Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zum biologischen Effekt von Rolipram sowie in Lipidnanokapseln eingeschlossenem Rolipram auf
Spiralganglienzellen und dendritische Zellen in vitro und Spiralganglienzellen in vivo
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Hartwig Meyer Rotenburg/Wümme
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Prof. Dr. Timo Stöver
Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde der Johann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt am Main
Prof. Prof. h. c. Dr. Thomas Lenarz Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover
Dr. med. vet. Verena Scheper
Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer Prof. Dr. Timo Stöver
2. Gutachter: Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2011
Gefördert durch die Europäische Union im Rahmen des „3g-Nanotechnology-based targeted drugdelivery using the inner ear as a model target organ“ - Projektes „NanoEar“
(Projektnummer NMP4-CT-2006-026556).
Meinen lieben Eltern in
tiefer Dankbarkeit für ihre bedingungslose Unterstützung gewidmet
Stufen
Wie jede Blüte welkt
und jede Jugend dem Alter weicht, blüht jede Lebensstufe,
blüht jede Weisheit auch und jede Tugend zu ihrer Zeit und darf nicht ewig dauern.
Es muss das Herz bei jedem Lebensrufe bereit zum Abschied sein und Neubeginne, um sich in Tapferkeit und ohne Trauern in and're, neue Bindungen zu geben.
Und jedem Anfang wohnt ein Zauber inne, der uns beschützt und der uns hilft zu leben.
Wir sollen heiter Raum um Raum durchschreiten, an keinem wie an einer Heimat hängen,
der Weltgeist will nicht fesseln uns und engen, er will uns Stuf' um Stufe heben, weiten!
Kaum sind wir heimisch einem Lebenskreise und traulich eingewohnt,
so droht Erschlaffen!
Nur wer bereit zu Aufbruch ist und Reise, mag lähmender Gewöhnung sich entraffen.
Es wird vielleicht auch noch die Todesstunde uns neuen Räumen jung entgegen senden:
des Lebens Ruf an uns wird niemals enden.
Wohlan denn, Herz, nimm Abschied und gesunde!
(Hermann Hesse)
Inhaltsverzeichnis
VERZEICH(IS VO( EIGE(E( VORTRÄGE( U(D POSTER( ... X ABKÜRZU(GSVERZEICH(IS... XII
1 EI(LEITU(G ... 1
2 LITERATURÜBERSICHT... 6
2.1 Das Hörorgan der Säugetiere... 6
2.1.1 Anatomie des Hörorganes... 7
2.1.2 Das Spiralganglion... 10
2.1.3 Physiologisches Prinzip des Hörvorgangs ... 11
2.2 Hörminderung und Ertaubung ... 13
2.2.1 Formen der Hörschädigungen... 13
2.2.2 Sensorineuraler Hörverlust ... 14
2.2.3 Kompensation des sensorischen Hörverlusts durch Cochlea-Implantate ... 17
2.2.4 Ansätze zur Verbesserung der Nerv-Elektroden-Interaktion... 18
2.2.5 Applikationswege zur medikamentösen Therapie des Innenohres ... 22
2.3 Nanotechnologien ... 25
2.3.1 Definition, Eigenschaften von Nanostrukturen und deren Anwendung ... 25
2.3.2 Nanotechnologie in der Medizin... 26
2.3.3 Anwendung von Nanomedizin in der Otologie ... 28
2.3.4 Nanomedizin in der Veterinärmedizin... 29
2.3.5 Lipidnanokapseln ... 30
2.4 Phosphodiesterase-Hemmer ... 34
2.4.1 Wirkungsweise der Phosphodiesterase-Hemmer... 34
2.4.2 Einteilung der Phosphodiesterase-Hemmer ... 35
2.4.3 Rolipram ... 36
3 ZIELSETZU(G ... 40
4 MATERIAL U(D METHODE( ... 42
4.1 Material... 42
4.1.1 Reagenzien, Laborbedarf, Verbrauchsmaterialien, Pharmaka und Geräte ... 42
4.1.2 Herstellung der Lipidnanokapseln ... 42
4.1.3 Tiere und Tierhaltung für die Zellkulturexperimente mit Spiralganglienzellen... 44
4.1.4. Tiere und Tierhaltung für die Zellkulturexperimente mit dendritischen Zellen ... 45
4.1.5 Versuchstiere und Tierhaltung für die In-vivo-Experimente ... 46
4.1.6 Versuchsgruppen... 46
4.2 Methoden ... 48
4.2.1 Methoden für die In-vitro-Versuche mit Spiralganglienzellen ... 48
4.2.1.1 Übersicht der In-vitro-Versuche mit Spiralganglienzellen ... 48
4.2.1.2 Versuch zur Bewertung des Einflusses der Nanopartikel-Komponenten auf das Überleben von vereinzelt angezüchteten Spiralganglienzellen .. 49
4.2.1.3 Beschichtung der 96-Multiwellplatten zur Kultivierung von Spiralganglienzellen ... 50
4.2.1.4 Gewinnung der Spiralganglienzellen ... 51
4.2.1.5 Die Vereinzelung der Spiralganglienzellen ... 53
4.2.1.6 Einsaat der Spiralganglienzellen ... 54
4.2.1.7 Fixation der Spiralganglienzellen ... 55
4.2.1.8 Markierung der vereinzelten Spiralganglienzellen über die immunozytochemische ABC-Methode ... 56
4.2.1.9 Vermessung der Spiralganglienzellen und statistische Auswertung der Spiralganglienzellversuche... 58
4.2.2 Methoden für die In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen ... 59
4.2.2.1 Die Generierung und Kultivierung dendritischer Zellen ... 59
4.2.2.2 Übersicht der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen ... 61
4.2.2.3 Messung der TNF-α-Konzentration ... 63
4.2.2.4 Vitalitätsbestimmung ... 64
4.2.3 Methoden für die In-vivo-Versuche ... 65
4.2.3.1 Übersicht der In-vivo-Versuche ... 65
4.2.3.2 Anästhetische Versorgung; prä- und postoperative Versorgung der Versuchstiere ... 65
4.2.3.3 Akustisch-evozierten Hirnstammpotentiale (aABR) ... 66
4.2.3.4 Systemische Ertaubung von Meerschweinchen ... 68
4.2.3.5 Applikation von Flüssigkeiten ins Innenohr via Cochleostomie ... 69
4.2.3.6 Transkardiale Perfusion ... 72
4.2.3.7 Gewinnung der Cochleae ... 73
4.2.3.8 Entkalkung, Entwässerung und Einbetten der Cochleae... 74
4.2.3.9 Herstellung und Anfärbung der Paraffinschnitte ... 75
4.2.3.10 Auswertung der Paraffinschnitte... 76
4.2.3.11 Statistische Auswertung der In-vivo-Versuche ... 79
5 ERGEB(ISSE ... 81
5.1 Ergebnisse der In-vitro-Versuche mit vereinzelten Spiralganglienzellen ... 81
5.1.1 Einfluss von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BDNF auf die Überlebensrate vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen... 81
5.1.2 Einfluss von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BDNF auf das Neuritenauswachsverhalten vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen ... 83
5.1.3 Einfluss von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BDNF auf den Somadiameter vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen ... 87
5.1.4 Einfluss von LNC FITC, LNC BLANK und BDNF auf die Überlebensrate vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen ... 88
5.1.5 Einfluss von LNC FITC, LNC BLANK sowie BDNF auf das Neuritenauswachsverhalten vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen... 90
5.1.6 Einfluss von LNC, LNC BLANK sowie BDNF auf den Somadiameter vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen... 92
5.2 Ergebnisse der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen ... 92
5.2.1 Einfluss der Testsubstanzen auf die TNF-α-Sekretion ... 93
5.2.2 Einfluss der Testsubstanzen in der Konzentration von 1 µM auf die TNF-α- Sekretion ... 97
5.2.3 Ergebnisse der Vitalitätstestsbestimmung der dendritischen Zellen ... 99
5.3 Ergebnisse der In-vivo-Versuche ... 100
5.3.1 Ergebnisse der aABR-Messungen ... 100
5.3.2 Vergleich der Spiralganglienzelldichten zwischen rechten und linken ertaubten Cochleae der Tiere einer Versuchsgruppe sowie der linken bzw. rechten Cochleae aller Gruppen untereinander ... 102
5.3.3 Vergleich der Spiralganglienzelldichten des unteren, mittleren und oberen Abschnitts der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie) innerhalb einer
Versuchsgruppe sowie zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen ... 104 5.3.4 Vergleich der Spiralganglienzelldichten des unteren, mittleren und oberen
Abschnitts der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie) innerhalb einer
Versuchsgruppe sowie zwischen den Versuchsgruppen ... 107 5.3.5 Vergleich der Somadiameter der Spiralganglienzellen zwischen rechter und
linker ertaubter Cochleae der Tiere einer Versuchsgruppe sowie der linken bzw. rechten Cochleae aller Gruppen untereinander ... 109 5.3.6 Vergleich der ermittelten Somadiameter des unteren, mittleren und oberen
Abschnitts der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie) innerhalb einer
Versuchsgruppe sowie zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen ... 112 5.3.7 Vergleich der ermittelten Somadiameter des unteren, mittleren und oberen
Abschnitts der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie) innerhalb einer
Versuchsgruppe sowie zwischen den Versuchsgruppen ... 114 6 DISKUSSIO( ... 119 6.1 Bewertung der In-vitro-Ergebnisse... 120
6.1.1 Auswirkungen von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und
BDNF auf das Überleben von vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen... 120 6.1.2 Wirkungen von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BDNF
auf die Neuritenlängen der vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen... 124 6.1.3 Effekte von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BDNF auf die
Somadiameter vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen... 126 6.1.4. Bewertung der Auswirkungen der Nanopartikel-Komponenten auf das
Überleben von vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen durch die
vergleichende Behandlung der Spiralganglienzellen mit LNC FITC, LNC BLANK sowie BDNF... 127 6.1.5 Auswirkungen von LNC FITC, LNC BLANK sowie BDNF auf das
Neuritenauswachsverhalten sowie den Somadiameter von kultivierten
Spiralganglienzellen ... 128
6.1.6 Wirkung von ROLIPRAM, LNC FITC ROLIPRAM, LNC BLANK und
LNC FITC auf die LPS-induzierte TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen... 129
6.2 Bewertung der In-vivo-Ergebnisse ... 134
6.2.1 Bewertung der Auswirkungen der unterschiedlichen Testsubstanzen auf das Überleben von Spiralganglienzellen in ertaubten Cochleae ... 134
6.2.2 Bewertung der Auswirkungen der unterschiedlichen Testsubstanzen auf das Überleben von Spiralganglienzellen hinsichtlich der apikalen, mittleren und basalen Abschnitte der ertaubten Cochleae ... 138
6.2.3 Bewertung der Auswirkung der Testsubstanzen auf den ermittelten Somadiameter ... 140
6.3 Zusammenfassende Bewertung der durchgeführten In-vitro- und In-vivo-Versuche 142 7 ZUSAMME(FASSU(G ... 145
8 SUMMARY... 148
9 LITERATURVERZEICH(IS ... 151
10 A(HA(G ... 173
10.1 Herstellung von Lösungen und Medien... 173
10.2 Lösungen und Reagenzien ... 174
10.3 Verwendete Arzneimittel... 177
10.4 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien ... 179
10.5 Operationsbesteck... 182
10.6 Geräte... 183
10.7 Einfluss der Testsubstanzen auf die Vitalität dendritischer Zellen ... 187
ERKLÄRU(G ... 188
DA(KSAGU(G ... 189
Verzeichnis von eigenen Vorträgen, und Postern
Ein Teil der im Rahmen der Dissertation ermittelten Ergebnisse wurden bereits auf folgenden Fachtagungen präsentiert:
• SCHEPER, V., HÜTTEN, M., MEYER, H., FOUCHET, F., BASTIAT, G., SAULNIER, P., LENARZ, T., STÖVER, T.
Nanoparticles as carriers for Rolipram to increase the neuroprotective effect on Spiral Ganglion Cells
In: 33rdMidWinter Meeting of Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, California, USA, 2010 (Poster)
• MEYER, H., STÖVER, T., FOUCHET F., BASTIAT, G., SAULNIER, P., BÄUMER, W., LENARZ, T., SCHEPER, V.
Increase of the Neuroprotective Effect of Rolipram on Spiral Ganglion Cells via Nanoparticle Carriage
In: 47th Inner Ear Biology Workshop, Prague, Czech Republic, 2010 (Poster)
• MEYER, H., STÖVER, T., FOUCHET F., BASTIAT, G., SAULNIER, P., BÄUMER, W., LENARZ, T., SCHEPER, V.
In-vitro- and in-vivo-Effects of Rolipram on Spiral Ganglion Cells and Dendritic Cells via Nanoparticle Carriage
In: 15th Conference on Implantable Auditory Prostheses, Pacific Groove, USA, 2011 (Poster)
• SCHEPER, V., MEYER, H., STÖVER, T., BASTIAT, G., SAULNIER, P., VOIGT, H., LENARZ, T.
Untersuchungen zum neuroprotektiven Effekt von Rolipram und nanopartikel- vermittelter Rolipram Applikation
In: 82. Jahresversammlung 2011 der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen- Ohrenheilkunde, Kopf- und Hals-Chirurgie e.V., Bonn
Für die vorliegende Arbeit wurden die in den Vorträgen und Postern präsentierten Ergebnisse in einen Kontext gesetzt, ausführlicher beschrieben sowie durch weitere Ergebnisse ergänzt.
Abkürzungsverzeichnis
aABR acoustically evoked auditory brainstem response (akustisch evozierte auditorische Hirnstamm-Potenziale)
Abb. Abbildung
ABC Avidin-Biotin-Complex
Ak Antikörper
AP artifizielle Perilymphe
BDNF brain-derived neurotrophic factor bzw. beziehungsweise
ca. zirka
cAMP cyclic adenosin monophosphate (zyklisches Adenosin-Monophosphat) cGMP cyclic gunanosin monophosphate (zyklisches Guanosin-Monophosphat)
d day (Tag)
DAB Diaminobenzidin
dB Dezibel
DC Dendritic cell
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DNase I Deoxyribonuclease I
EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat
ELISA enzyme linked immunoabsorbent assay EPR-Effekt enhanced permeability and retention-Effekt et al. et alii (und andere)
etc. et cetera (und so weiter)
EU Europäische Union
FBS Fetal bovine serum
FITC Fluoreszein-5-isothiocyanat
°C Grad Celsius
g Erdschwerebeschleunigung
g Gramm
GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
GM-CSF granulocyte macrophage-colony stimulating factor
h hora (Stunde)
HBSS Hank’s balanced salt solution
Hz Hertz
IgG Immunglobulin G
IL Interleukin
i.m. intramuskulär
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
kHz Kilohertz
l Liter
LNC Lipidnanokapsel
LPS Lipopolysaccharide
µ mikro (1 x 10-6)
MAP mitogen activated protein
mg Milligramm
ml Milliliter
MW Mittelwert (arithmetischer Mittelwert)
n Stichprobenumfang
NaCl Natriumchlorid
NAD Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid
NADP Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat
NF-κB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells nm Nanometer (1 x 10-9 m)
NO Stickstoffmonoxid
ns nicht signifikant
NS Normalserum
OD Optische Dichte
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PEG Polyethylenglykol
PFA Paraformaldehyd
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoff-Ionenkonzentration PIT-Methode phase inversion temperature-Methode
RhoA ras homolog gene family, member A
RNS reactve nitrogen species (reaktive Stickstoff Spezies) ROS reactive oxygen species (reaktive Sauerstoff Spezies) rpm rotation per minute (Umdrehungen pro Minute)
s Sekunde
s.c. subcutan
SGZ Spiralganglienzelle
SPION superparamagnetic iron oxide nanoparticles SPL sound pressure level (Schalldruckpegel)
Std. Stunden
Tab. Tabelle
TNF Tumornekrosefaktor
Trk Tyrosin Kinase
z. B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem
1 Einleitung
Die Beeinträchtigung des Hörvermögens im Sinne einer Hörminderung oder Ertaubung stellt eine der in Deutschland am häufigsten verbreiteten Erkrankungen dar. Nach einer im Jahr 2000 durchgeführten Studie wurde die Zahl der Betroffenen in Deutschland auf über 10 Millionen geschätzt (SOHN 2001).
Die Ursachen der Hörminderungen sind meist durch einen Verlust der sensorineuralen Strukturen begründet. Neben erblichen Faktoren spielen auch erworbene Ursachen, wie beispielsweise eine erhöhte Lärmexposition (MINAMI et al. 2007) oder die Applikation von ototoxischen Arzneimitteln (YAMANE et al. 1988; SELIMOGLU 2007) eine entscheidende Rolle. Bei dem durch Lärm verursachten Hörverlust (noise induced hearing loss) kommt es zu einer reflektorischen Abnahme der Durchblutung im Innenohr, wodurch eine negative Energiebilanz in den Zellen ausgelöst wird. In der Folge führt die Bildung von freien Radikalen sowie ein vermehrter Kalzium-Einstrom zur Degeneration der Haarzellen (MINAMI et al. 2007). Der arzneimittelinduzierte Haarzellverlust wird ebenfalls über die Bildung von freien Radikalen ausgelöst. Dabei wird die Degeneration der Haarzellen auch hier über die dem Lärm induzierten Hörverlust entsprechenden Mechanismen eingeleitet.
(SELIMOGLU 2007).
Eine Therapie der geschädigten Haarzellen im Sinne einer Protektion vor schädigenden Einflüssen oder gar die Regeneration von bereits degenerierten Sinneszellen des Innenohres ist beim Menschen bisher nicht möglich. Vielmehr wird versucht, das geschädigte Organ durch apparative Therapieformen zu ersetzen, bzw. zu unterstützen. So werden bei gering- bis mittelgradig schwerhörigen Patienten Hörgeräte eingesetzt. Bei hochgradig schwerhörigen sowie ertaubten Patienten ist die Implantation von elektronischen Innenohrprothesen, den Cochlea-Implantaten, die Therapieform der ersten Wahl. So gehört die Behandlung von taubgeborenen Kindern mittels eines Cochlea-Implantats mittlerweile zur Routine. Der über das Cochlea-Implantat vermittelte Höreindruck ermöglicht den Betroffenen das Erlernen von Sprache (LENARZ 1997), was einen entscheidenden Beitrag zur Verbesserung der Integrationsfähigkeit in die Gesellschaft leistet und darüber hinaus eine wesentlich gesteigerte Lebensqualität bietet.
Das Cochlea-Implantat übernimmt bei fehlenden Haarzellen durch die in die Scala tympani eingeführte Mehrkanalelektrode die elektrische Anregung der Spiralganglienzellen. Durch die Bildung und Weiterleitung von Aktionspotentialen durch die Spiralganglienzellen kann somit auch nach einer Haarzelldegeneration ein künstlich erzeugter Höreindruck erzielt werden.
Jedoch kommt es durch den Verlust der Haarzellen zu einer progressiven Abnahme der Spiralganglienzelldichte (SPOENDLIN 1984), was durch das Fehlen von elektrischer und neurotropher Stimulation bedingt ist (INCESULU u. NADOL 1998; ALTSCHULER et al.
1999). Um die Funktion eines Cochlea-Implantats möglichst lange auf hohem Niveau gewährleisten zu können, stellt eine Verzögerung oder gar ein Verhindern der Spiralganglienzelldegeneration einen wesentlichen Aspekt bei der Optimierung von Cochlea- Implantaten dar (INCESULU u. NADOL 1998).
Bis heute wurden eine Vielzahl von unterschiedlichen Substanzen ermittelt, welche sich als neuroprotektiv erwiesen haben. Durch die lokale Applikation dieser neurotrophen Faktoren konnte die fortschreitende Degeneration der Spiralganglienzellen signifikant verlangsamt werden. Wichtige Vertreter dieser Stoffgruppe stellen brain derived neurotrophic factor (BDNF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), Neurotrophin-3 (NT-3) sowie fibroblast growth factor (FGF) dar (STAECKER et. al. 1996; GILLESPIE u. SHEPHERD 2005). MILLER et al. (1997) konnten anhand einer Studie mit ertaubten Meerschweinchen belegen, dass sich eine Behandlung mit BDNF als besonders effektiv auf das Überleben der Spiralganglienzellen erwiesen hat. Des Weiteren zeigte sich, dass eine elektrische Stimulation der Spiralganglienzellen ebenfalls zu einer Verzögerung der Degeneration führt (HARTSHORN et. al. 1991). Letztlich ist hierbei aber in jedem Fall eine dauerhafte, begleitende Therapie nötig, da nach Behandlungsabbruch eine fortschreitende Verminderung der Spiralganglienzelldichte nachgewiesen wurde (GILLESPIE et. al. 2003). Erste Ansätze zu dauerhaften Drug-Delivery-Systemen stellen mit Mikrokathetern versehene osmotische Pumpen dar, die es ermöglichen, über einen längeren Zeitraum Arzneimittel ins Innenohr zu applizieren. Dennoch ist die Dauer der Applikation auf wenige Wochen begrenzt. Eine weitere Option bildet die Gentherapie. Durch das Einschleusen von Gensequenzen neurotropher Faktoren könnten die Zellen nun selbst für eine dauerhafte Produktion dieser neuroprotektiven Substanzen sorgen (YAGI et. al. 2000; REJALI et. al. 2007).
Über virale Vektoren konnte bereits ein Gentransfer im Innenohr realisiert werden. Obwohl eine Expression der eingeschleusten Sequenzen in den Zellen des Innenohres nachgewiesen wurde, zeigten die Ergebnisse jedoch keinen zellspezifischen Gentransfer (HAN et. al. 1999, SUZUKI et. al. 2003). Des Weiteren wird meist nur eine zeitlich begrenzte Expression von etwa 3 Wochen erzielt, was im Hinblick auf eine langfristige Therapie nicht wünschenswert ist (HUSSEMAN u. RAPHAEL 2009). Zusätzlich ergeben sich durch die Verwendung von viralen Vektoren nicht unerhebliche Nachteile, wie beispielsweise die potenzielle Infektiosität und die Möglichkeit entzündliche oder immunologische Prozesse auszulösen (KHO et. al.
2000).
Neben den viralen Vektoren bieten künstlich hergestellte Nanopartikel eine vielversprechende Möglichkeit zum Transport von Arzneimitteln und Gensequenzen. Hierbei handelt es sich um Partikel, deren Größe im nanoskaligen Bereich angesiedelt ist, für die die amerikanische
"ational "anotechnology Initiative Größenordnungen von 1 bis 100 nm angibt. Heute werden eine Vielzahl unterschiedlicher Nanopartikel hergestellt, welche aus organischen sowie anorganischen Grundbausteinen zusammengesetzt sein können. Neben dem Einsatz in der Industrie findet sich ein breites Anwendungsgebiet im Gesundheitswesen und in der Medizin.
So werden Nanopartikel bereits in einigen Sonnenschutzmitteln verwendet, aber auch zur Bekämpfung von Brustkrebs können im Rahmen der Therapie Nanopartikel eingesetzt werden (PAUTLER u. BRENNER 2010). Der Vorteil von Nanopartikeln liegt in der nicht vorhandenen Infektiosität und der Produktion von biodegradablen Grundgerüsten, welche eine geringe Reaktion des Körpers erwarten lassen. Weiterhin lassen sich Nanopartikel kostengünstig herstellen. Durch die Eigenschaft der Herstellung nach biologischen Bauprinzipien sind Nanopartikel prädestiniert für den Transport von medizinischen Wirkstoffen oder Genen.
Neben der Transportfunktion besteht die Möglichkeit, die Oberfläche von Nanopartikeln mit spezifischen Rezeptoren zu funktionalisieren. Über diese Rezeptoren sollen die Nanopartikel nur an ausgesuchte Zellpopulationen binden, in welche sie daraufhin aufgenommen werden und ihr Transportgut freisetzen können. Gerade in der Behandlung von Krebs werden durch traditionelle Verfahren wie der Chemo- oder Strahlentherapie nicht nur die Tumorzellen, sondern auch die gesunden Körperzellen geschädigt. Durch den Einsatz von Nanopartikeln ist eine gezielte Behandlung des veränderten Gewebes denkbar, welche entscheidende Vorteile
gegenüber den herkömmlichen Therapieformen hinsichtlich der Minderung von Nebenwirkungen erreichen kann (PAUTLER u. BRENNER 2010).
Auch im Innenohr kann ein gezielter Wirkstofftransport über Nanopartikel eine erhebliche Dosisminderung und damit ein geringeres Risiko von Nebenwirkungen im Vergleich zu einer systemischen Behandlung erreichen. Zusätzlich wird durch die geringere Dosis auch ein beträchtlicher ökonomischer Nutzen erreicht, da weniger Wirkstoff eingesetzt werden muss.
Neueste Forschungsergebnisse belegen, dass durch die lokale Applikation von fluoreszenzmarkierten Lipidnanokapseln in die Scala tympani eine breite Verteilung der Nanopartikel in den einzelnen Zellpopulationen erreicht werden kann (SCHEPER et al.
2009b). Die Ergebnisse zeigten die Fähigkeit wirkstoffunbeladener Nanopartikel, die Zellen zu infiltrieren ohne dabei toxische Effekte auszulösen.
Neben dem Erhalt der Spiralganglienzellen wird die optimale Funktionsweise der Cochlea- Implantate noch durch einen weiteren wichtigen Faktor beeinflusst. Durch postoperativ einsetzende Fremdkörperreaktionen versucht der Körper durch Bindegewebszubildung das Implantat abzukapseln. Hierdurch kommt es zu einer zunehmend verminderten Nerv- Elektroden-Interaktion, was zu einer verringerten Frequenzselektivität und einer Erhöhung der Impedanzen sowie des Stromeintrags führt (NEWBOLD et al. 2004). PAASCHE et. al.
(2003) konnten nach der Insertion von Cochlea-Implantaten durch die lokale Applikation von Glukokortikoiden eine Verringerung der Impedanzen im Vergleich zu unbehandelten Patienten feststellen.
Die Beurteilung eines biologischen Effekts, welcher durch die Freisetzung eines Transportgutes im Sinne von Arzneimitteln hervorgerufen werden kann, soll in der vorliegenden Arbeit evaluiert werden. In dieser Studie werden wirkstoffbeladene Lipidnanokapseln verwendet. Hierbei ist der Phosphodiesterase-Hemmer Rolipram im Inneren des Nanopartikels eingekapselt, wodurch das Arzneimittel bis zur Freisetzung im Zellinneren geschützt wird. Für dieses Arzneimittel konnten WHITAKER et. al. (2008) im Tierversuch neuroprotektive Eigenschaften nachweisen. In der vorliegenden Arbeit wird zunächst der Effekt des Roliprams und einer Nanopartikel-Rolipram-Kombination auf das Überleben von isoliert angezüchteten Spiralganglienzellen untersucht. Des Weiteren werden Versuche zur Evaluierung des Einflusses von Rolipram und der Nanopartikel-Rolipram- Kombination auf die TNF-α-Sekretion von dendritischen Zellen durchgeführt. Der Vergleich
zwischen dem direkt applizierten Rolipram und der Applikation mittels Nanopartikel lässt eine Aussage über die Effektivität dieses Drug-Delivery-Systems zu. Nachfolgend wird der Effekt des Roliprams auf die Dichte der Spiralganglienzellen von zuvor ertaubten Meerschweinchen in direkter sowie Nanopartikel-vermittelter Applikation untersucht. So werden mit dieser Arbeit die Fragestellungen des biologischen Effekts von Rolipram, sowie die Auswirkungen des mittels eines Drug-Delivery-Systems applizierten Arzneimittels auf die Neurone des Hörsystems in-vitro und im Tiermodell bearbeitet.
2 Literaturübersicht
2.1 Das Hörorgan der Säugetiere
Das Ohr der Säugetiere (Auris, Organum vestibulocochleare) dient neben der Aufnahme und Weiterverarbeitung von akustischen Umweltreizen auch der Wahrnehmung der Lage des Körpers im Raum und stellt somit ein Doppelsinnesorgan dar (NICKEL et. al. 2004).
Morphologisch-anatomisch wird das Ohr in einen äußeren Anteil, das äußere Ohr (Auris externa), einen mittleren Anteil, das Mittelohr (Auris media) und in einen inneren Anteil, das Innenohr (Auris interna) eingeteilt. Das Innenohr verkörpert das eigentliche statoakustische Sinnesorgan. Es besteht aus dem für den Gleichgewichtssinn verantwortlichen Vestibularapparat und aus der Hörschnecke (Cochlea), welche das eigentliche innere Hörorgan darstellt (Abb. 1).
Abb. 1: Aufbau des menschlichen Hör- und Gleichgewichtsorganes (modifiziert nach BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007)
2.1.1 Anatomie des Hörorganes
Das äußere Ohr ist durch die aus Knorpel bestehende Ohrmuschel (Auricula) gekennzeichnet.
Sie dient als Schallauffangtrichter und leitet akustische Reize über den äußeren Gehörgang (Meatus acusticus externus) in Richtung Mittelohr. Der äußere Gehörgang findet sein Ende im Paukenring (Anulus tympanicus), in dem das Trommelfell (Membrana tympanica) eingespannt ist, welches das äußere Ohr zur Paukenhöhle (Cavum tympani) des Mittelohres abgrenzt (NICKEL et al. 2004).
Das im Felsenbein liegende Mittelohr beinhaltet die Paukenhöhle (Cavum tympani) als luftgefüllten Raum, in welcher sich die Gehörknöchelchen (Ossicula auditus) Hammer (Malleus), Amboß (Incus) und Steigbügel (Stapes) befinden. Sie dienen der Weiterleitung und Verstärkung des eintreffenden Schallsignals, in dem die Schwingungen des Trommelfells über die bewegliche Gehörknöchelchenkette zum Innenohr weitergeleitet werden. Hierbei ist der Hammerstiel (Manubrium mallei) im Trommelfell verankert. Die Schwingungen werden über den Amboß, welcher gelenkig mit dem Hammer verbunden ist, auf den Steigbügel übertragen, wobei die Fußplatte des Steigbügels (Basis stapedis) an das ovale Fenster des Innenohres grenzt. Des Weiteren steht die Paukenhöhle über die Ohrtrompete (Tuba auditiva, EUSTACHIsche Röhre) mit dem Nasenrachen in Verbindung, um den Luftdruck zu regulieren und den Abfluss von Sekreten gewährleisten zu können (NICKEL et. al. 2004).
Das Innenohr bildet ein nach außen geschlossenes System. Es vereint die funktionellen Eigenschaften des Gleichgewichtssinnes, über den Anteil des Gleichgewichtsorganes (Vestibularapparat) sowie des Gehörsinnes, durch die nach rostroventral angeordnete Hörschnecke (Cochlea). Während die Cochlea des Menschen im knöchernen Felsenbein angesiedelt ist (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007), ragt die konusförmige Hörschnecke des Meerschweinchens frei ins Mittelohr hervor (COOPER u. SCHILLER 1975). Nach außen wird sie von einer dünnen knöchernen Ummantelung von der Paukenhöhle abgegrenzt. Im Inneren bildet die Schneckenspindel (Modiolus) die Achse um die sich der knöcherne Schneckengang (Canalis spiralis cochleae) beim Menschen in 2,75, beim Meerschweinchen in 3,5 bis 4 Windungen verjüngt (NADOL 1988). Eine von der Schneckenspindel in den Schneckengang ragende, spiralig verlaufende Knochenlamelle, (Lamina spiralis ossea) teilt den Schneckengang mithilfe von zwei an ihm entspringenden Membranen in drei
Flüssigkeitsräume. Die oben gelegene Vorhoftreppe (Scala vestibuli) beginnt am ovalen Fenster (Fenestra vestibuli) und wird zum darunter liegenden Ductus cochlearis (Scala media) durch die REISSNERsche Membran (Membrana vestibularis) abgegrenzt. An der Modiolusspitze kommuniziert die Vorhoftreppe über einen Hohlraum (Helicotrema) mit der Paukentreppe (Scala tympani), welche am runden Fenster (Fenestra cochleae) endet und zur darüberliegenden Scala media durch die Basilarmembran (Lamina basilaris) abgegrenzt ist (NICKEL et. al. 2004). Das Flüssigkeitsvolumen der in der Paukentreppe und der Vorhoftreppe enthaltenen Perilymphe, welche aus dem kaliumarmen Liquor cerebrospinalis entstammt, wird von SHINOMORI et al. (2001) für Meerschweinchen mit 8,87 µl angegeben.
Zwischen der Vorhof- und der Paukentreppe befindet sich der im Querschnitt dreieckige Ductus cochlearis, auch Scala media genannt. Dieser wird dorsal zur Scala vestibuli durch die Membrana vestibularis abgegrenzt. Im ventralen Bereich trennt die Basilarmembran (Lamina basilaris) die Innenräume von Ductus cochlearis und Paukentreppe. An der lateralen Seite begrenzt die Stria vascularis den Innenraum. Hierbei handelt es sich um ein gut vaskularisiertes Epithel, welches für die Produktion von kaliumreicher Endolymphe verantwortlich ist, wobei für den Ductus cochlearis des Meerschweinchens ein Volumen von 1,5 µl beschrieben wird (SHINOMORI et al. 2001).
Als wesentlicher struktureller Bestandteil zur Generierung der Hörwahrnehmung befindet sich das Cortische Organ (Organum spirale) im ventralen Bereich des Ductus cochlearis (Abb 2). Seine Haarsinneszellen und die stabilisierenden Stützzellen sind auf der Basilarmembran (Lamina basilaris) lokalisiert, welche von der modiolusseitigen Lamina ossea spiralis bis zum lateral begrenzenden Ligamentum spirale reicht. Beim Menschen beträgt die durchschnittliche Länge dieser Membran in etwa 35 mm, wobei sie beim Meerschweinchen mit einer Länge von 16,4 ± 1,4 mm (LINSS et al. 2007) angegeben wird.
Eine besondere Art von Stützzellen, die Pfeilerzellen, bilden den Cortischen Tunnel, zu dessen abaxialer Seite 3 bis 5 Reihen von äußeren Haarzellen (insgesamt etwa 12-19000 beim Menschen) und zur axialen Seite eine Reihe von inneren Haarzellen (etwa 3500 beim Menschen) angeordnet sind (LEONHARDT et al. 1990). Der Limbus spiralis ossea begrenzt das Cortische Organ modiolusseitig. Sein Labium limbi vestibulare dient als Ansatzstelle für die Tektorialmembran (Membrana tectoria), welche mit den apikalen Sinneshärchen (Stereovilli) der äußeren Haarzellen in festem Kontakt steht, während die Stereovilli der
inneren Haarzellen keinen festen Kontakt zur Tektorialmembran haben (HOTH u. LENARZ 1997).
Abb. 2: Darstellung der Lage des Cortischen Organs im Querschnitt eines Schneckengangs der Cochlea (modifiziert nach Nickel et al. 2004)
2.1.2 Das Spiralganglion
In der Schneckenspindel der Cochlea verläuft nahe der Basis der Lamina spiralis ossea ein feiner Knochenkanal (Canalis spiralis modioli, ROSENTHALscher Kanal) in welchem sich neben Blutgefäßen das Spiralganglion (Ganglion spirale cochleae) befindet (NICKEL et al.
2004).
Hierbei handelt es sich um größtenteils bipolare Nervenzellen, deren periphere Fortsätze die dendritischen Fasern des Hörnervs bilden. Unter Verlust der Markscheide passieren diese von ventral die Lamina basilaris und treten in Kontakt mit den inneren Haarzellen oder, nachdem sie den Cortischen Tunnel durchzogen haben, in Kontakt mit den äußeren Haarzellen. Die zentralen Axone der Ganglienzellen vereinigen sich schließlich im Inneren der Schneckenspindel zum "ervus cochlearis, dem eigentlichen Gehörnerv.
Die Neurone des Spiralganglions werden auf Grund morphologischer und funktioneller Unterschiede in zwei Typen unterteilt. Zum einen wird durch Typ-I-Ganglienzellen die afferente Versorgung der inneren Haarzellen gewährleistet, während Typ-II-Ganglienzellen die afferente Versorgung der äußeren Haarzellen übernehmen (RUBEL u. FRITZSCH 2002).
Während Typ-I-Ganglienzellen etwa 95 % der Zellpopulation ausmachen, stellen Typ-II- Ganglienzellen nur etwa 5 % der Spiralganglienzellpopulation, wobei Typ-I-Ganglienzellen nur jeweils mit einer inneren Haarzelle in Kontakt treten, Typ-II-Ganglienzellen aber in Verbindung mit bis 30-60 äußeren Haarzellen stehen können (ROMAND u. ROMAND 1987;
RUBEL u. FRITZSCH 2002). Weiterhin zeigen sich histomorphologische Unterschiede zwischen den beiden Ganglienzelltypen. Die Perikarien der bipolaren Typ-I-Ganglienzellen sind von einer Myelinscheide umgeben, während diese bei den pseudounipolaren Typ-II- Ganglienzellen nicht nachzuweisen ist. Zudem weisen die Zellen des Ganglion-II-Typs einen hellen runden Kern mit einem ausgeprägten Nucleolus auf. (LEONHARDT et al. 1990). Des Weiteren zeigen die Durchmesser der Perikarien der Typ-I-Ganglienzellen mit 12-25µm ein im Mittel etwas größeres Ausmaß als Typ-II-Ganglienzellen (BICHLER 1984).
2.1.3 Physiologisches Prinzip des Hörvorgangs
Die Sinnesempfindung des Hörens wird durch die Aufnahme von akustischen Reizen und deren Weiterleitung durch Nervenfasern zum Gehirn charakterisiert, wo diese letztlich im Bereich der Hörrinde als solche gedeutet werden.
Der Entstehung eines akustischen Reizes liegt ein schwingender Körper zugrunde, welcher als Schallquelle durch Druck- und Dichteschwankungen in elastischen Medien wie Gasen, Flüssigkeiten oder Festkörpern, Schallwellen erzeugt. Die Frequenz dieser Schwingungen definiert die Höhe des Tones und wird in Hertz (Hz) angegeben wobei die Amplitude der Auslenkung den Schalldruck, also die Lautstärke, bestimmt. Der Schalldruckpegel (sound pressure level = SPL) wird in Dezibel (dB) gemessen und umfasst für die Leistung des menschlichen Ohres einen so großen Rahmen, dass er in einem logarithmischen Maß angegeben wird (ENGELHARDT u. BREVES 2004). Weiterhin werden akustische Reize in zwei unterschiedliche Qualitäten unterteilt. Töne werden durch eine Sinusschwingung einer einzigen Frequenz charakterisiert, während Geräusche aus vielen, übereinandergelagerten Frequenzen bestehen (ZENNER 1994).
Die Leistungsfähigkeit des Gehörs weist, gerade in der Fähigkeit ein bestimmtes Frequenzspektrum zu verarbeiten, eine hohe artspezifische Variabilität auf. So können Elefanten Infraschall bis zu einer Wellenlänge von 14 Hz wahrnehmen. Die langwelligen Frequenzen werden über viele Kilometer transportiert, was den Tieren eine Kommunikation über große Distanzen ermöglicht. Ein anderes Extrem findet sich bei nachtaktiven Fledermäusen, welche sich mit Hilfe von sehr hochfrequenten Schallimpulsen auch in absoluter Dunkelheit orientieren können. Sie sind in der Lage Frequenzen im Ultraschallbereich bis zu 200 kHz wahrzunehmen. Die Wahrnehmung des menschlichen Gehörs weist ein Frequenzspektrum von 20 Hz bis 20 kHz auf, wohingegen die in dieser Studie als Tiermodell verwendeten Meerschweinchen ein Frequenzspektrum von 50 Hz bis 50 kHz aufweisen (FAY 1988; PENZLIN 1991; SCHMIDT-NIELSEN 1999). Aber nicht nur in der Wahrnehmung der Tonhöhe, auch in der Verarbeitung von akustischen Reizen unterschiedlicher Schallintensitäten sind speziesspezifische Unterschiede evident. Besonders nachtaktive Carnivoren zeigen gegenüber dem Menschen ein leistungsfähigeres Gehör. So liegt die Hörschwelle von Hauskatzen im Bereich von 1 bis 10 kHz etwa 20 dB unter der des
Menschen. Der gesamte Bereich der wahrnehmbaren Schallintensitäten wird als dynamische Breite bezeichnet und liegt beim Menschen in einem Rahmen von 0-120 dB SPL (ENGELHARDT u. BREVES 2004).
Die physiologischen Vorgänge des Hörens lassen sich in drei wesentliche Abschnitte unterteilen. Zunächst wird der Schall über Gase oder Flüssigkeiten transportiert, was als Konduktion bezeichnet wird. Im Anschluss werden die Schallwellen im Ohr über die Sinneszellen in neuronale Aktivitäten umgewandelt. Bei diesem Vorgang spricht man von Transduktion. Die Transmission oder auch Reizfortleitung steht am Ende des Prozesses der Sinneswahrnehmung und evoziert durch die Verarbeitung im Gehirn die Wahrnehmung und die Interpretation der Qualität des akustischen Reizes (WEHNER u. GEHRING 2003).
Am Beginn des eigentlichen Hörvorganges treffen die Schallwellen, welche durch die Ohrmuschel zum Gehörgang geleitet werden, auf das Trommelfell. Dieses wird dadurch in Schwingung versetzt und gibt diese mechanische Bewegung an den mit ihm verbundenen Hammer der Gehörknöchelchen weiter. Amboss und Steigbügel leiten diese Bewegung weiter, wodurch letztlich über die Steigbügelplatte ein Druck auf die Membran des ovalen Fensters ausgelöst wird. Dieser Druckimpuls wird auf die dahinterliegende Perilymphe übertragen. Durch die Inkompressibilität der Perilymphe bildet sich eine Wanderwelle. Diese beginnt am ovalen Fenster und verläuft über die Scala tympani bis zur Schneckenspitze und über das Helicotrema in die Scala vestibuli, worüber sie letztlich zum runden Fenster gelangt.
Hierdurch wird die Basilarmembran in Schwingungen versetzt, wodurch es zu Scherkräften zwischen den Stereovilli der Haarzellen und der darüberliegenden Tektorialmembran kommt (LEONHARDT 1990). Durch die Auslenkung der Stereovilli werden am apikalen Zellende Ionenkanäle geöffnet. So strömen aus der kaliumreichen Endolymphe des Ductus cochlearis Kalium-Ionen in die Zelle, wodurch es zur Depolarisation und zum Einstrom von Kalzium- Ionen kommt. Durch die Depolarisation werden am basalen Zellpol in der Folge exzitatorische Neurotransmitter freigesetzt, wobei es sich hier vermutlich um Glutamat handelt (JANSSEN et al. 1991). Somit werden an den Afferenzen der Spiralganglienzellen Aktionspotentiale ausgelöst, was den Transduktionsprozess, also die Umwandlung eines äußeren Reizes in ein neuronales Körpersignal, abschließt.
Die Wahrnehmung von unterschiedlichen Tonhöhen wird durch das Prinzip der Frequenzdispersion ermöglicht. Hierbei kommt es zu einer ortstonotopen Auslenkung der
Basilarmembran durch die Wanderwelle. Dies bedeutet, dass unterschiedliche Schallfrequenzen zu einer maximalen Amplitude der Wanderwelle an unterschiedlichen Orten der Basilarmembran führen. So zeigt der Durchmesser des Schneckenganges im basalen Bereich eine wesentlich weitere Ausdehnung als apikal. Zudem besitzt die Basilarmembran in Apexnähe eine 1000-fach höhere Steifigkeit als im basalen Bereich. Dadurch kommt es zum Amplitudenmaximum der Wanderwelle hoher Frequenzen im basalen Bereich, während tiefe Frequenzen Wanderwellen mit einem Maximum in Apexnähe bilden (ALLEN 1980;
ZENNER 1994). Zu dieser passiv durch die Wanderwelle ausgelösten Frequenzselektivität wird zusätzlich eine aktive Verstärkung der Wanderwelle durch die äußeren Haarzellen erreicht. Diese besitzen, neben der Fähigkeit zur Umwandlung von Schallenergie in elektrische Energie, motorische Eigenschaften durch ihr Aktinfilamentskelett und antworten auf Beschallung mit einer Kontraktion. Durch diesen aktiven Prozess verstärken sie die Amplitude der Wanderwelle und dämpfen benachbarte Basilarmembranabschnitte. Die Frequenzselektivität beruht damit auf der passiven Wanderwelle sowie auf einer durch die äußeren Haarzellen hervorgerufenen aktiven Verstärkung der Wanderwelle, wobei dieser Anteil den passiven Vorgang wesentlich übersteigt (REISS 2009).
2.2 Hörminderung und Ertaubung
2.2.1 Formen der Hörschädigungen
Ätiologisch können Beeinträchtigungen des Hörempfindens in angeborene und erworbene Schädigungen eingeteilt werden. Während eine Fehlfunktion des Genoms ursächlich für hereditär bedingte Defekte ist, entstehen erworbene Schädigungen des Hörempfindens im Wesentlichen durch exogen zugeführte Noxen. Hierbei sind die Applikation von ototoxisch wirksamen Arzneimitteln (YAMANE et al. 1988; SELIMOGLU 2007) oder eine verstärkte Lärmexposition (MINAMI 2007) als Hauptursachen zu sehen.
Weiterhin werden Hörschädigungen topographisch in schallleitungsbedingte, konduktive Beeinträchtigungen sowie in schallempfindungsbedingte, sensorineurale Beeinträchtigungen unterteilt (HOTH u. LENARZ 1994).
Die konduktiven Fehlfunktionen betreffen das äußere und das Mittelohr. Hierbei kann es durch eine Vielzahl von möglichen Veränderungen zu einer gestörten Weiterleitung der Schallwellen kommen. Dadurch kann das Hörempfinden auch bei einem völlig intakten Innenohr gedämpft erscheinen oder völlig fehlen. Beispiele hierfür können eine vermehrte Ansammlung von Cerumen, Otosklerose, Neoplasien oder auch entzündliche Schwellungen sein.
Ursachen von Schallempfindungsschwerhörigkeiten finden sich zum einen im Innenohr und werden als sensorische Fehlfunktionen (cochleär) bezeichnet. Weiterhin werden Störungen des Hörnervs als neurale und Fehlfunktionen im Bereich der zentralen Hörbahn als zentrale Störungen (retrocochleär) benannt (HOTH u. LENARZ 1994). Erkrankungen und Schädigungen der cochleären, sowie der retrocochleär gelegenen Strukturen werden als sensorineuraler Hörverlust zusammengefasst.
Im Folgenden wird auf den sensorineuralen Hörverlust genauer eingegangen, da sich die vorliegende Studie mit der Verwendung von Nanopartikeln als Medikamentenapplikations- System (Drug-Delivery-System) zur potentiellen intracochleären Therapie bei Patienten mit sensorineuralem Hörverlust befasst.
2.2.2 Sensorineuraler Hörverlust
Der sensorineurale Hörverlust fasst Erkrankungen und Schädigungen der cochleären, sowie der retrocochleär gelegenen Strukturen zusammen.
Der retrocochleäre, bzw. neurale Hörverlust ist ätiologisch durch Veränderungen des Hörnerves oder durch die Beeinträchtigung der weiterführenden Anteile der zentralen Hörbahn charakterisiert. Hierbei handelt es sich häufig um neoplastische Veränderungen, wobei aber auch entzündliche Prozesse oder Traumata nicht selten als Ursache in Frage kommen (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007).
In der Humanmedizin stellt aber der cochleäre oder auch sensorische Hörverlust die weitaus häufigste Form der Schwerhörigkeit dar. Durch eine initiale Schädigung der Haarzellen ist die Transduktion von akustischen Reizen nicht mehr gegeben, wodurch ein Hörempfinden nicht
mehr ermöglicht werden kann. Ursachen für diese Form der Hörschädigung können angeboren sowie erworbenen sein.
Bei den angeborenen Formen unterscheidet man syndromale von nichtsyndromalen Ausprägungen. Beispiele für syndromale Ausprägungen sind mit Nieren- (z.B. Alport- Syndrom) oder Augenerkrankungen (z.B. Cogan-Syndrom, Wardenburg-Syndrom) assoziierte Hörschädigungen. Nichtsyndromale Ausprägungen werden beim Menschen hauptsächlich durch eine Mutation der gap-junction-Proteine Connexin 26 und 31 hervorgerufen (LEFEBVRE u. VAN DE WATER 2000; LIU et al. 2008).
Weiterhin kann der Verlust von Haarzellen aber auch durch Erkrankungen der Mutter während der Schwangerschaft ausgelöst werden, welche metabolische (bspw. Diabetes mellitus) oder infektiöse (bspw. Röteln) Ursachen haben können. Auch bei einem erschwerten Geburtsverlauf kann durch das Auftreten von Hypoxie eine Schädigung des Gehörs eintreten (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007).
In der Veterinärmedizin sind angeborene Hörminderungen in der Regel mit einer Pigmentierungsstörung assoziiert. So ist die Fellfarben-assoziierte sensorineurale Taubheit bei Katzen, Hunden, Pferden und Neuweltkameliden beschrieben (WEBB u. CULLEN 2010).
Als Ursache werden zum einen Defekte in der Differenzierung und Reifung von Melanozyten diskutiert, zum anderen aber auch ein frühzeitiges Absterben sowie eine Fehlfunktion dieser auch in der Stria vascularis angesiedelten Zellen. So kann eine physiologische Funktion dieses in der Cochlea befindlichen Epithels nicht erreicht werden. In der Folge kommt es zum Absterben der Sinneszellen, wodurch das Tier letztlich ertaubt (STEEL u. BARKWAY 1989;
OHLEMILLER 2009). So ist bei Katzen mit weißer Fellfärbung und blaugefärbter Iris eine polygenetische Ursache für den Hörverlust beschrieben (GEIGY et al. 2007). Bei Pferden, insbesondere Paint-Horses, wurde eine Assoziation zu dem endothelian receptor type B (EDNRB)-Gen nachgewiesen, welches auch für die Ausprägung des letalen, weißen, Fohlensyndroms verantwortlich ist (MAGDESIAN et al. 2009). Bei Hunden hingegen erwiesen sich Assoziationen zum Merle-Gen (z.B. Bobtail, Blue-Merle-Collie, harlekinfarbige-Dogge) sowie zum Piebald-Gen (z.B. Dalmatiner, Greyhound) als ursächlich (STRAIN et al. 2004; PLATT et al. 2006).
Ursachen für einen erworbenen Verlust von Haarzellen können ebenfalls sehr vielfältig sein.
So stellt neben altersbedingtem Hörverlust der Einfluss von ototoxischen Substanzen einen
wesentlichen Anteil der erworbenen Hörminderungen dar. Aber auch Schädigungen durch eine erhöhte Lärmexposition führen zu einem Verlust von Haarzellen.
Durch die Applikation von ototoxisch wirksamen Arzneimitteln, wie Aminoglykosid- Antibiotika oder Schleifendiuretika, kommt es nach systemischer Anwendung zu einer Schädigung der Haarzellen. So ist bereits nach wenigen Stunden post applicationem ein von der Basis der Cochlea ausgehender Haarzellverlust zu verzeichnen (WU et al. 2002). Hierbei wird die arzneimittelinduzierte Apoptose der Haarzellen im Wesentlichen durch zwei Mechanismen initiiert. Einerseits kommt es zur vermehrten Bildung von reactive oxygen species (ROS), welche über die Bildung freier Radikale die Apoptose der Zellen hervorrufen.
Andererseits wird über eine Aktivierung der Stickstoffmonoxid-(NO)-Synthase die NO- Konzentration in den Zellen erhöht, was letztlich wieder zur Bildung von freien Radikalen und somit zur Apoptose führt (PRIUSKA u. SCHACHT 1995; TAKUMIDA et al. 1999).
WEST et al. (1973) wiesen in Tierversuchen den Effekt des Haarzellverlustes durch die kombinierte Injektion des Aminoglykosids Kanamycin und des Schleifendiuretikums Ethacrynsäure nach. Aus diesen Ergebnissen etablierte sich ein häufig angewendetes Modell für die Erforschung der Taubheit nach initialem Haarzellverlust, wobei gleiche Erfolge durch die Verwendung des Schleifendiuretikums Furosemid erzielt werden konnten (VERSNEL et al. 2007). Eine weitere anerkannte Methode zur Ertaubung von Versuchstieren stellt ein durch erhöhte Lärmexposition hervorgerufener Hörverlust (noise induced hearing loss, NIHL) dar.
Auch hier werden die apoptotischen Vorgänge über die Bildung von ROS und reactive nitrogen species (RNS) eingeleitet, indem sie zur Bildung von freien Radikalen führen (MINAMI 2007). Die schädigenden Effekte der durch Aminoglykoside sowie durch Lärm erzeugten Ertaubung führen demnach durch denselben Startmechanismus zur Apoptose der Haarzellen (KOPKE et al. 1999).
Durch den primären Verlust von Haarzellen kommt es im weiteren Verlauf zu einer sekundären Degeneration der Spiralganglienzellen (OTTE et al. 1978; WEBSTER u.
WEBSTER 1981; SPOENDLIN 1984), welche die erste Station der Reizweiterleitung in Bezug auf das Hörempfinden bilden. So hat die Anzahl der Spiralganglienzellen einen entscheidenden Einfluss auf die Funktionalität und den damit verbundenen therapeutischen Erfolg von Cochlea-Implantaten (GANTZ et al. 1993). Als Hauptursachen für die Apoptose der Spiralganglienzellen nach initialem Haarzellverlust werden zum einen die fehlende
elektrische Stimulierung durch die von den Haarzellen gebildeten Neurotransmitter beziehungsweise Aktionspotentiale gesehen, zum anderen produzieren die Haarzellen eine Reihe von neurotrophen Faktoren. Von diesen üben unter anderem Neurotrophin-3, brain- derived neurotrophic factor (BDNF) und glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) einen essentiellen Einfluss auf die Vitalität der Spiralganglienzellen aus. Ohne die Anwesenheit der neurotrophen Faktoren ist langfristig das Überleben der Spiralganglienzellen nicht möglich (DODSON 1997; KANZAKI et al. 2002).
2.2.3 Kompensation des sensorischen Hörverlusts durch Cochlea-Implantate
Nach Verlust der Haarzellen ist es heute mittels eines Cochlea- Implantats möglich, ertaubten Patienten die Wiedererlangung eines Höreindrucks zu vermitteln. Hierdurch kann betroffenen Personen ein erneutes Sprachverständnis ermöglicht werden, was in einer erheblichen Steigerung der Lebensqualität resultiert (MATSCHKE u. PLATH 1988). Um jedoch eine Therapie mit Cochlea-Implantaten gewährleisten zu können, muss nach der Schädigung der sensorischen Strukturen die vollständige Funktionalität der den reizweiterleitenden Anteile der Hörbahn gegeben sein (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007).
Cochlea-Implantate bestehen aus mehreren externen sowie internen, implantierten Anteilen.
Zu den äußeren Anteilen zählt der im Außenohrbereich getragene Sprachprozessor, welcher über ein Mikrophon empfangene Schallschwingungen nach Filterung, Entrauschung und Komprimierung in elektrische Signale umwandelt. Das erzeugte Signalmuster wird an die ebenfalls externe, an der Kopfhaut getragene Sendespule weitergeleitet. Durch elektromagnetische Induktion wird die Information transkutan an die im Bereich des Mastoids implantierte Sendespule übermittelt. Letztlich gelangen die Signale über die mit der Sendespule verbundene Elektrode zum Hörnerv (LEHNHARDT et al. 1986). Die über eine Cochleostomie oder über die Rundfenstermembran in die Scala tympani eingeführte und möglichst modiolus- und damit spiralganglienzellnah positionierte Mehrkanalelektrode, ermöglicht durch die bis zu 22 Elektrodenkontakte eine frequenzabhängige elektrische Reizung der Spiralganglienzellen. Diese generieren daraufhin Aktionspotentiale, welche über
die zentrale Hörbahn zum auditorischen Cortex weitergeleitet werden, wo sie einen Höreindruck evozieren (LENARZ 1997).
In den letzten Jahren konnte unter anderem durch die Weiterentwicklungen der Elektroden ein immer besseres Hörempfinden und damit auch ein erheblich gesteigertes Sprachverständnis erzielt werden (HELMS u. MÜLLER 1999; BRADLEY et al. 2010). Dennoch ist der durch das Implantat erreichte Höreindruck nicht mit den physiologischen Leistungen zu vergleichen. Des Weiteren treten zuweilen beträchtliche Unterschiede zwischen behandelten Personen auf, welche in den individuellen Voraussetzungen begründet liegen (GANTZ et al.
1993). Zusätzlich wird die Funktionalität des Cochlea-Implantats durch zwei wesentliche Faktoren beeinträchtigt. Zum einen muss die Anzahl der durch die Hörprothese angeregten Spiralganglienzellen auf einem möglichst hohen Niveau erhalten werden (INCESULU u.
NADOL 1998), zum anderen kommt es durch postoperative Gewebsreaktionen zu Bindegewebsproliferationen und somit zu einer verschlechterten Nerv-Elektroden Interaktion, welche eine suboptimale Signalübertragung zwischen Elektrode und Spiralganglienzellen bedingt (NEWBOLD et al. 2004; PAASCHE et al. 2009).
2.2.4 Ansätze zur Verbesserung der (erv-Elektroden-Interaktion
Durch den Verlust der Haarzellen im Zuge der sensorischen Hörminderung kommt es aufgrund fehlender Haarzell-vermittelter elektrischer Stimulation, sowie der ausbleibenden Produktion von neurotrophen Faktoren zu einer progressiven Degeneration der Spiralganglienzellen (DODSON 1997; KANZAKI et al. 2002). Diesen sekundär eintretenden Zellverlust gilt es aufzuhalten, da eine Therapie mittels Cochlea-Implantat ohne eine ausreichende Dichte dieser Nervenzellen nicht optimal genutzt werden kann.
Durch intensive Forschung konnten eine Vielzahl von neuroprotektiven Substanzen ermittelt werden, welche einen positiven Einfluss auf das Spiralganglienzellüberleben in vitro, sowie auch im Tierversuch nach erfolgter Ertaubung, zeigten (GILLESPIE u. SHEPHERD 2005).
In Zellkulturexperimenten wurde ein protektiver Effekt auf das Spiralganglienzellüberleben unter anderem für brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3) sowie neurotrophin-4/5 (NT-4/5) nachgewiesen. Diese zu den Neurotrophinen gehörenden
Substanzen stellen körpereigene Signalstoffe dar, welche über die Bindung an membranständige Rezeptoren die Interaktionen zwischen Neuronen modulieren und einen Einfluss auf das Überleben (HEMPSTEAD et al. 2006) und die Funktion der Neurone haben (REICHHARDT et al. 2006). Es werden zwei Arten von Rezeptoren unterschieden. Zum einen können Neurotrophine über den p75NT-Rezeptor binden, welcher zu den Rezeptoren der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Familie gehört und alle Neurotrophine binden kann und dadurch einen programmierten Zelltod auslöst. Im Vergleich zu den Rezeptoren der Tyrosinkinase-Rezeptor-Familie (TrkA, TrkB, TrkC) ist seine Affinität zu Neurotrophinen aber vergleichsweise gering. Diese hingegen binden nur spezifische Neurotrophine, wobei nach erfolgreicher Bindung eine Kaskade antiapoptotischer Vorgänge ausgelöst wird. Der für BDNF spezifische Rezeptor wird als TrkB bezeichnet (HUANG u. REICHARDT 2001). So erwiesen sich BDNF und NT-4/5 als sehr potente Substanzen, um das Überleben von kultivierten Spiralganglienzellen neonataler Ratten im Vergleich zu unbehandelten Kontrollgruppen zu sichern, während der Effekt von NT-3 zwar schwächer ist, aber dennoch eine signifikante Protektion zeigte (ZHENG et al. 1995; MALGRANGE et al. 1996;
MARZELLA et al. 1999). Durch BDNF konnte des Weiteren eine Stimulation des Neuritenwachstums bei neonatal gewonnenen Spiralganglienzellen beobachtet werden (HARTNICK et al. 1996; MALGRANGE et al. 1996; GILLESPIE et al. 2001). Aber nicht nur Versuche mit neonatal gewonnenen, auch Studien mit Spiralganglienzellen adulter Ratten zeigten einen positiven Einfluss von BDNF auf die Überlebensrate (LEFEBVRE et al. 1994).
So scheint der trophische Support der Spiralganglienzellen durch neurotrophe Faktoren auch im ausgewachsenen Organismus eine entscheidende Rolle zu spielen (GILLESPIE u.
SHEPHERD 2005), dennoch konnte bei Studien mit Spiralganglienzellen adulter Ratten kein vermehrtes Neuritenauswachsverhalten gezeigt werden (LEFEBVRE et al. 1994).
Auch im Tierversuch konnten die in den Zellkulturexperimenten gewonnen Erkenntnisse reproduziert werden. So wurden in zahlreichen Studien die Effekte unterschiedlicher neurotropher Faktoren an experimentell ertaubten Versuchstieren evaluiert. Besonders BDNF stellte sich in Versuchen mit mittels Kanamycin und Furosemid ertaubten Meerschweinchen als stark protektiv heraus. So wurde die Applikation von 0,25 µl/h BDNF in einer Konzentration von 62,5 µg/ml über einen Zeitraum von 28 Tagen ab dem fünften Tag nach der Ertaubung über eine osmotische Pumpe reguliert und bewirkte eine signifikant erhöhte
Spiralganglienzellüberlebensrate (SHEPHERD et al. 2005). GILLESPIE et al. (2004) konnten des Weiteren auch protektive Effekte für NT-3, NT-4/5 in einer Konzentration von 62,5 µl/ml bei einer Verabreichung von 0,25 µl/h nachweisen. Hierbei wurden die Tiere erst nach 14 Tagen mittels osmotischer Pumpen für 4 Wochen versorgt.
Aber auch ein nicht zu den Neurotrophinen gehörender neurotropher Faktor stellte sich im Tiermodell als vielversprechend heraus. Der zur Transforming Growth Factor-β-(TGF-β)- Superfamilie gehörende glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF) bewirkte bei durch Lärmexposition ertaubten Meerschweinchen ein signifikant gesteigertes Spiralganglienzellüberleben. Die Applikation des GDNF erfolgte dabei über einen Zeitraum von 3 Wochen mittels osmotischer Pumpe. Die Behandlung wurde 4 Tage nach der Ertaubung begonnen wobei zunächst eine Applikation von 72 ng/h GDNF über einen Zeitraum von 7 Tagen erfolgte. Die darauf folgenden 14 Tage wurde die Menge jedoch auf 50 ng/h GDNF reduziert (YLIKOSKI et al. 1998).
Neben der Applikation von neuroprotektiv wirkenden Substanzen wurden auch Studien zur Ermittlung eines spiralganglienzellprotektiven Effekts durch elektrische Stimulierung durchgeführt. Die Ergebnisse der Studien durch HEGARTY et al. (1997) zeigten einen positiven Effekt auf die Vitalität von isoliert angezüchteten Spiralganglienzellen durch Wechselstrom. WEFSTAEDT (2006) konnte dahingegen in einem ähnlichen Versuchsaufbau keine signifikant gesteigerten Überlebensraten im Vergleich zu unstimulierten Zellgruppen feststellen. Die Anwendung von elektrischer Stimulation zeigte im Tiermodell in Kombination mit Neurotrophen Faktoren vielversprechende Ergebnisse (KANZAKI et al.
2002; GILLESPIE u. SHEPHERD 2005; SHEPHERD et al. 2005). Aber auch der alleinige Einfluss der elektrischen Stimulation auf die Spiralganglienzelldichte ertaubter Meerschweinchen wurde von LOUSTEAU (1987) als signifikant erhöht beschrieben.
Weiterhin zeigte SCHEPER (2007) im Versuch mit Kanamycin/Ethacrynsäure ertaubten Meerschweinchen, dass durch die Kombination von GDNF und elektrischer Stimulation eine noch höhere Spiralganglienzelldichte erreicht werden kann als durch die einzeln verabreichten Faktoren. Hierbei wurde mit der Behandlung über die elektrischen Stimuli, sowie auch die Applikation der entsprechenden neurotrophen Faktoren, drei Wochen nach der Ertaubung begonnen.
Neben dem Erhalt der noch verbleibenden Spiralganglienzellen ist für die Therapie mittels eines Cochlea-Implantats eine möglichst optimale Nerv-Elektroden-Interaktion anzustreben.
Daher ist während der Insertion der Elektrode auf eine modiolusnahe Positionierung zu achten (SHEPHERD et al. 1993). So wurden mittlerweile Cochlea-Implantate entwickelt, deren spiralförmig hergestellte Elektrode zunächst über ein Stilett in gerader Position gehalten wird.
Während der Insertion der Elektrode wird das Stilett entfernt und die Elektrode kehrt in ihre Ausgangsformation zurück und kann sich so in Modiolusnähe positionieren (RAU et al.
2010). Durch die spiralganglienzellnähere Position wird so ein wesentlicher Einfluss auf die Hörschwelle genommen (SHEPHERD et al. 1993).
Ein weiterer wichtiger Einflussfaktor bezüglich der Nerv-Elektroden-Interaktion ist die Gewebsmanipulation im Rahmen der Operation. So kommt es durch die Insertion des Implantats zu einer Fremdkörperreaktion, in deren Verlauf der Organismus die Elektrode durch Bildung von Bindegewebe vom Körper abkapselt (TYKOCINSKI et al. 2001;
PAASCHE et al. 2006). Dadurch kommt es zu einer Erhöhung der Impedanzen zwischen Nerv und Elektrode, was zum einen zu einer Erhöhung der Hörschwelle, zum anderen aber auch zu einem erhöhten Energieverbrauch des Implantats führt. So richtet sich ein Schwerpunkt der Forschungen auf eine Verminderung der postoperativen Bindegewebsbildung.
Als möglichen Ansatz für die Hemmung des Bindegewebswachstums eignen sich antiinflammatorisch wirkende Substanzen, wie zum Beispiel Glukokortikoide. Vertreter dieser Arzneimittelgruppe zeichnen sich durch ihre hohe antiinflammatorische und immunsuppressive Wirkung aus. In einer humanen Versuchsreihe konnte durch die einmalige intraoperative Applikation des Glukokortikoids Triamcinolon eine signifikante Verringerung der Impedanz von Patienten mit Cochlea-Implantaten im Vergleich zur Kontrollgruppe erreicht werden. Hierbei wurde das Glukokortikoid in Form einer Kristall-Suspension verabreicht, was die Freisetzung des Arzneimittels über einen verlängerten Zeitraum von mehreren Wochen sicherstellte (PAASCHE et al. 2006). Auch HUANG und Kollegen (2000) konnten zeigen, dass durch Glukokortikoidtherapie posttraumatische Gewebsreaktionen und die darauffolgende Fibrosierung verringert werden kann. Weiterhin konnte WEFSTAEDT (2006) belegen, dass eine Applikation des Glukokortikoids Dexamethason in einer Konzentration von 100 ng/ml keinen Einfluss auf das Überleben von in Zellkultur
angezüchteten Spiralganglienzellen hat. In einer weiteren Studie am Meerschweinchenmodell zeigte sich jedoch durch die Applikation von 0,5 µl Dexamethason in einer Konzentration von 100 ng/ml über einen Zeitraum von 4 Wochen nach Insertion eines Elektrodenträgers, keine signifikante Verringerung des postoperativen Bindegewebswachstums (SCHEPER 2007).
Ein weiterer Ansatz zur verbesserten Nerv-Elektroden-Interaktion besteht in der Modifizierung der Implantatoberflächen. Hierdurch soll die Adhärenz von entstehendem Bindegewebe verhindert werden, was in einer verringerten Impedanz resultieren würde.
In-vitro-Studien zeigten, dass auf mittels Lasertechnik mikrostrukturierten Modelloberflächen aus Silikon bzw. Platin das Fibroblastenwachstum signifikant gehemmt werden kann (REICH et al. 2008). Somit ist anzunehmen, dass durch die speziell strukturierte Elektrodenoberfläche eine weitere Optimierung der Leistung von Cochlea-Implantaten ermöglicht werden könnte.
2.2.5 Applikationswege zur medikamentösen Therapie des Innenohres
Die systemische Behandlung von Erkrankungen des Innenohres wird durch das Vorhandensein der Blut-Cochlea-Schranke erschwert. Nur durch die Applikation von Arzneimitteln in sehr hohen Dosierungen kann ein ausreichender Wirkstoffspiegel im Innenohr erreicht werden, was zu einem hohen Risiko von Nebenwirkungen führt (SWAN et al. 2008). Somit stellen lokale Therapien meist die einzige Möglichkeit dar, eine gezielte Behandlung von Innenohrerkrankungen durchzuführen.
Hierzu eignet sich zunächst die Applikation von Wirkstoffen über die Rundfenstermembran.
Im Gegensatz zur direkten intracochleären Verabreichung von Arzneimitteln wird eine genaue Dosierung durch erhebliche individuelle Unterschiede in der Dicke der Membran und der daraus variablen Diffusionsgeschwindigkeit erschwert (BANERJEE u. PARNES 2004).
Vorteile hinsichtlich der intracochleären Applikation ergeben sich aber durch ein geringeres Infektionsrisiko sowie einem geringeren Operationstrauma. Neben der Applikation von lipophilen Arzneimitteln, wie Glukokortikoiden, zeigten Studien auch den Übertritt von adenoviralen Vektoren durch die Rundfenstermembran in das Innere der Cochlea. So konnte mit Hilfe von Gensequenzen, welche in diesem viralen Drug-Carrier transportiert wurden, die erfolgreiche Transfektion von Zellen der Cochlea nachgewiesen werden, obgleich sie
wesentlich geringer war, als es in Studien mit intracochleärer Applikation gezeigt werden konnte (STÖVER et al. 1999). Aber auch die Applikation von Nanopartikeln, als mögliches Drug-Carrier-System, zeigte gute Penetrationseigenschaften durch die Rundfenstermembran (ZHANG et al. 2011).
Trotz des höheren Infektionsrisikos haben intracochleäre Applikationswege aufgrund der genaueren Dosierungsmöglichkeiten und der besseren intracochleären Verteilung erhebliche Vorteile gegenüber der Behandlung über die Rundfenstermembran. So können Arzneimittel durch die einmalige Applikation per Mikroliterspritze und angeschlossenem Injektionskatheter in die Scala tympani gebracht werden (LEGOUIX u. PIERSON 1977;
PAASCHE et al. 2006; SCHEPER et al. 2009b). Eine weitere Möglichkeit bieten osmotische Pumpen, welche über einen Mikrokatheter die entsprechenden Wirkstoffe kontinuierlich über einen längeren Zeitraum in die Cochlea bringen können, wobei sich aber das Risiko einer Fibrosierung durch den im Innenohr positionierten Katheter ergibt (BROWN et al. 1993).
Das Einschleusen von Gensequenzen stellt eine weitere Möglichkeit dar, erhebliche Erfolge in der Behandlung von Innenohrerkrankungen zu erzielen. Durch die Verwendung von Gensequenzen neurotropher Faktoren könnten die intracochleär transfizierten Zellen die Produktion dieser Substanzen selbst übernehmen (YAGI et. al. 2000; REJALI et. al. 2007).
Aber auch Gensequenzen zur Transdifferenzierung von Stützzellen des Cortischen Organs könnten eine hoffnungsvolle Therapiemöglichkeit ergeben. So konnten Stützzellen durch die Transfektion mit dem Math1 bzw. Atoh1-Gen in funktionelle Haarzellen umgewandelt werden (KAWAMOTO et al. 2003; IZUMIKAWA et al. 2005).
Der Transport dieser Gensequenzen ist über Drug-Delivery-Systeme, wie zum Beispiel virale Vektoren, durchführbar. Trotz vielversprechender Ergebnisse hinsichtlich der Expression und daraus erzielten protektiven Wirkungen auf die Zellen des Innenohres (DUAN et al. 2004;
YAGI et. al. 2000), weisen virale Vektoren erhebliche Nachteile auf. So zeigen sie meist sehr niedrige Transfektionsraten von geringer Dauer und sind gegenüber den unterschiedlichen Zelltypen sehr unspezifisch. Darüber hinaus zeigte sich ein hohes Potential für entzündliche und immunologische Reaktionen. Zudem weisen die Vektoren die Fähigkeit zur Migration in das kontralaterale Innenohr auf (KHO et al. 2000; STÖVER et al. 2000). Letztlich stellt die potentielle Infektiosität ein weiteres Risiko bei der Behandlung von Menschen dar, welches zudem ethische Bedenken begründet.
Eine weitere Behandlungsmöglichkeit besteht darin, über die zellbasierte Therapie neurotrophe Faktoren in der Cochlea freizusetzen. So können genmodifizierte Fibroblasten das Neurotrophin brain derived neurotrophic factor (BDNF) produzieren und über eine modifizierte Elektrode in die Cochlea gebracht werden (REJALI et al. 2007). Jedoch sind noch keine Daten über die Dauer der BDNF-Produktion sowie andere etwaige Einflüsse auf die Cochlea durch Abwanderung und einer dadurch möglichen Fibrosierung durch die eingebrachten Zellen bekannt.
Begründet durch die noch nicht absehbaren Gefahren der zellbasierten Therapie, sowie den Nachteilen der viralen Vektoren, besteht die Notwendigkeit, neue Therapiemöglichkeiten zu entwickeln, wobei ein viel versprechender Ansatz in der Entwicklung nonviraler Vektoren liegt. So bieten synthetisch hergestellte Nanopartikel eine aussichtsreiche Möglichkeit zum Transport von Arzneimitteln oder Gensequenzen und zeigen dabei nicht die erheblichen Nachteile viraler Vektoren auf. Die Vorteile der nanopartikelbasierten Therapie liegen in der nicht vorhandenen Infektiosität sowie in der Produktion von biodegradablen Grundgerüsten, welche eine möglichst geringe Reaktion des Körpers erwarten lassen. Weiterhin ist eine kostengünstige Herstellung realisierbar, wobei durch die Möglichkeit der Oberflächenmodifikation des Partikels mit spezifischen Rezeptoren eine Zellselektivität erreicht werden soll, sodass ganz bestimmte Gewebe oder Zellpopulationen angesteuert werden können. Durch den Einsatz von Nanopartikeln ist demnach eine gezielte Behandlung von verändertem Gewebe denkbar, was entscheidende Vorteile gegenüber den herkömmlichen Therapieformen hinsichtlich der Minderung von Nebenwirkungen bewirken kann (PAUTLER u. BRENNER 2010).
