2. Literaturübersicht
3.2. Methoden
3.2.4. Gewinnung genomischer DNA aus L 3
3.2.5.4. Extraktion der DNA
Die DNA-Präparation wurde mit dem NucleoSpin®Tissue Kit der Firma Macherey und Nagel durchgeführt. Hierfür wurden die beigelegten Puffer und Proteinase K verwendet. Zur Vorbereitung auf den Proteinase-K-Verdau wurden die Larven kurzzeitig bei 95 °C erhitzt. Hierfür wurde das Larvenpellett mit möglichst wenig
______________________________________Eigene Untersuchungen: Methoden73 Wasser in 180 µl T1-Puffer suspendiert. Diese Suspension wurde danach bei 95°C für 10 min inkubiert. Nach erfolgter Abkühlung auf Raumtemperatur wurde jeder Probe 25 µl Proteinase K zugesetzt und die Mischung für mindestens 12 h, in der Regel über Nacht bei 56 °C und mäßigen Schütteln (550 rpm) im Thermomixer verdaut.
Nach dem Verdau erfolgte die Inaktivierung der Proteinase K durch Zugabe des B3-Puffer und eine weitere Inkubation für 10 min bei 70 °C. Im Anschluss an diese Inkubation erfolgte die Fällung der DNA. Zu diesem Zweck wurde die Probe für wenige Sekunden bei Höchstgeschwindigkeit anzentrifugiert, und im Anschluss wurden 210 µl Ethanol 99,6 % hinzupipettiert und die Probe vorsichtig gemischt.
Dann wurde die Probe vollständig über die Schleudersäulen des Kits gegeben und bei 10.000 U/min (8.400 g) für 60 sec zentrifugiert. Hierbei band die DNA an die Silicamembran der Säule und wurde so vom Durchfluss getrennt, welcher verworfen wurde. Wenn nach einmaliger Zentrifugation noch nicht alles Probengemisch aus der Säule entfernt war, wurde der Zentrifugationsschritt mit einer Geschwindigkeit von 14.000 U/min (16.464 g) wiederholt. An die Bindung der DNA an die Säule schloss sich ein zweimaliges Waschen der Membran an. Im ersten Waschschritt wurden 500 µl BW-Puffer auf die Säule pipettiert und diese bei 10.000 U/min (11760 g) für 60 sec zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Im Anschluss wurde die Probe mit 600 µl B5 Puffer gewaschen und erneut bei 10.000 U/min (11760 g) 60 sec lang zentrifugiert. Um die Silicamembran zu trocknen und alle Reste des Ethanols aus der Membran zu entfernen, wurden die Proben dann bei 14.000 U/min (16464 g) für 3 min zentrifugiert.
Zur Elution der DNA wurde die Säule auf ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß gesteckt und 25 µl autoklaviertes destiliertes Wasser mit einer Temperatur von 70 °C hinzupipettiert. Die Probe wurde dann für 60 sec bei Raumtemperatur inkubiert und bei 14.000 U/min (16464 g) 60 sec zentrifugiert. Dieser Elutionsschritt wurde wiederholt, so dass die gewonnene DNA in 50 µl gelöst vorlag. Die so isolierte DNA wurde bis zum Gebrauch bei –20 °C gefroren gelagert.
Eigene Untersuchungen: Methoden _______________________________________74 3.2.6. Gewinnung genomischer DNA aus Weidegrasproben
3.2.6.1. Gewinnung von Grasproben mit oder ohne definierten Larvengattungen Um Grasproben ohne Parasitenstadien untersuchen zu können, wurden Grasproben von Flächen, die nie mit kleinen Wiederkäuern beweidet worden waren, gesammelt.
Diese Proben wurden entsprechend den Weideproben aus dem Versuch 2002 nach der Methode von SIEVERS PREKEHR (1971) aufbereitet.
Weiterhin wurden Proben benötigt, welche definierte Ausgangskonzentrationen der einzelnen Gattungen aufwiesen. Hierfür wurden erneut Grasproben von bekannt parasitennegativen Flächen gesammelt und diese im Labor mit der gewünschten Zahl lebender Larven versetzt. Hierfür wurden die Larven aus der Stammhaltung des Instituts für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover verwendet. Zum Einsatz kamen die Arten Cooperia oncophora, Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta und Trichostrongylus colubriformis. Um eine möglichst gleichmäßige Verteilung der Larven in der Probe zu erreichen, wurden die Proben nach Zugabe der Larven bei Raumtemperatur für mindestens drei Stunden ruhen gelassen. Im Anschluss erfolgte die Gewinnung der Larven nach der Methode von SIEVERS PREKEHR (1971).
Angefertigt wurden insgesamt 9 Proben. 4 Proben enthielten jeweils 5000 infektiöse Larven einer Art. Weiter wurden eine Probe mit 2000 L3 Haemonchus contortus, eine mit je 2000 L3 Haemonchus contortus und Trichostrongylus colubriformis, eine mit je 2000 Larven der Gattung Haemonchus, Trichostrongylus und Cooperia und eine Probe mit je 2000 Larven jeder Gattung. Es wurde zudem eine Probe mit je 1000 Larven einer Gattung angefertigt.
Aus der Probennahme im Jahr 2002 wurden exemplarisch 6 Proben ausgewählt und mittels PCR untersucht. In Tabelle 2 sind die Proben dem jeweiligen Probentermin und der Probennummer zugeordnet.
______________________________________Eigene Untersuchungen: Methoden75
Proben-
Nummer Datum und Probennummer Probe 1 17.07.02, Nr. 7 Probe 2 27.08.02, Nr. 7 Probe 3 22.10.02, Nr. 7 Probe 4 09.09.02, Nr. 3 Probe 5 25.09.02, Nr. 3 Probe 6 22.10.02, Nr. 8
Tabelle 2: Auswahl und Nummerierung der in der PCR untersuchten Grasproben
3.2.6.2. Entscheidung der infektiösen Larven in der Grasprobe
Analog zu den Larvenkulturen mussten auch die Larven der Grasauswaschproben vor Beginn des Proteinaseverdaus entscheidet werden. Hierfür wurde ebenfalls Natriumhypochlorid eingesetzt. Die Auswaschproben wurden in ein 50 ml Reaktionsgefäß überführt und bei 3500 U/min (3640 g) 10 min zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand vorsichtig mit einer Wasserstrahlpumpe bis auf das Sediment abgenommen. Zu diesem wurden 1000 µl Natriumhypochlorid (12%
Cl-) hinzupipetiert, dieses Gemisch unter Schütteln für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert und das Reaktionsgefäß im Anschluss mit Leitungswasser aufgefüllt. Es folgte ein Zentrifugationsschritt bei 3500 U/min (3640 g) für 10 min, nach welchem der Überstand vorsichtig abgenommen und verworfen wurde. Durch dreimaliges Wiederholen dieses Waschschrittes wurde das Natriumhypochlorid aus der Probe entfernt.
3.2.6.3. Extraktion der DNA aus den Grasauswaschproben
Die Extraktion der DNA aus den Auswaschproben orientierte sich an dem Protokoll für die Gewinnung der DNA aus den Larvenkulturen. Für die Lösungen wurde ebenfalls der NucleoSpin®Tissue Kit der Firma Mackerey und Nagel verwendet. Die Mengen wurden entsprechend angeglichen. Die Probe mit den entscheideten dritten Larven wurde zentrifugiert (3500 U/min für 10 min) und der Überstand bis auf 2,75 g abgenommen. Zu dem verbliebenen Sediment wurde 1 ml T1 Puffer hinzugegeben und die Probe bei 95 °C für 10 min im Wasserbad inkubiert, um die Larven
Eigene Untersuchungen: Methoden _______________________________________76 abzutöten. Nachdem die Probe wieder auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurden
250 µl Proteinase K hinzugefügt und die Probe in dem Thermomixer Hybaid Micro-4 bei 56 °C unter ruhigem Schütteln für mindestens 12 h inkubiert.
Am Ende des Verdaus wurde die Probe für 10 min bei 4000 U/min (4160 g) zentrifugiert. Von dem entstandenen Überstand wurden 1 ml abpipettiert und in einem 11 ml Reaktionsgefäß mit 1 ml B3 Puffer vermischt. Diese Mischung wurde dann bei 70 °C für 10 min im Wasserbad inkubiert. Anschließend erfolgte die Alkoholfällung der DNA durch Zugabe von 1 ml 99,6 % Ethanol. Nach kräftigem Schütteln wurden 750 µl der Mischung auf eine Säule aufgetragen und die DNA-Extraktion analog zur Präparation der Larvenkulturen durchgeführt. Abweichend von dieser wurde die DNA mit 2 x 50 µl autoklaviertem destiliertem Wasser eluiert.
Im Vorversuch zeigte sich, dass nach einmaliger Isolierung keine DNA in der PCR zu vervielfältigen waren. Um ggf. noch vorhandene PCR-Inhibitoren zu eliminieren, wurde nach der von PAQUET-DURAND (2001) verwendeten Methode eine weitere Isolierung angeschlossen. Hierfür wurden die 100 µl Eluat aus der ersten Extraktion im Verhältnis 1:1 mit 100 µl B3 Puffer und 100 µl 99,6 % Ethanol versetzt und gut vermischt. Diese Probe wurde dann auf eine Säule aufgetragen und für 60 sec bei 10.000 U/min (11.760 g) zentrifugiert. Es folgten die gleichen Waschschritte und die gleiche Elution wie bei der ersten DNA-Extraktion. Die so gewonnene DNA wurde bei –20 °C gelagert.
3.2.7. Real-time PCR der Larvenproben
Wie bereits in Abschnitt 3.2.6.1. beschrieben, wurden von 20 Larvenkulturen jeweils 1000 Larven in der Real-time-PCR untersucht. Jede Probe wurde in mindestens 2 PCR-Läufen mit spezifischen Primern und Sonden auf das Vorhandensein von DNA von Magen-Darm-Strongyliden untersucht. Insgesamt wurde eine Probe mindestens 8 PCR-Läufen unterzogen. Als Standard wurde linearisierte ITS2-Sequenzen enthaltende Plasmid-DNA der entsprechenden Gattung (V. SAMSON-HIMMELSTJERNA et al., 2002) in Verdünnungsreihen von 102,103,104,105 und 106 Kopien/Probe eingesetzt. Die Primer entsprachen alle einer Teilsequenz im ITS2-Bereich des Genoms des Nematoden.
______________________________________Eigene Untersuchungen: Methoden77 Als Sonden wurden mit dem Farbstoff FAM (6-Carboxy-Fluorescein) am 5´-Ende markierte Oligonukleotide verwendet, welche mit MGB (minor groove binder) konjugiert waren (V. SAMSON-HIMMELSTJERNA et al., 2002). Als Referenzfarbstoff wurde ROX (6-Carboxy-X-Rhodamin) verwendet. Für die Negativkontrolle wurde anstelle der genomischen DNA doppelt dest. Wasser eingesetzt.
Bei der Real-time PCR der Larvenproben wurden als Grundlage für den Mastermix die Reaktionslösungen des Brilliant®QPCR Core Reagent Kits der Firma Stratagene, USA eingesetzt.
Pro Reaktion (well, 25µl) wurden folgende Mengen und Konzentrationen der Reaktionslösungen eingesetzt:
Autoklaviertes dest. Wasser 14,97 µl Reaktionspuffer 10x 2,5 µl
dNTP (20mM) 1,0 µl
MgCl2 (50mM) 2,78 µl
Vorwärtsprimer (7 pmol) 1,07 µl Rückwärtsprimer (7 pmol) 1,07 µl Referenzfarbstoff 0,38 µl Sonde (50 pmol) 0,10 µl PCR-Polymerase (5 U/µl) 0,13 µl Genomische DNA 1,00 µl
Der Referenzfarbstoff wurde für jeden Lauf frisch aus folgenden Anteilen zusammengesetzt:
Autoklaviertes dest. Wasser 89,5 µl Reaktionspuffer 10 x 10,0 µl
ROX 0,5 µl
Bei der verwendeten PCR-Polymerase handelte es sich um die dem Kit eigene SureStart® Polymerase. Diese ist eine Hot-start-Polymerase, wird also erst durch eine Temperatur von 95 °C über mindestens 5 min aktiviert. Des weiteren wurde die PCR als two-step PCR durchgeführt, was bedeutet, dass Annealing und Extension bei gleicher Temperatur durchgeführt werden. Dies ergibt folgendes Temperaturprofil (V. SAMSON-HIMMELSTJERNA et al., 2002):
Eigene Untersuchungen: Methoden _______________________________________78 Aktivierung der Polymerase 95 °C 10 min
Denaturierung der DNA 95 °C 15 sec
Annealing und Extension 62 °C 1 min
Bei jeder PCR wurden 40 Zyklen durchgeführt, und bei jedem Zyklus fand die Messung der Fluoreszenz der Farbstoffe ROX und FAM statt.
Die PCR wurde in dem MX4000-Thermocycler der Firma Stratagene, La Jolla, USA, durchgeführt.
Eine Auswertung der Läufe erfolgte mit dem Software-Programm des MX4000 anhand der Ct-Werte. Diese Werte beschreiben den Zyklus, in dem der Schwellenwert der Hintergrundfluoreszenz überschritten wird. Die Hintergrundfluoreszenz wurde anhand von mind. 4 der ersten 15 Zyklen berechnet.
Mit der Option der „adaptive baseline“ wurde für jeden Messwert die Hintergrundfluoreszenz eigens errechnet. Zur Analyse der Ergebnisse wurde die gemessene normalisierte Baseline-korrigierte Fluoreszenz (dRn) verwendet.
3.2.8. Real-time PCR der Grasauswaschproben
Für die Real-time PCR der Grasauswaschproben kamen Grasproben mit definierten Mengen von Larven zum Einsatz. Des weiteren wurden 6 Proben der Feldstudie 2002 untersucht. Ziel war die Entwicklung einer Nachweismöglichkeit von genomischer DNA von Magen-Darm-Strongyliden in Auswaschproben.
Analog zu den Larvenkulturproben wurden die Grasauswaschproben aus Trenthorst 2002 mit jeder Primerkombination untersucht. Die eingesetzten Primer und Sonden entsprachen denen der Larvenkultur-PCR. Als Standard wurde ebenfalls linearisierte, ITS2-Sequenzen enthaltende Plasmid-DNA (V. SAMSON-HIMMELSTJERNA et al., 2002) in Verdünnungsreihen von 102,103,104,105 und 106 Kopien/Probe hinzugefügt.
Der Referenzfarbstoff war auch in dieser Untersuchung ROX und als Negativkontrolle wurde an Stelle der genomischen DNA autoklaviertes destiliertes Wasser eingesetzt.
______________________________________Eigene Untersuchungen: Methoden79 Als Grundlage für den Mastermix dienten die Reaktionslösungen der Silverstar® DNA Kits.
Es ergab sich folgende Zusammensetzung eines Wells (25 µl):
Autoklaviertes dest. Wasser 15,00 µl Reaktionspuffer 10x 2,5 µl
dNTP (20mM) 1,0 µl
MgCl2 (50mM) 2,78 µl
Vorwärtsprimer (7 pmol) 1,07 µl Rückwärtsprimer (7 pmol) 1,07 µl Referenzfarbstoff 0,38 µl Sonde (50 pmol) 0,10 µl PCR-Polymerase (5 U/µl) 0,10 µl Genomische DNA 1,00 µl
Die Zusammensetzung des Referenzfarbstoffs entsprach dem der Larvenkultur-PCR und wurde ebenfalls für jeden Lauf frisch angesetzt.
Die Silverstar DNA-Polymerase ist keine Hot start Polymerase. Daher ergab sich folgende Änderung im Temperaturprofil:
Denaturierung der DNA 95 °C 15 sec Annealing und Extension 62 °C 1 min
Die PCR wurde ebenfalls auf dem MX4000 durchgeführt und die Analyse der Ergebnisse erfolgte entsprechend zu den Ergebnissen der Larvenkultur-PCR.
3.2.9. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte an den Rechnern der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Der Vergleich der ermittelten Daten wurde mit dem t-Test und dem Mann Whitney Rank Sum Test der Programme SigmaStat 2.0 und SigmaPlot (Jandel Scientific) durchgeführt.
Eigene Untersuchungen: Ergebnisse _______________________________________80 4. Ergebnisse
4.1. Allgemeines
Bei jeder Probennahme wurden die Tiere einer allgemeinen Adspektion unterzogen, um durch Endoparasiten oder anderen Krankheiten hervorgerufenen Symptome zu erkennen und im folgenden zu behandeln. Hierbei fiel 4 Wochen nach Weideaustrieb besonders die Versuchsgruppe der Schafe durch hgr. Lahmheit auf. Es wurde eine Moderhinkeinfektion diagnostiziert und Anfang September wurden alle 40 Schafe mit einer Dichelobacter nodosus (Serotypen A, B1+2, C, D, E, F, G, H und 1) enthaltenden Vakzine (Footvax®, Essex, München) gegen Moderhinke behandelt.
Nach dem Austrieb auf die Weide wurde bei drei Ziegen (6010, 6024 und 6021) eine fiebrige Bronchopneumonie diagnostiziert. Die Tiere wurden durch den Haustierarzt mit Lachesis, Pyrogenium und Argentum met. (Pyrogenium®, Plantavet, Bad Waldsee, Dosis: 5,0 ml/Tier s.c.), Vincetoxicum hirundinaricum D6, D10 und D30 und Sulfur D4 und D10 (Engystol®, Heel, Baden-Baden, Dosis: 5,0 ml/Tier s.c.) und Bromhexin (Bisolvon®, Boehringer, Ingelheim, Dosis: 0,17 ml/kg i.m. KGW) behandelt.
Über den Sommer entwickelten mehrere Tiere Symptome einer Parasitose mit Durchfall, struppigem und verschmutztem Haarkleid, Mattigkeit und Kachexie. Ende Juli wurden die Symptome bei einzelnen Tieren so stark, dass zum Schutz der Tiere eine anthelminthische Therapie durchgeführt wurde. Aus den Kontrollgruppen wurden jeweils 2 Schafe (5038 und 5036) und 5 Ziegen (6016, 6018, 6030, 6032, 6035) behandelt. Die Behandlung erfolgte bei den Schafen mit 5 mg/kg KGW und bei den Ziegen mit 7,5 mg/kg KGW Levamisol s.c. (Citarin® 2,5 %, Bayer, Leverkusen).
Anfang September zeigten 3 weitere Ziegen der Kontrollgruppe (6027, 6034, 6037) starke Symptome einer Parasitose und wurden zur besseren Überwachung aufgestallt. Sie wurden mit Levamisol (Citarin® 2,5 %, Bayer, Leverkusen) sowie Melissenblätter, Wermutkraut, Kamillenblüten und Fichtenspitzen (Stullmisan®S Pulver, Essex, München, Dosierung: 3 x tgl. 8 g p.o.) therapiert. Nach 2 Tagen konnten die Ziegen 6027 und 6037 wieder in die Herde integriert werden, die Ziege 6034 blieb aufgrund schlechten Allgemeinbefindens bis zum Ende des Versuches im Stall. Mitte September zeigte die Ziege 6038 starken Durchfall und ein Unterkieferödem. Das Tier wurde daraufhin aufgestallt und wie die anderen erkrankten Tiere behandelt. Als es nach 2 Tagen festlag und hgr. exsikkotisch war,
______________________________________Eigene Untersuchungen: Ergebnisse81 wurde es euthanasiert. Tabelle 3 gibt eine Übersicht über die erkrankten Tiere mit den aufgetretenen Symptomen. Um zu verhindern, dass weitere Tiere stark erkrankten, wurde daraufhin am 19.09.02 eine anthelminthische Therapie aller Tiere sowohl der Versuchs- als auch der Kontrollgruppen mit Levamisol in der oben genannten Dosierung durchgeführt. Anfang September zeigte die Ziege 6039 der Versuchsgruppe eine hgr. Lahmheit hinten links. Die Untersuchung ergab ein Zwischenklauengeschwür mit Gelenksbeteiligung. Das Tier wurde für 10 Tage aufgestallt und mit täglich wechselnden Verbänden therapiert.
Ab Anfang September wurde beiden Ziegengruppen Heu zugefüttert.
Eigene Untersuchungen: Ergebnisse _______________________________________82
Nummer
(Schafe) Zeitpunkt Symptom(e) Nummer
(Ziegen) Zeitpunkt Symptom(e) 5036 (K) 21.05.02 Durchfall 6007 (V) 18.06.02 Abmagerung 5033 (K) 04.06.02 Durchfall 6026 (V) 18.06.02 Abmagerung 5035 (K) 04.06.02 Durchfall 6026 (V) 30.07.02 Durchfall 3018 (K) 02.07.02 Durchfall 6016 (K) 30.07.02 Durchfall 5007 (V) 02.07.02 Durchfall 6018 (K) 30.07.02 Durchfall 5017 (V) 02.07.02 Durchfall 6030 (K) 30.07.02 Durchfall 5016 (K) 17.07.02 Durchfall 6032 (K) 30.07.02 Durchfall 5020 (K) 17.07.02 Durchfall 6035 (K) 30.07.02 Durchfall 5005 (V) 30.07.02 Blutiger
Durchfall 6038 (K) 30.07.02 Durchfall 5030 (V) 09.09.02 Durchfall 6028 (K) 13.08.02 Durchfall 6034 (K) 13.08.02 Durchfall 6021 (V) 27.08.02 Durchfall 6038 (K) 27.08.02 Durchfall 6038 (K) 09.09.02 Durchfall,
Unterkieferödem 6038 (K) 16.09.02 Durchfall,
Unterkieferödem 6038 (K) 18.09.02 Durchfall,
Unterkieferödem, Exsikkose, Euthanasie 6017 (K) 05.11.02 Durchfall 6023 (K) 05.11.02 Kehlgangsödem 6021 (V) 05.11.02 Durchfall,
Kehlgangsödem Tabelle 3: Ohrmarkennummer, Zuordnung der Tiere (V=Versuch, K=Kontrolle), Datum und aufgetretene Symptome.
______________________________________Eigene Untersuchungen: Ergebnisse83 4.2. Klassische Methoden
4.2.1. Körpergewichte
Um Gruppen mit ähnlichen Körpergewichten zu erhalten, wurden die Tiere am Tage des Austriebs ihrem Körpergewicht entsprechend zu Paaren zusammengefasst und dann zufällig in die eine oder andere Gruppe eingeteilt. Damit wurde erreicht, dass die mittleren Körpergewichte der vier Gruppen am Tag des Austriebs ähnlich waren (Tabelle 4).
Schafe Versuch Schafe Kontrolle Ziegen Versuch Ziegen Kontrolle Ohrmarke KGW
Tabelle 4: Paare nach KGW in kg sortiert am Tag 0
Schafe
Zu Beginn des Versuchs lag das mittlere Körpergewicht der Versuchsgruppe um 1,3 kg über dem der Kontrollgruppe (Versuch: 37,3 kg ± 14,3; Kontrolle: 36,0 kg ± 13,96).
Nach 8 Wochen Weidezeit war das durchschnittliche Gewicht der Versuchsgruppe um 6,5 kg auf 43,8 kg (±14,1) angestiegen. Das Gewicht der Kontrollgruppe war um
Eigene Untersuchungen: Ergebnisse _______________________________________84 5,9 kg gestiegen. Weitere 8 Wochen später lag das mittlere Gewicht der
Kontrollgruppe um 900 g über dem der Versuchsgruppe (Versuch: 47,1 kg ±12,9;
Kontrolle: 48,0 kg (± 15,2). Bei Abtrieb der Tiere von den Weiden lag das durchschnittliche Gewicht der Versuchsgruppe bei 57,4 kg (±12,8) und in der Kontrollgruppe bei 54,1 kg (±16,4). Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen konnten nicht ermittelt werden (p 0,05).
Einen Vergleich der durchschnittlichen Körpergewichte der Schafe über die Versuchsdauer stellt Abb. 2 dar.
Zeit
Mai Jun Jul Aug Sep Okt Nov
Körpergewicht in Kg
0 20 40 60 80
Schafe Kontrolle Schafe Versuch
Abbildung 2: Gewichtsentwicklung der Schafe im Vergleich
______________________________________Eigene Untersuchungen: Ergebnisse85 Ziegen
Zu Beginn der Weideperiode lag das durchschnittliche Körpergewicht der Versuchsgruppe bei 26,3 kg (±12,2), das der Kontrollgruppe um 100 g höher bei 26,4 kg (±11,3). Die Gewichtsspanne reichte in der Versuchsgruppe von 11,1 kg bis 48,4 kg und in der Kontrollgruppe von 15,2 kg bis 45,7 kg. Nach 8 Wochen Versuchsdauer zeigten beide Gruppen ein gleiches Durchschnittsgewicht mit 29,9 kg. Ab Juli begann sich eine Differenz zwischen beiden Gruppen zu entwickeln. Das Körpergewicht der Versuchstiere stieg stärker als das der Kontrollgruppe. Ende August lag es bei 32,2 kg (±10,9) und das der Kontrollgruppe bei 30,5 kg (±12,2). Bei Ende der Weidezeit lag das Durchschnittsgewicht der Versuchstiere bei 39,9 kg (±10,3) und das der Kontrolltiere bei 38,2 kg (± 11,1) Körpergewicht. Das leichteste Tier in beiden Gruppen wog 25,3 kg, das schwerste Tier in der Versuchsgruppe 59,4 kg und in Kontrollgruppe 56,6 kg. Auch für die beiden Ziegengruppen konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede ermittelt werden (p 0,05). Abb. 3 stellt die Gewichtsentwicklung der beiden Ziegengruppen im Vergleich dar. Die genauen Gewichte der einzelnen Tiere über die Saison, sowie deren statistische Analyse sind in den Tabellen 36-40 im Anhang aufgeführt.
Eigene Untersuchungen: Ergebnisse _______________________________________86
Zeit
Mai Jun Jul Aug Sep Okt Nov
Körpergewicht in Kg
0 10 20 30 40 50 60
Ziegen Kontrolle Ziegen Versuch
Abbildung 3: Gewichtsentwicklung der Ziegen im Vergleich
4.2.2. Famacha®-Werte
Schafe
Bei Austrieb der Tiere auf die Weiden lagen die mittleren Famacha®-Werte in beiden Gruppen bei 2,6 (±2,19). Nach 6 Wochen hatten sich nur ggr. Unterschiede entwickelt. Die Kontrollgruppe zeigte mittlere Famacha®-Werte von 1,95 (±3,60) und die Versuchsgruppe von 1,90 (±2,79). Bei Ende der Pilzfütterung lagen die mittleren Famacha®-Werte der Kontrollgruppe bei 3,45 (±3,87) und die Werte der Versuchsgruppe bei 2,95 (±2,64). Für beide Gruppen stellte dieser Wert gleichzeitig den Maximalwert dar. Nach weiteren 4 Wochen Weidezeit waren zwischen den beiden Gruppen keine Unterschiede mehr zu erkennen. Nach der anthelminthischen Therapie zeigte die Kontrollgruppe einen mittleren Famacha®-Wert von 2,3 (±4,02) und die Versuchsgruppe einen von 2,35 (±3,81). Bei Ende des Versuches lagen die
______________________________________Eigene Untersuchungen: Ergebnisse87
mittleren Famacha®-Werte für die Versuchsgruppe bei 2,15 (±4,07) und für die Kontrollgruppe bei 2,0 (±3,46). Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Schafgruppen ermittelt werden (p 0,05). Abb. 4 stellt den Verlauf der Famacha®-Werte für die Schafgruppen graphisch dar.
Ziegen
Bei Beginn des Versuches am Tag 0 waren die mittleren Famacha®-Werte in beiden Gruppen ähnlich. Sie lagen in der Versuchsgruppe bei 2,65 (±2,53) und in der Kontrollgruppe bei 2,63 (±2,53). Nach 6 Wochen zeigten die Versuchstiere mit 3,1 (±3,13) einen höheren mittleren Famacha®-Wert als die Kontrollgruppe mit 2,7 (±2,86). Bei Ende der Pilzfütterung lagen die mittleren Famacha®-Werte der Kontrollgruppe bei 3,8 (±2,68) und die Werte der Versuchsgruppe bei 3,7 (±2,86).
Dieser Wert stellt für die Versuchsgruppe den Maximalwert dar. Die Kontrollgruppe erreichte diesen mit einem mittleren Famacha®-Wert von 4,0 (±3,16) Anfang September. Nach der anthelminthischen Therapie wurden die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen deutlich geringer. Am Ende des Versuchs lagen die mittleren Famacha®-Werte für die Versuchsgruppe bei 2,4 (±3,29) und für die Kontrollgruppe bei 2,65 (±3,14). Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Ziegengruppen ermittelt werden (p 0,05). Abb. 4 stellt die einzelnen Gruppendurchschnittswerte der Ziegen über die Weideperiode im Vergleich dar. Die individuellen Werte der Tiere sind im Anhang in den Tabellen 41-44 aufgeführt.
Eigene Untersuchungen: Ergebnisse _______________________________________88
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
0 d 14 d 28 d 42 d 56 d 70 d 84 d 98 d 112 d 126 d 140 d 154 d 168 d 182 d Zeit
Famacha-Gruppendurchschnitt
SK SV ZK ZV
Abbildung 4: Durchschnittliche Famacha®-Werte der Gruppen (S=Schafe, Z=Ziegen, V=Versuch, K=Kontrolle)
4.2.3. Kotproben
4.2.3.1. EpG
Magen-Darm-Strongyliden Schafe
Am Tage des Austriebs zeigten alle zweitsömmrigen Schafe einen Befall mit Magen-Darm-Strongyliden im EpG. Alle Jungtiere zeigten ein negatives EpG für MDS-Eier.
Hieraus ergaben sich eine mittlere Eizahl von 305 (± 331) für die Versuchs- und eine mittlere Eizahl von 365 (±547) für die Kontrollgruppe. Am Tag 0 lag der Befall mit MDS in beiden Gruppen somit bei 65 %. Nach sechs Wochen zeigten alle Tiere beider Gruppen ein positives EpG für Magen-Darm-Strongyliden. Das Gruppenmittel lag für die Versuchsgruppe bei 305 (±360) und für die Kontrollgruppe bei 185 (±232
).
Die Eizahlen pro g Kot der Kontrollgruppe stiegen bis zum Ende der Pilzfütterung (30.07.02) auf 584 (±1329) und fielen danach wieder ab. Die mittlere Eiausscheidung dieser Gruppe lag am 09.09.02 bei 409 (±394).
______________________________________Eigene Untersuchungen: Ergebnisse89 In der Versuchsgruppe lag die mittlere Eiausscheidung zum Ende der Pilzfütterung bei 397 (±628). Diese Werte stiegen zum 09.09.02 hin noch an und erreichten ein maximales Gruppenmittel von 698 (±940).
Nach der anthelminthischen Therapie wurden in der Kontrollgruppe keine Eier im EpG festgestellt. In der Versuchsgruppe wurde für ein Tier eine mittlere Eizahl von 33 Eiern pro g Kot festgestellt, alle anderen Tiere dieser Gruppe waren negativ. Bis zum Ende des Versuchs stiegen die Eizahlen der Versuchsgruppe wieder auf 183 (±410), die der Kontrollgruppe auf 78 (±109) Eier pro g Kot.
Einen genauen Verlauf der mittleren Eizahlen zeigt Abb. 5 (vgl. Tabelle 11).
Zeit
Mai Jun Jul Aug Sep Okt Nov Dez
Eizahlen/g Kot
0 200 400 600 800
Schafe Versuch Schafe Kontrolle
Abbildung 5: MDS-Eizahlen / g Kot der Schafgruppen über die Saison im Vergleich
Bei einem alleinigen Vergleich der Jungtiere der Gruppen zeigte die Versuchsgruppe 6 Wochen nach dem Austrieb eine mittlere Eizahl von 505 (±472). Am selben Probentermin lag der Wert für die Kontrollgruppe bei 186 (±157). Am Ende der Pilzfütterung zeigten die Versuchstiere eine mittlere Eiausscheidung von 889 (±871) und die Kontrolltiere von 1800 (±1966). Dies war für diese Gruppe zugleich der Maximalwert. Am 09.09.02 lag der mittlere EpG-Wert der Versuchsgruppe bei 1613 (±1293), derjenige der Kontrollgruppe bei 800 (±209). Am Ende des Versuches lagen
Eigene Untersuchungen: Ergebnisse _______________________________________90
die Eizahlen für die Versuchsgruppe bei 448 (±563) und für die Kontrollgruppe bei 162 (±117). Den genauen Verlauf der mittleren Eizahlen pro g Kot der Jungtiere zeigt
die Eizahlen für die Versuchsgruppe bei 448 (±563) und für die Kontrollgruppe bei 162 (±117). Den genauen Verlauf der mittleren Eizahlen pro g Kot der Jungtiere zeigt