Versuchsaufbau

Im Sommer 2002 wurden 40 Ziegen und 40 Schafe auf den Weiden des Instituts für ökologischen Landbau in 23847 Trenthorst untersucht. Es wuden pro Tierart 2 Gruppen gebildet, so dass zwei Versuchs- und zwei Kontrollgruppen entstanden.

Jede Gruppe beweidete eine eigene Weide, es konnte nicht zu einem Vermischen der Gruppen kommen. Die Versuchsgruppen bekamen ab dem Tag des Austriebs (Tag 0, 07.05.02) für drei Monate täglich körpergewichtsabhängig Sporen von Duddingtonia flagrans (vgl. 3.1.4.) vermischt mit einer Portion Schrot (100 g/Tier und Tag) gefüttert. Die Kontrollgruppen erhielten lediglich eine vergleichbare Menge Schrot. Dieses Schrot stammt aus dem eigenen Anbau des Institutes für ökologischen Landbau und bestand zu je 50 % aus Hafer- und Gerstenschrot. Die Fütterung des Pilzes erfolgte drei Monate lang bis zum 31.07.02. Die Beprobung der Tiere erfolgte beginnend mit Tag 0 vierzehntägig. Hierbei wurden die Tiere gewogen, eine Konjunktivalschleimhautbeurteilung (FAMACHA^®-Wert) vorgenommen und eine Kotprobe von jedem Tier rektal gewonnen. Pro Weide wurde in spezifischer Weise eine Grasprobe gesammelt und zu 2 Sammelproben pro Weide zusammengefasst.

Im Abstand von 8 Wochen, 4 mal im Verlauf des Versuches, wurde den Tieren je eine Blutprobe zur Serumgewinnung und zur Analyse des Hämatokrits entnommen.

Nach 12 Wochen Weidezeit und zum Ende der Weidesaison wurden pro Weidefläche zwei Tracer-Tiere eingesetzt, welche drei Wochen lang die Flächen mit der jeweiligen Gruppe beweideten, danach aufgestallt wurden und nach Ablauf der Präpatenz zur Bestimmung und Differenzierung der Wurmbürde seziert wurden.

Aufgrund des langsamen Wachstums der Vegetation durch nasskaltes Wetter im Frühjahr wurde der Tag des Versuchsbeginns auf den 07.05.02 gelegt. Der Versuch endete am 05.11.02, 14 Tage nach dem Aufstallen der Tiere am 22.10.02.

_________________________________________Eigene Untersuchungen: Material55 3.1.2. Versuchstiere

Bei den Ziegen handelte es sich um 40 „Bunte deutsche Edelziegen“

unterschiedlichen Alters, welche alle aus dem gleichen Ursprungsbetrieb stammten.

14 Tiere wurden im Winter 2000/2001 geboren und im Herbst 2001 vom Institut für ökologischen Landbau erworben. Von diesen Tieren wurde im Dezember 2001 jeweils eine rektale Kotprobe koprologisch im Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover untersucht. Es wurde durch ein kombiniertes Sedimentations-Flotationsverfahren ein Befall mit Magen-Darm-Strongyliden festgestellt, welche sich resistent gegenüber Benzimidazolen zeigten. Andere Endoparasiten konnten nicht festgestellt werden. Die Tiere wurden vom Hoftierarzt im Dezember anthelminthisch mit Albendazol (7,5 mg/kg KGW) therapiert. Im Januar 2002 wurde ein Befall mit Trichuris bei diesen Tieren festgestellt und die Tiere wiederum mit einem Benzimidazolpräparat therapiert.

26 Ziegen wurden im Winter 2001/2002 geboren und erst im April 2002 von dem Institut zugekauft. Je eine rektale Kotprobe dieser Tiere wurde am 26.04.02 im Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover untersucht und es wurde ein ggr. Befall mit Strongyloides papillosus und Kokzidien festgestellt. Auf eine Therapie der Tiere wurde verzichtet.

Bei den Schafen handelte es sich um 37 schwarze „Ostfriesische Milchschafe“ und 3

„Merinolandschafe“. Die Merinolandschafe wurden ebenso wie 23 ostfriesische Milchschafe im Winter 2000/2001 geboren. Diese Tiere wurden alle im Herbst 2001 von dem Institut für ökologischen Landbau erworben. Eine koprologische Untersuchung dieser Tiere im Dezember 2001 ergab keine Hinweise auf eine Infektion mit Magen-Darm-Strongyliden oder anderen Endoparasiten.

Die übrigen 14 ostfriesische Milchschafe wurden im Winter 2001/2002 geboren und im April 2002 von dem Institut erworben. Kotproben dieser Tiere wurden ebenso wie die der jungen Ziegen im April 2002 im Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover koprologisch untersucht. Es wurde ein ggr. Befall mit Kokzidien nachgewiesen und auf eine Therapie der Tiere verzichtet.

Eigene Untersuchungen: Material_________________________________________ 56 3.1.3. Versuchsweiden

Die Weiden für diesen Versuch gehören zum Institut für ökologischen Landbau in Trenthorst, 23847 Westerau. Es handelte sich dabei um die Flächen Kornsah 2 und 3, welche im Ortsteil Wulmenau (23847 Westerau) liegen. Sie wurden über mehrere Jahre lediglich zur Heugewinnung genutzt. Im Dezember 2001 und im März 2002 wurden die Weideflächen von einer Gruppe kleiner Wiederkäuer für jeweils 2 Wochen beweidet. Für den Versuch wurden die Weiden in Parzellen zu je 0,7 ha/Gruppe eingeteilt und eingezäunt. Bei der Umzäunung wurde ein 3 m breiter Knick zwischen die beiden Versuchs- und die beiden Kontrolltierweiden gesetzt. Die Umzäunung jeder Weide bestand aus einer 5-reihigen Elektrodraht-Umzäunung, welche nach außen noch von einem Elektro-Knotengitterzaun umschlossen wurde.

Dieses sollte ein Ausbrechen einzelner Tiere in andere Gruppen verhindern. Die Aufteilung der Gruppen auf die verschiedenen Weiden zeigt Abb. 1.

Abbildung 1: Gruppenverteilung auf den Weiden Kornsah 2 und 3

Vor Beginn des Versuches ließ das Institut für ökologischen Landbau im Jahr 2001 Grasproben der Versuchsflächen auf die pflanzliche Zusammensetzung hin untersuchten. Die Untersuchung wurde von der Landwirtschaftlichen Untersuchungs- und Forschungsanstalt und Institut für Tiergesundheit und Lebensmittelqualität (LUFA-ITL) der Landwirtschaftskammer Schleswig-Holstein durchgeführt. Hierbei wurden folgende Gräser, Kräuter und Leguminosen gefunden: Agropyron repens, Agrostis stolonifera, Alopecurus geniculatus, Alopecurus pratensis, Dactylis glomerata, Festuca rubra agg., Lolium perenne, Phleum pratense pratense, Poa annua, Poa trivialis, Cardamine pratensis pratensis, Cerastuium fontanum holosteoides, Cirsium arvens, Cirsium vulgare, Ranunculus repens, Taraxacum officinale agg., Veronica serpyllifolia und Trifolium repens. Anteilig waren die Gräser

K N

_________________________________________Eigene Untersuchungen: Material57 mit durchschnittlich 93,3 %, die Kräuter mit 3,8 % und die Leguminosen mit 2,8 % beteiligt.

Mitte Juni 2002 war die Länge des Grases auf den Projektflächen für die Tiere zu hoch. Zur Lösung dieses Problems wurde beschlossen, je eine Hälfte aller 4 Weideflächen auf eine Länge von 10 cm zu mähen, das geschnittene Gras zu mulchen und auf den Flächen zu belassen. 14 Tage später wurden dann die anderen Hälften der Flächen ebenso behandelt.

3.1.4. Duddingtonia flagrans

Als Material für die Pilzfütterung wurden Chlamydosporen von Duddingtonia flagrans Troll A Isolat verwendet, welche von der Firma Christian Hanssen Biosystems in Kopenhagen, Dänemark, zur Verfügung gestellt wurden. Gefüttert wurden die Sporen in einer Dosierung von 5x10⁵ Sporen/kg KGW/Tag.

Die Sporen wurden getrocknet, für den Versand luftdicht in metallbeschichtete Beutel verpackt und im Institut für ökologischen Landbau in Trenthorst bei +4 °C gelagert.

Wöchentlich wurden die Rationen für die Tiere berechnet, abgewogen und bis zur Verfütterung bei Raumtemperatur im Stall gelagert.

3.1.5. Material für koproskopische Untersuchungen

3.1.5.1. Mehrwegmaterial für koprokopische Methoden

Reibeschale ∅ 10 cm Haldertwanger, Berlin

Pistill Haldertwanger, Berlin

Plastikmesszylinder, 100 ml Landgraf, Langenhagen

Metallsiebe, neoLab^® Landgraf, Langenhagen

Weithalsstandflaschen 12039 Landgraf, Langenhagen

McMasterkammern MSD-AGVET, München

Baermann-Trichter eigene Herstellung

Einlegesiebe eigene Herstellung

Eigene Untersuchungen: Material_________________________________________ 58

Larvenzählkammer eigene Herstellung

Bechergläser, 40 - 250 ml Schott-Duran, Mainz

Spitztrichter eigene Herstellung

Marmeladengläser, 250 ml mit Plastikdeckel unbekannte Herstellung

Petrischalen, ∅ 10 cm Schott-Duran, Mainz

Reagenzgläser, 10 ml Schott-Duran, Mainz

Kühlbox Camping Gaz, Lyon

Kühlakkus unbekannte Herstellung

Gardinenstoffbeutel, ∅ 1mm eigene Herstellung Plastiksiebe, ∅ 25 µm und 250 µm eigene Herstellung Zentrifugenplastikbecher, 250 ml eigene Herstellung

Kondomhalter, ∅ 5,8 cm eigene Herstellung

Darmklemme mit PVC-Überzug eigene Herstellung Plastikspritzflasche, 500ml und 1000ml Landgraf, Langenhagen

Edelstahlprüfsiebe, LINKER Landgraf, Langenhagen

200mmx25mmx10µm

3.1.5.2. Einwegmaterial für koprokopische Methoden

Einmaluntersuchungshandschuhe, Latex puderfrei Nordtrade, Hannover

Rektalisierungshandschuhe Carl Roth, Karlsruhe

Urinbecher, 125 ml Heiland, Hamburg

Plastikpasteurpipetten, 1 ml Fischer Scientific GmbH, Schwerte

Holzspatel Landgraf, Langenhagen

Kondome Fromms Classic Mapa GmbH, Zeven

Pipettenspitzen, 10-100µl und 100-1000 µl Carl Roth, Karlsruhe

Sterilisierte Sägespäne Altromin GmbH, Lage-Lippe

Plastikbecher für Kotkultur Larsen, Kopenhagen Dänemark

Gaze Larsen, Kopenhagen

Dänemark

Monovetten^®-Serum Sarstedt, Nümbrecht

_________________________________________Eigene Untersuchungen: Material59 3.1.5.3. Lösungen für koproskopische Methoden

Natriumchloridlösung, Dichte 1,18-1,20 100% NaCl in H2O Magnesiumsulfatlösung, Dichte 1,28-1,30 100% MgSO4 in H2O

Methylenblau 1% Methylenblau in H2O

Lugol´sche Lösung 10 g Kaliumjodid und 5 g Jod,

kristallin in destilliertem Wasser 10 %-iges Formalin, Histofix Carl Roth, Karlsruhe

3.1.5.4. Geräte für koproskopische Methoden

Elektronische Tierwaage Tru - Test Limited

Auckland.New Zealand Elektronische Präzisionswaage 1213 MP Sartorius, Göttingen

Zentrifuge Megafuge 1.0 Heraeus Sepatech, Hanau

Zentrifuge Minifuge T Heraeus Sepatech, Hanau

Handmixer comfort Tefal

Wärmeschrank Heraeus, Hanau

Sterilisator 5090 Heraeus, Hanau

Waschmaschinen:

SESA 696 electronic Philips Whirlpool

A 400 Bosch

Mikroskop 47 30 11-99 01 Zeiss, Jena

Stereolupe VMT 1x, 4x VM, Olympus, Japan

3.1.6. Material für molekularbiologische Untersuchungen

3.1.6.1. Mehrwegartikel für molekularbiologische Untersuchungen

Reagenzgläser, 10 ml und 15 ml Schott-Duran, Mainz

Eigene Untersuchungen: Material_________________________________________ 60 3.1.6.2. Einwegartikel für molekularbiologische Untersuchungen

Pipettenspitzen, 0,5-10µl, 10-200 µl, 100-1000µl Carl Roth, Karlsruhe

Reaktionsgefäße 1,5 ml Biozym, Hess. Oldendorf

Reaktionsgefäße 0,5 ml Eppendorf, Hamburg

Reaktionsgefäße 11 ml Sarstedt, Nümbrecht

Reaktionsgefäße 50 ml Sarstedt, Nümbrecht

Scip Tube, 8x 2 ml Stratagene, La Jolla, USA

Optional cap, 8x Stratagene, La Jolla, USA

3.1.6.3. Chemikalien für molekularbiologische Untersuchungen

Natriumhypochlorid (12% Cl^-) Carl Roth, Karlsruhe

Ampuwa^® Fresenius, Bad Homburg

3.1.6.4. Enzyme für molekularbiologische Untersuchungen

Silverstar Polymerase EuroGenTech, Brüssel, Belgien

Surestart™Polymerase Stratagene, La Jolla, USA

Proteinase K Mackarey und Nagel, Düren

3.1.6.5. DNA, Primer, Sonden DNA

Für die quantitative PCR wurde genomische DNA aus jeweils 1000 dritten Larven der Arten Trichostrongylus colubriformis, Teladorsagia circumcincta, Haemonchus contortus und Cooperia oncophora gewonnen. Die Larven stammten aus der Stammhaltung des Institutes für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Weiterhin wurde aus 20 exemplarisch ausgewählten Larvenkulturen, die aus den Untersuchungen im Sommer 2002 hergestellt worden waren, aus je 1000 infektiösen Larven DNA gewonnen.

_________________________________________Eigene Untersuchungen: Material61 Primer

Bei den Primern handelte es sich um gattungsspezifische Primer für Trichostrongylus, Cooperia, Ostertagia und Haemonchus (V.SAMSON-HIMMELSTJERNA et al., 2002):

Alle Primer wurden von der Firma TIB Molbiol Syntheselabor aus Berlin hergestellt.

Cooperia

Vorwärtsprimer 5´- GTG TGG CTA GCG TTT TAA CAC TGT –3´

Rückwärtsprimer 5´- TCT TGA ACT ATA ATG GGA TTT GTC AGA A –3´

Haemonchus

Vorwärtsprimer 5´-GCG AAT ATT GAG ATT GAC TTA GAT AGA GAC–3´

Rückwärtsprimer 5´- GCT CAG GTT GCA TTA TAC AAA TGA TAA A–3´

Ostertagia

Vorwärtsprimer 5´- ATG AAA CTA CTA CAG TGT GGC TAA CAC A–3´

Rückwärtsprimer 5´- TTC TTG AAC ZGA AAT GGG AAT TAT CA–3´

Trichostrongylus

Vorwärtsprimer 5´- CTT ACG TCT GGT TCA GGG TTG TT–3´

Rückwärtsprimer 5´- ACT GAA ATG GGA ATC ATC ACA ATA TTT–3´

Sonden

Die in der quantitativen PCR eingesetzten Sonden waren ebenfalls gattungsspezifisch für die Magen-Darm-Strongyliden Cooperia, Haemonchus, Ostertagia und Trichostrongylus (V. SAMSON-HIMMELSTJERNA et al., 2002).

Alle Sonden wurden von der Firma Applied Biosystems UK, Warrington, England hergestellt.

Cooperia

5´- FAM-CTA ATG GCA TTT GTC TAC ATT- MGB –3´

Haemonchus

5´- FAM-TGG CGA CGA TGT TC- MGB –3´

Eigene Untersuchungen: Material_________________________________________ 62

Trichostrongylus

5´- FAM- ACA GTG TGG CTA ACT C- MGB –3´

Ostertagia

5´- FAM- GTCGAATGGTATTTATCACT- MGB –3´

3.1.6.6. Kits

NucleoSpin^® Tissue Kit Mackarey und Nagel, Düren

Brilliant^® QPCR Core Reagent Kit Stratagene, La Jolla, USA

3.1.6.7. Geräte

Thermobad 1083 Jürgens Gesellschaft für

Labortechnik m.b.H., Hannover

Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg

Thermomixer Micro-4 13170 Hybaid limited, UK

Tischzentrifugen

Omnifuge 2. ORS Heraeus, Sepatech

Centrifuge 5415 C Eppendorf, Hamburg

Eppendorfpipetten research pro Eppendorf, Hamburg 0,5-10µl; 5-100µl; 20-300µl; 50-1000µl

MX 4000 Stratagene, La Jolla, USA

______________________________________Eigene Untersuchungen: Methoden63 3.2. Methoden

3.2.1. Probengewinnung

3.2.1.1. Kotproben

Die Probennahme begann mit dem Tag des Austriebs (07.05.02). Aus Gründen der Praktikabilität wurden die Tiere ab dem 18.06.02 immer am Abend vor der Probennahme nach Gruppen getrennt aufgestallt und nach Beendigung der Probennahme wieder auf die Weide gelassen. Die Tiere wurden einzeln in einen Treibgang getrieben und dort von einem Helfer fixiert. Die Gewinnung der Kotproben erfolgte zumeist rektal. In Einzelfällen wurde auch Kot vom Boden aufgenommen, wenn dieser frisch abgesetzt war, keine groben Verunreinigungen zu erkennen waren und die Probe einem Tier zweifelsfrei zuzuordnen war. Die gewonnenen Proben wurden in Urinbecher verpackt und in einer Kühlbox für den Transport gelagert. Im Institut für Parasitologie wurden die Proben bis zu Aufbereitung bei 4 °C gelagert.

3.2.1.2. FAMACHA^®-Wert

Zur Ermittlung des FAMACHA^©-Wertes wurde die Farbe der Konjunktivalschleimhäute eines Auges individuell mit einer Farbskala verglichen und einem Wert zwischen 1 und 5 zugeordnet. Diese Farbskala beschreibt die Stärke eine Anämie, die anhand der Farbe der Konjunktivalschleimhäute bestimmt wird. Der Wert 1 beschreibt eine rosa-rote Schleimhaut, der Wert 5 eine weiße, porzellanfarbene und somit anämische Schleimhaut. Es wird davon ausgegangen, dass bei einer vorherrschenden Infektion mit Haemonchus contortus die Stärke der Anämie mit der Befallsstärke der Tiere mit diesem Helminthen korreliert. Alle Tiere mit einem Wert 4 oder 5 werden anthelminthisch therapiert. Somit bietet diese Methode eine schnelle und wenig arbeitsintensive Möglichkeit, den Gesundheitszustand einer Herde zu prüfen und stark befallene Tiere zu erkennen und zu therapieren.

Die Bestimmung und Zuordnung des FAMACHA^©-Wertes wurde wechselnd von Tierärzten oder Landwirten durchgeführt.

Eigene Untersuchungen: Methoden _______________________________________64 3.2.1.3. Gewicht

Nach rektaler Entnahme der Kotprobe wurden die Tiere über eine elektronische Waage (SR 2000 von der Firma TRU-TEST) getrieben und das angezeigte Gewicht sowohl handschriftlich notiert als auch in einer Computerdatei gespeichert.

3.2.1.4. Weidegrasproben

Die Gewinnung der Weidegrasproben erfolgte nach der von SIEVERS PREKEHR (1971) beschriebenen Methode. Hierbei wird die Weide in zwei Diagonalen abgegangen und beprobt. Jede Diagonale ergibt eine Probe. Alle 10 Schritte werden an vier Punkten (vor, hinter, links und rechts des Probennehmers) einige (ca. 20-30) Halme dicht über dem Erdboden ausgezupft. Das Gras einer Diagonalen wird zu einer Sammelprobe in einem Gardinenstoffbeutel zusammengefaßt, so dass pro Weide zwei Proben entstehen. Diese Proben wurden für den Transport in einen Einmalrektalisierungshandschuh verpackt und bis zur Aufbereitung bei 4 °C gelagert.

3.2.1.5. Blutproben

An vier Terminen (07.05.02, 02.07.02, 27.08.02 und 22.10.02) wurden den Tieren je eine Serumblutprobe (10 ml) und eine Plasmablutprobe (5 ml, gerinnungsgehemmt mit Li-Heparin) aus der Vena jugularis entnommen. Die Serumprobe diente der Analyse des Pepsinogengehaltes, anhand der Plasmaprobe wurde der Hämatokrit der Tiere bestimmt.

3.2.2. Koproskopische Methoden 3.2.2.1. Eizahl pro g Kot

Die Aufbereitung der Kotproben für die Bestimmung der Eizahlen erfolgte 1-3 Tage nach der Probengewinnung. Die quantitative Analyse der Eiausscheidung erfolgte nach dem von GORDEN und WHITLOCK 1939 beschriebenen McMaster-Verfahren

______________________________________Eigene Untersuchungen: Methoden65 mit den Modifikationen nach WETZEL (1951) und SCHMIDT (1971). Hierbei wurden 4 g Kot mit gesättigter NaCl-Lösung homogen vermengt und durch ein Metallsieb in einem Standzylinder auf 60 ml aufgefüllt. Wenn nicht genügend Kot vorhanden war, wurde die Menge Lsg. entsprechend angeglichen (1 g Kot auf 15 ml NaCl-Lösung). Nach Überführung dieser Suspension in eine Schliffstopfenflasche und guter Durchmischung wurden mit einer Einmalpipette drei McMaster-Zählfelder gefüllt. Die Probe wurde zur Flotation für einige Minuten stehen gelassen und dann erfolgte die Untersuchung der Zählkammern in 65-facher Vergrößerung unter dem Mikroskop. Gezählt wurden alle Parasitenstadien. Die Anzahl der gefundenen Parasitenstadien wurde mit 33,3 multipliziert und ergab so die Eizahl pro g Kot (siehe Formel). Die Sensitivität dieser Methode lag bei 33 Eiern pro g Kot.

Formel zur Berechnung der Eizahl/g Kot:

3.2.2.2. Auswanderverfahren

Dieses von WETZEL (1930) in Anlehnung an die Beschreibung von BAERMANN (1917) entwickelte Verfahren diente der Untersuchung von Kotproben auf das Vorhandensein von Larvenstadien von Lungenwürmern. Einige Gramm Kot wurden in ein Sieb gegeben, welches zu 2/3 in einem mit Wasser gefüllten und mittels einer Schlauchklemme verschlossenen Trichter stand. Die Larven von Lungenwürmern wanderten in 12 Stunden in der Feuchtigkeit aus dem Kot aus und sackten der Schwerkraft folgend in das verschlossene Schlauchende. Durch einfaches Öffnen der Klemme konnten die Larven mit wenigen Tropfen Wasser gewonnen und unter dem Mikroskop untersucht werden.

3.2.2.3. Quantitative Larvenkultur

Um die Larvenzahlen pro g Kot zu bestimmen, wurden die Versuchstiere aus organisatorischen Gründen zu konstanten Gruppen von 3-5 Tieren zusammengefasst und der so gepoolte Kot nach der Methode von HENRIKSEN und KORSHOLM (1983) untersucht. Hierfür wurden 4 g Mischkot mit 3 ml

Eizahl/g Kot

=

Gezählte Parasitenstadien

3 x100

Eigene Untersuchungen: Methoden _______________________________________66 Leitungswasser vermengt und in einen speziell präparierten Plastikbecher mit

Luftlöchern überführt. Dieser wurde mit Gaze überzogen und in einen zweiten Plastikbecher gestellt, in welchem sich zur Aufrechterhaltung der Feuchtigkeit 10 ml Leitungswasser befanden. Diese Kulturen wurden für 8-10 Tage bei 28 °C und 85 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Danach wurde die Kotmenge auf einen Baermann-Trichter übertragen und die Larven nach 24 h durch Öffnen der Schlauchklemme gewonnen.

Unter dem Mikroskop konnten die Larven nach Zugabe einiger Tropfen Lugol´scher Lösung ausgezählt werden. Die gefundene Anzahl durch 4 dividiert entsprach der Larvenanzahl pro g Kot (vgl. Formel).

Formel zur Berechnung der Larvenzahlen/g Kot:

Für die einzelnen Termine wurde die Reduktion der Larvenzahlen in den Versuchsgruppen nach folgender Formel, vergleichbar mit den Untersuchungen von FERNANDEZ et al. (1999) und PEÑA et al. (2002), errechnet.

Larvenzahlreduktion (in %) = 100 -

3.2.2.4. Qualitative Larvenkultur

Da eine Gattungsdifferenzierung der Magen-Darm-Strongyliden anhand der Eier mikroskopisch nicht möglich ist, erfolgte eine Unterscheidung der verschiedenen Gattungen durch Analyse der 3. Larven. Zur Gewinnung der Larven erfolgte die Kultur der Proben nach der Methode von ROBERTS und O´SULLIVAN (1950).

Zu diesem Zweck wurden die Kotproben zu konstanten Gruppen von 3-5 Tieren zusammengefasst und eine ungefähre Menge von 10 g mit etwas Leitungswasser zu einen dicken Brei vermengt. Zu dieser Masse wurden autoklavierte Sägespäne gegeben und mit einem Handrührgerät untergerührt, bis eine feuchte, grob krümelige Masse entstand. Diese Masse wurde auf Marmeladengläser locker verteilt und zugedeckt bei 28 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 85 % für 8-10 Tage inkubiert.

Nach der Inkubation wurden die Gläser bis zum Rand mit Leitungswasser gefüllt und über eine Petrischale gestürzt. Diese wurde ebenfalls zur Hälfte mit Wasser gefüllt.

Larvenzahl/g Kot Kontrolle Larvenzahl/g Kot

=

Gefundene Larven

4

Larvenzahl/g Kot Versuch * 100

______________________________________Eigene Untersuchungen: Methoden67 Nach 24 h waren die dritten Larven in die Petrischale ausgewandert und die Flüssigkeit der Petrischalen konnte über einen Trichter in einen Standzylinder abgegossen werden. Nach weiteren 24 h waren die Larven durch Sedimentation am Boden konzentriert und es konnte der Überstand im Zylinder mit einer Wasserstrahlpumpe abgesogen werden. Ein Anteil dieser Larvensuspension wurde unter Zugabe einiger Tropfen Lugol´scher Lösung unter dem Mikroskop auf ihre Gattungszugehörigkeit nach dem Schlüssel von STOYE und BÜRGER (1968) untersucht. Ausgezählt wurden wenn möglich immer 100 Larven. Die Anzahl Larven einer Gattung ergab somit deren Anteil in Prozent.

3.2.2.5. Gewinnung 3. Larven von Magen-Darm-Strongyliden aus Weidegrasproben

Die Weidegrasproben wurden mit dem Verfahren nach SIEVERS PREKEHR (1971) aufbereitet und untersucht. Hierbei wurden die Proben mit einer speziell präparierten Waschmaschine gewaschen und das ablaufende Spülwasser in einem 25 µm weitmaschigem Sieb aufgefangen. Nach 3 erfolgten Spülgängen wurde der Grasbeutel aus der Maschine genommen und über das Sieb zum Abtropfen gehängt.

Es folgte ein weiterer Spülgang zum Ausspülen der Maschine. Das Sediment aus dem Sieb wurde mit konz. MgSO4-Lösung in ein elastisches Gummisäckchen überführt, welches über einen speziell präparierten Plastikring in einen Zentrifugenbecher eingespannt war. Die Probe wurde bei 250 g 2 min zentrifugiert, danach wurde mittels einer gepolsterten Darmklemme das flotierte Material in dem Gummisäckchen vom Sediment abgeklemmt und in ein Becherglas mit Leitungswasser überführt. Der verbliebene Rest wurde erneut mit MgSO4-Lösung aufgeschwemmt und zentrifugiert. Dieser Schritt wurde 3 mal wiederholt. Das dekantierte Material wurde nach dem Zentrifugieren über ein Sieb (Ø 25 µm) konzentriert und mittels Leitungswasser in ein Reagenzglas überführt. So präpariert, wurden die Proben bis zur mikroskopischen Untersuchung bei 4 °C gelagert. Das gewaschene Gras wurde bei 60 °C über mindestens 72 Stunden getrocknet und das Trockengewicht jeder Probe bestimmt. Unter dem Mikroskop konnten dann die 3.

Larven von Magen-Darm-Strongyliden analysiert und gezählt werden. Als Maß für die Kontaminationsrate einer Weide wurde die Anzahl der Larven pro 100 g

Eigene Untersuchungen: Methoden _______________________________________68 Trockengewicht Gras pro Probe ermittelt und der Mittelwert beider Proben einer

Weide gebildet.

3.2.3. Blutuntersuchungen

3.2.3.1. Serumpepsinogenbestimmung

Nach der Entnahme wurden die Serumblutproben bei 4 °C gekühlt gelagert und 12-24 Stunden nach der Entnahme zur Serumgewinnung verwendet. Hierzu wurden die Proben bei 3000 U/min (2415 g) 10 min zentrifugiert. Im Anschluss daran wurde das überstehende Serum mit einer Pipette aufgenommen und in ein Einmalreaktionsgefäß überführt. Das so gewonnene Serum wurde bei –20 °C bis zur weiteren Untersuchung gelagert.

Die Menge an Pepsinogen im Blut gilt als Maßstab für die Wurmbürde im Labmagen eines Wirtes. Im Labor kann man das Pepsinogen photometrisch bestimmen (BERGHEN et al., 1987). Dazu wurden von einer Probe zweimal 0,5 ml mit dem Substrat BSA (Bovines-Serum-Albumin) versetzt und ein Ansatz bei 37 °C 24 h inkubiert, ein Ansatz ohne Inkubation mit Trichloressigsäure gefällt und abfiltriert. Das Filtrat wurde dann für 24 h bei 4 °C gelagert. Nach der Inkubation des ersten Ansatzes wurden auch in diesem analog zum zweiten die Proteine ausgefällt und die Suspension filtriert. Von jedem Filtrat (inkubiert und nicht inkubiert) wurde 1 ml mit 10 ml einer 0,25 M NaOH-Lösung und 1,5 ml einer Farbstofflösung (Folin-Reagenz)

Die Menge an Pepsinogen im Blut gilt als Maßstab für die Wurmbürde im Labmagen eines Wirtes. Im Labor kann man das Pepsinogen photometrisch bestimmen (BERGHEN et al., 1987). Dazu wurden von einer Probe zweimal 0,5 ml mit dem Substrat BSA (Bovines-Serum-Albumin) versetzt und ein Ansatz bei 37 °C 24 h inkubiert, ein Ansatz ohne Inkubation mit Trichloressigsäure gefällt und abfiltriert. Das Filtrat wurde dann für 24 h bei 4 °C gelagert. Nach der Inkubation des ersten Ansatzes wurden auch in diesem analog zum zweiten die Proteine ausgefällt und die Suspension filtriert. Von jedem Filtrat (inkubiert und nicht inkubiert) wurde 1 ml mit 10 ml einer 0,25 M NaOH-Lösung und 1,5 ml einer Farbstofflösung (Folin-Reagenz)

Im Dokument Untersuchungen zum Einfluss nematophager Pilze auf das Nematoden-Infektionsrisiko bei Schafen und Ziegen (Seite 54-0)