gewonnenen Zellen direkt als Matrize in einer PCR ein. Durch die verschiedenen Kombinationen von physikalischen Lysisprozessen gelangen PICARD et al. (1992) der Nachweis von bakterieller DNA

Literaturübersicht _____ _________________________________52 aus Umweltproben. Allerdings waren 3 Aufreinigungsschritte nötig, um die DNA in

der erforderlichen Reinheit zu erhalten. Ein Nachteil dieser Methode blieb jedoch die zeitgleiche Koextraktion von Fremd-DNA. Es war eine hohe Menge an Ziel-DNA notwendig, um diese mittels PCR nachweisen zu können.

Verschiedene Autoren arbeiteten mit kleinen Probenvolumina, um die Kontamination mit Huminsäuren möglichst gering zu halten (HERRICK et al., 1993; CHO et al., 1996; BORNEMAN et al., 1996).

Eine weitere Möglichkeit, die DNA zu reinigen, ist der Einsatz von Polyvinylpyrolidon (PVP). Bereits 1988 wurde der Einsatz dieser Substanz zu Reinigung von DNA beschrieben (HOLBEN et al., 1988; STEFFAN et al., 1988). HERRICK et al. (1993) verwendeten ein mit PVP supplementiertes Agarose-Gel. Bei der Diffusion der DNA in dem elektrischen Spannungsfeld des Gels wurden die Kontaminationen vermutlich von dem PVP gebunden und die DNA so gereinigt.

Zur Aufreinigung der DNA-Proben wurden auch kommerziell erhältliche Kits, wie z.B.

Elutip-d Säulen^TM (TSAI und OLSOL, 1991; CHO et al., 1996), Spinfilter^TM mit DNA-bindender Matrix (BORNEMAN et al., 1996), Fast-DNA Spin Kit for soil^TM (MESEARCH et al., 2000), GeneReleaser^® (YEATES et al., 1997; PAQUET-DURAND, 2001; KRÄMER et al., 2002) oder Maximator^® (KRÄMER et al., 2002) verwendet.

Gute Ergebnisse erzielten YEATES et al. (1997) mit der Behandlung der DNA mittels des GeneReleasers^®. Sie gewannen die DNA mit Hilfe einer direkten Lysis mit Glasperlen und Natriumdodecylsulfat-Puffer, gefolgt von einer Polyethylenglykol-Fällung, Kaliumazetat-Polyethylenglykol-Fällung, Phenol-Extraktion und Isopropanol-Fällung. Zu dem auf diese Weise gewonnenen DNA-Extrakt gaben sie das Polymer GeneReleaser^® nach Herstellerangaben. Hierdurch wurden die Inhibitoren zerstört und die DNA konnte ohne weitere Aufreinigungsschritte in der PCR amplifiziert werden. Es konnte jedoch nur 1 µl des Eluates verwendet werden. Dieses Polymer wurde auch von PAQUET-DURAND (2001) zur Reinigung eingesetzt, um parasitäre DNA aus Sandproben nachweisen zu können.

KRÄMER et al. (2002) verglichen in einer Studie das Polymer GeneReleaser^® mit der anti-inhibitorischen Substanz Maximator^® und stellten fest, dass beide Substanzen

____________________________________________________Literaturverzeichnis53 die Sensitivität der PCR deutlich verbesserten. Ein Nachteil des GeneReleasers^® ist der hohe Verbrauch an Polymerase in der PCR, was mit hohen Kosten verbunden ist. Der Verbrauch an Polymerase konnte durch den Einsatz des Maximators^® verringert werden.

Über die Untersuchung von Grasauswaschproben mittels Real-time-PCR auf dritte Larven von Magen-Darm-Strongyliden liegen bislang keine Daten vor.

Eigene Untersuchungen: Material_________________________________________ 54 3. Material und Methoden

3.1. Material

3.1.1. Versuchsaufbau

Im Sommer 2002 wurden 40 Ziegen und 40 Schafe auf den Weiden des Instituts für ökologischen Landbau in 23847 Trenthorst untersucht. Es wuden pro Tierart 2 Gruppen gebildet, so dass zwei Versuchs- und zwei Kontrollgruppen entstanden.

Jede Gruppe beweidete eine eigene Weide, es konnte nicht zu einem Vermischen der Gruppen kommen. Die Versuchsgruppen bekamen ab dem Tag des Austriebs (Tag 0, 07.05.02) für drei Monate täglich körpergewichtsabhängig Sporen von Duddingtonia flagrans (vgl. 3.1.4.) vermischt mit einer Portion Schrot (100 g/Tier und Tag) gefüttert. Die Kontrollgruppen erhielten lediglich eine vergleichbare Menge Schrot. Dieses Schrot stammt aus dem eigenen Anbau des Institutes für ökologischen Landbau und bestand zu je 50 % aus Hafer- und Gerstenschrot. Die Fütterung des Pilzes erfolgte drei Monate lang bis zum 31.07.02. Die Beprobung der Tiere erfolgte beginnend mit Tag 0 vierzehntägig. Hierbei wurden die Tiere gewogen, eine Konjunktivalschleimhautbeurteilung (FAMACHA^®-Wert) vorgenommen und eine Kotprobe von jedem Tier rektal gewonnen. Pro Weide wurde in spezifischer Weise eine Grasprobe gesammelt und zu 2 Sammelproben pro Weide zusammengefasst.

Im Abstand von 8 Wochen, 4 mal im Verlauf des Versuches, wurde den Tieren je eine Blutprobe zur Serumgewinnung und zur Analyse des Hämatokrits entnommen.

Nach 12 Wochen Weidezeit und zum Ende der Weidesaison wurden pro Weidefläche zwei Tracer-Tiere eingesetzt, welche drei Wochen lang die Flächen mit der jeweiligen Gruppe beweideten, danach aufgestallt wurden und nach Ablauf der

Nach 12 Wochen Weidezeit und zum Ende der Weidesaison wurden pro Weidefläche zwei Tracer-Tiere eingesetzt, welche drei Wochen lang die Flächen mit der jeweiligen Gruppe beweideten, danach aufgestallt wurden und nach Ablauf der

Im Dokument Untersuchungen zum Einfluss nematophager Pilze auf das Nematoden-Infektionsrisiko bei Schafen und Ziegen (Seite 43-0)