und dem Hygieneinstitut Abteilung für Immunologie
der Universität Göttingen
Dendritische Zellen in der Immuntherapie gegen Tumoren
Untersuchungen zu der durch dendritische Zellen vermittelten spezifischen Immunantwort beim Mammakarzinom und vom Tumor
ausgehende
immunsupprimierende Einflüsse
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Constanze Matthes
aus Dahme Hannover 2006
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am: 10.07.2007
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. med. Klaus Resch
Referent: Privatdozent Dr. med. Thomas Tschernig Korreferent: Prof. Dr. med. Marta Szamel
Korreferent: Prof. Dr. med. Gerhard Hunsmann Tag der mündlichen Prüfung: 10.07.2007
Meinen Eltern, Swantje
und
Roland
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ______________________________________________________I Abbildungsverzeichnis _________________________________________________ III Tabellenverzeichnis ____________________________________________________ V Abkürzungsverzeichnis ________________________________________________ VI 1 Einleitung ________________________________________________________ 1 1.1 Dendritische Zellen__________________________________________________ 2
1.1.1 In vivo und in vitro_______________________________________________________ 2 1.1.2 Aktivierung von dendritischen Zellen durch Toll-like Rezeptoren (TLR) und
Polarisierung einer TH1/TH2-Immunantwort ___________________________________ 4 1.1.3 Antigenprozessierung und -präsentation_______________________________________ 6 1.1.4 Immunologische Effektorzellen und ihre Helferzellen ____________________________ 7 1.2 Das Mammakarzinom _______________________________________________ 9 1.2.1 Tumorimmunologie und Tumorantigenität____________________________________ 10 1.2.2 Zelluläre Immuntherapien und Vakzinierungsstrategien _________________________ 12 1.2.3 Immun-escape-Mechanismen ______________________________________________ 18 1.3 Themenstellung____________________________________________________ 21 2 Material und Methoden ____________________________________________ 23
2.1 Material __________________________________________________________ 23 2.1.1 Spendermaterial und Patientenmaterial ______________________________________ 23 2.1.2 Chemikalien und Substanzgemische_________________________________________ 24 2.1.3 Zellkulturutensilien und andere Verbrauchsmaterialien __________________________ 28 2.1.4 Geräte und Laborinstallationen_____________________________________________ 29 2.2 Methoden_________________________________________________________ 31 2.2.1 Zellbiologische Arbeitstechniken ___________________________________________ 31 2.2.2 Aufarbeitung von humanem Blut ___________________________________________ 34 2.2.3 Aufarbeitung und Kultivierung von Tumoren _________________________________ 42 2.2.4 Spezifische T-Zellaktivierung mit Tetanustoxoid und Tumorzell-Lysaten sowie
Lymphozytenproliferation nach Mitogenstimulation ____________________________ 47 2.2.5 Durchflusszytometrische Methoden _________________________________________ 52 2.2.6 Proteinbiochemische Methoden ____________________________________________ 60 2.2.7 Phago- und Pinozytose-assay mit unreifen und reifen dendritischen Zellen __________ 64 2.2.8 IL-10-ELISA __________________________________________________________ 66
3 Ergebnisse ______________________________________________________ 69 3.1 Optimierung der Kulturbedingungen zur Generierung monocyte-derived
dendritic cells (MoDC) von Mammakarzinompatientinnen ________________ 69 3.1.1 Morphologie der Monozyten und der dendritischen Zellen von Mamma-
karzinompatientinnen ____________________________________________________ 69 3.1.2 Vergleich der Expression der Oberflächenantigene auf unreifen dendritischen Zellen
bei Mammakarzinompatientinnen mit denen gesunder Spender____________________ 74 3.1.3 Funktionelle Untersuchungen der unreifen dendritischen Zellen und Lymphozyten von Mammakarzinompatientinnen _____________________________________________ 85 3.1.3.1 Vergleich der akzessorischen Aktivität von unreifen dendritischen Zellen von
Mammakarzinompatientinnen und Spendern mittels autologem T-Zellproliferationstest 85 3.1.4 Untersuchungen zu verschiedenen Kulturbedingungen zur Generierung unreifer
dendritischer Zellen von Patientinnen und gesunden Spendern ____________________ 91
3.1.5 Vergleich Phänotyp und Funktionalität der MoDC von Patientinnen unter
Kulturbedingung 1 und 2 ________________________________________________ 100 3.2 Phago- und Pinozytose von unreifen und reifen dendritischen Zellen bei
Patientinnen und Spendern _________________________________________ 105 3.2.1 Phagozytosekapazität von unreifen und reifen MoDC von Patientinnen mit FITC-
markiertem Zymosan-A _________________________________________________ 106 3.2.2 Wie effizient phagozytieren unreife und reife MoDC lipidische Proteine einer
Mammakarzinomzelllinie? _______________________________________________ 111 3.2.3 Pinozytose der Wasser- löslichen Proteine der Tumorzelllinie MCF-7 durch unreife und
reife MoDC___________________________________________________________ 116 3.3 Spezifische T-Zellstimulation und TH1/TH2-Zytokinsekretion durch
Tumorzell-Lysat-gepulste dendritische Zellen__________________________ 121 3.3.1 Titration der Tumorzell-Lysat-Konzentration mit verschiedenen Tumorzelllinien in
einem allogenen in-vitro T-Zell-Stimulations-assay____________________________ 121 3.3.2 Spezifische autologe T-Zellproliferation und TH1/TH2-Zytokinsekretion induziert
durch autologe Tumorzell-Lysat gepulste MoDC von Mammakarzinompatientinnen __ 125 3.3.3 TH1/TH2-Zytokinsekretion nach T-Zellstimulation durch SK-BR3-Lysat gepulste
dendritische Zellen und Toll-like Rezeptor-Liganden___________________________ 129 3.4 Untersuchungen zu Immun-escape-Mechanismen ______________________ 133
3.4.1 Expression von Oberflächenantigenen auf Tumorzellen aus Gewebepräparationen
von Mammakarzinomen _________________________________________________ 134 3.4.2 IL-10-Messungen im Serum von Mammakarzinompatientinnen und gesunden
Spendern _____________________________________________________________ 137
4 Diskussion ______________________________________________________ 139 4.1 Monocyte-derived dendritic cells (MoDC) von Mammakarzinompatientinnen
als Auslöser einer TH1-Immunantwort __________________________________ 140 4.1.1 Morphologie und Phänotyp der MoDC von Mammakarzinompatientinnen __________ 141 4.1.2 Funktionalität der MoDC und Lymphozyten von Mammakarzinompatientinnen ______ 144 4.1.3 Der Einfluss von IFN-γ, Patientenserum und höheren Konzentrationen IL-4/GM-CSF
auf die Differenzierung der MoDC von Patientinnen ___________________________ 147 4.2 Antigenaufnahme der MoDC von Mammakarzinompatientinnen _________ 154 4.3 Antigenpräsentation der MoDC von Mammakarzinompatientinnen und
Induktion einer spezifischen Immunantwort _____________________________ 158 4.4 Immun-escape____________________________________________________ 163
4.4.1 Expression von immunregulatorischen Molekülen auf Tumorzellen von
Mammakarzinomen_____________________________________________________ 164 4.4.2 Prognostische Relevanz von IL-10 im Serum von Mammakarzinompatientinnen in
Verbindung mit dem Therapieerfolg einer Immuntherapie mit dendritischen Zellen ___ 168 4.5 Ausblick _________________________________________________________ 170 5 Zusammenfassung _______________________________________________ 171 6 Literaturverzeichnis ______________________________________________ 173 Danksagungen ______________________________________________________ 198
Abbildungsverzeichnis
ABBILDUNG 1:PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE AUFNAHME VON FRISCH ISOLIERTEN MONOZYTEN.... 70 ABBILDUNG 2:LYMPHOZYTENANTEIL NACH DICHTEGRADIENT UND NACH ELUTRIATION IN
MONOZYTEN-PRÄPARATIONEN. ... 70 ABBILDUNG 3:LYMPHOZYTENANTEIL IN MODC AUS UNTERSCHIEDLICHEN MONOZYTEN-
PRÄPARATIONEN... 71 ABBILDUNG 4:PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE AUFNAHME VON MONOZYTEN, WELCHE MIT
300U/mlIL-4,300 U/mlGM-CSF UND 150 U/mlIFN-γ ZU UNREIFEN MODC
AUSDIFFERENZIERT WURDEN... 71 ABBILDUNG 5:PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE AUFNAHME VON MONOZYTEN, WELCHE MIT
500U/mlIL-4 UND 800 U/mlGM-CSF ZU UNREIFEN MODC AUSDIFFERENZIERT WURDEN... 72 ABBILDUNG 6:PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE AUFNAHME 8TAGE ALTE REIFE MODC MIT 100ng/ml
IL-6,10ng/mlIL-1β,10ng/mlTNF-α UND 1 µg/mlPGE2 AUS MONOZYTEN DIFFERENZIERT... 73 ABBILDUNG 7:PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE AUFNAHME 7TAGE ALTE REIFE MODC MIT
2mg/mlPOLY I:C UND 500U/mlIFN-γ AUS MONOZYTEN DIFFERENZIERT. ... 73 ABBILDUNG 8:VERGLEICH DER OBERFLÄCHENANTIGENE VON MONOZYTEN UND MODC EINER
PATIENTIN IM HISTOGRAMM DARGESTELLT ... 76 ABBILDUNG 9:PHÄNOTYP 7TAGE ALTER MODC VON PATIENTINNEN UND SPENDERN IN ∆% POSITIVE
ZELLEN UND IN RFI DARGESTELLT. ... 78 ABBILDUNG 10:PHÄNOTYP 7TAGE ALTER MODC VON NON-RESPONDER- UND
RESPONDER-PATIENTINNEN... 81 ABBILDUNG 11:AUTOLOGE LYMPHOZYTENPROLIFERATION MIT MODC,LYMPHOZYTEN UND MIT
TETANUSTOXOID ALS ANTIGEN VON PATIENTINNEN UND GESUNDEN SPENDERN ... 86 ABBILDUNG 12:AUTOLOGE LYMPHOZYTENPROLIFERATION MITTELS MITOGENSTIMULATION MIT PHA ... 87 ABBILDUNG 13 TH1/TH2-ZYTOKINFREISETZUNG IM AUTOLOGEN PROLIFERATIONSTEST MIT
TETANUSTOXOID ALS ANTIGEN VON PATIENTINNEN UND GESUNDEN SPENDERINNEN:... 89 ABBILDUNG 14:EINFLUSS VON IFN-γ AUF DIE EXPRESSION VON OBERFLÄCHENANTIGENEN VON
PATIENTINNEN... 93 ABBILDUNG 15:AKZESSORISCHE AKTIVITÄT VON PATIENTEN-MODC, WELCHE MIT UND OHNE IFN-γ
KULTIVIERT WURDEN ... 95 ABBILDUNG 16:VERGLEICH DER EXPRESSION VON OBERFLÄCHENANTIGENEN UNREIFER MODC UNTER
VERSCHIEDENEN KULTURBEDINGUNGEN ∆% POSITIVE ZELLEN DARGESTELLT... 97 ABBILDUNG 17:VERGLEICH DER EXPRESSION VON OBERFLÄCHENANTIGENEN UNREIFER MODC UNTER
VERSCHIEDENEN KULTURBEDINGUNGEN RFI DARGESTELLT... 98 ABBILDUNG 18:PHÄNOTYP 7TAGE ALTER MODC VON N=16MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN UND
VON N=19MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN WELCHE UNTER KULTURBEDINGUNG (1) UND (2) KULTIVIERT WURDEN... 101 ABBILDUNG 19:TH1/TH2ZYTOKINSEKRETION VON MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN UND SPENDERN
NACH SPEZIFISCHER T-ZELLAKTIVIERUNG MIT MODC AUS KULTURMODELL (2) UND
TETANUSTOXOID ALS ANTIGEN... 104 ABBILDUNG 20:FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE-AUFNAHMEN 6TAGE ALTER UNREIFER MODC EINER
PATIENTIN MIT PHAGOZYTIERTEN FITC-ZYMOSAN-A-PARTIKELN... 107 ABBILDUNG 21:FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE-AUFNAHMEN 6TAGE ALTER UNREIFER MODC EINER
PATIENTIN MIT AZID UND FITC-ZYMOSAN-A-PARTIKEL INKUBIERT... 107 ABBILDUNG 22:FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE-AUFNAHMEN 8TAGE ALTER REIFER MODC EINER
PATIENTIN MIT FITC-ZYMOSAN-A-PARTIKELN INKUBIERT. ... 108 ABBILDUNG 23:PHAGOZYTOSEKAPAZITÄT VON UNREIFEN UND REIFEN MODC VON
MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN, WELCHE MIT FITC-MARKIERTEN ZYMOSAN-A-PARTIKELN INKUBIERT WURDEN. ... 109 ABBILDUNG 24:EXPRESSION DER OBERFLÄCHENANTIGENE BEI UNREIFEN UND REIFEN MODC VON
MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN VOR UND NACH DER PHAGOZYTOSE VON FITC-ZYMOSAN-A- PARTIKELN... 110 ABBILDUNG 25:PHAGOZYTOSEKAPAZITÄT VON FITC-MARKIERTEM PROTEIN DER MEMBRANFRAKTION DER
ZELLLINIE MCF-7 DURCH UNREIFE UND REIFE MODC VON SPENDERN ... 112
ABBILDUNG 26:EXPRESSION DER OBERFLÄCHENANTIGENE BEI UNREIFEN UND REIFEN MODC DER SPENDER VOR UND NACH DER PHAGOZYTOSE DES FITC-MARKIERTEM PROTEIN DER
MEMBRANFRAKTION ...113 ABBILDUNG 27:FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE-AUFNAHMEN 6TAGE ALTER UNREIFER MODC MIT
PHAGOZYTIERTEM FITC-MARKIERTEM PROTEINEN DER MEMBRANFRAKTION DER
TUMORZELLLINIE MCF-7 ...114 ABBILDUNG 28:FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE-AUFNAHMEN 6TAGE ALTER UNREIFER MODC MIT
PHAGOZYTIERTEN FITC-MARKIERTEN PROTEINEN DER MEMBRANFRAKTION DER ZELLLINIE MCF-7 UND OBERFLÄCHENANTIGENFÄRBUNG FUNKTIONELL WICHTIGER ANTIGENE AUF
UNREIFEN MODC...115 ABBILDUNG 29:FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE- UND PHASENKONTRAST-AUFNAHMEN 6TAGE ALTER
UNREIFER MODC MIT PINOZYTIERTEM,FITC-MARKIERTEN, LÖSLICHEN PROTEINEN DER
TUMORZELLLINIE MCF-7 ...117 ABBILDUNG 30:FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE AUFNAHME (MIT ZUSÄTZLICHER HELLFELD-
EINBLENDUNG)8TAGE ALTER REIFER MODC MIT PINOZYTIERTEM,FITC–MARKIERTEN,
LÖSLICHEN PROTEINEN DER ZELLLINIE MCF-7...117 ABBILDUNG 31: FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE AUFNAHME 6TAGE ALTER UNREIFER MODC MIT AZID
UND FITC MARKIERTEN LÖSLICHEN PROTEINEN DER ZELLLINIE MCF-7 SOWIE UNREIFER MODC MIT FITC-FARBSTOFF OHNE LÖSLICHES PROTEIN ZUR PHAGOZYTOSE INKUBIERT...118 ABBILDUNG 32:PINOZYTOSEKAPAZITÄT VON UNREIFEN UND REIFEN MODC VON SPENDERN, WELCHE
MIT FITC-MARKIERTEN LÖSLICHEN PROTEINEN DER ZELLLINIE MCF-7 INKUBIERT WURDEN...119 ABBILDUNG 33:EXPRESSION DER OBERFLÄCHENANTIGENE BEI UNREIFEN UND REIFEN MODC VON
SPENDERN VOR UND NACH DER PINOZYTOSE VON FITC-MARKIERTEN, LÖSLICHEN PROTEINEN DER ZELLLINIE MCF-7...120 ABBILDUNG 34:SPEZIFISCHE T-ZELLSTIMULATION MIT DEM LYSAT AUS DEN MAMMA-CA-
TUMORZELLLINIEN SK-BR3 UND MCF-7, DER MELANOMZELLLINIE FM3-13 IM VERGLEICH MIT TETANUSTOXOID...122 ABBILDUNG 35:ZYTOKINFREISETZUNG NACH T-ZELLSTIMULATIONEN MIT LYSATEN DER ZELLLINIEN
SK-BR3,MCF-7 UND FM3-13 IM VERGLEICH MIT TETANUSTOXOID ...123 ABBILDUNG 36:AUTOLOGE T-ZELLSTIMULATION MIT AUTOLOGEM TUMORZELL-LYSAT VON
MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN IM VERGLEICH ZUR STIMULATION MIT TETANUSTOXOID...127 ABBILDUNG 37:T-ZELLSTIMULATION DURCH GEPULSTE MODC, WELCHE MIT TUMORZELL-LYSAT DER
MAMMAKARZINOMZELLLINIE SK-BR3 BELADEN WURDEN, UND DURCH TLR-LIGANDEN
ZUSÄTZLICH AKTIVIERT...130 ABBILDUNG 38:EFFEKT VON VERSCHIEDENEN TLR-LIGANDEN AUF DIE TH1/TH2-ZYTOKINPRODUKTION
VON MODC UND T-ZELLEN MIT UND OHNE TUMORANTIGENSTIMULATION...131 ABBILDUNG 39:DIE EXPRESSION DER OBERFLÄCHENANTIGENE VON N=11TUMORZELLPRÄPARATIONEN
AUS MAMMAKARZINOMEN, IM VERGLEICH ZU DENEN DER MAMMAKARZINOMZELLLINIEN MCF-7 UND SK-BR3 SOWIE DER FIBROBLASTENZELLLINIE Ftde. ...134
Tabellenverzeichnis
TABELLE 1:FLUROCHROM-MARKIERTE MONOKLONALE ANTIKÖRPER (MAUS-α-HUMAN) UND
LEBEND-TOT-FARBSTOFF PROPIDIUM IODIDE. ... 26 TABELLE 2:FLUSSRATEN,ZENTRIFUGATIONSGESCHWINDIGKEITEN UND VOLUMINA DER
FRAKTIONEN 1–5 WÄHREND DER ELUTRIATION... 38 TABELLE 3:VERHÄLTNISSE VON MODC ZU LYSIERTEN TUMORZELLEN IM SPEZIFISCHEN
T-ZELLPROLIFERATIONSTEST. ... 49 TABELLE 4:VERWENDETE FLUOROCHROME UND IHRE ABSORPTIONS- UND EMMISSIONSMAXIMA... 53 TABELLE 5:DIE KLINISCHE AUSWERTUNG DER ANALYSIERTEN responder- UND non-responder-
PATIENTINNEN... 83 TABELLE 6:FREISETZUNG DER TH1/TH2-ZYTOKINE in vitro DURCH IMMUNZELLEN VON PATIENTINNEN... 90 TABELLE 7:FREISETZUNG DER TH1/TH2-ZYTOKINE IN VITRO DURCH IMMUNZELLEN VON GESUNDEN
SPENDERINNEN ... 90 TABELLE 8:ZYTOKINSEKRETION NACH KULTURMODELL (2) VON PATIENTINNEN... 103 TABELLE 9:ZYTOKINSEKRETION NACH KULTURMODELL (2) VON SPENDERN... 103 TABELLE 10:ZYTOKINSEKRETION DER TH1/TH2-ZYTOKINE AUS EINEM AUTOLOGEN
LYMPHOZYTENPROLIFERATIONSTEST MIT AUTOLOGEM TUMORZELL-LYSAT (IN VERSCHIEDENEN KONZENTRATIONEN) ODER MIT TETANUSTOXOID GEPULSTEN MODC VON N=4
MAMMKARZINOMPATIENTINNEN... 128 TABELLE 11:ZYTOKINPRODUKTION IN pg/ml VON MODC UND T-ZELLEN MIT UND OHNE
TUMORANTIGENSTIMULATION UND VERSCHIEDENEN TLR-LIGANDEN... 132 TABELLE 12:PROZENTZAHL POSITIVER ZELLEN DER OBERFLÄCHENANTIGENE VON N=11
TUMORZELLPRÄPARATIONEN AUS MAMMAKARZINOMEN, DER FIBROBLASTENZELLLINIE FTDE, DER MAMMAKARZINOMZELLLINIEN MCF-7 UND SK-BR3 SOWIE DER MITTELWERTE VON N=11
MAMMAKARZINOMEN. ... 135 TABELLE 13:MAMMAKARZINOMPATIENTINNEN MIT ANGABEN ZUM PRIMÄRSTADIUM,
METASTASIERUNG ZUM ZEITPUNKT DER MESSUNG DER IL-10-KONZENTRATION IM SERUM. ... 138
Abkürzungsverzeichnis
Ag Antigen(e)
Ak Antikörper
APC antigenpräsentierende Zellen
APC Allophycocy
ATCC American type culture collection BCG Bacille Calmette-Guerin
BrdU Bromdesoxyuridin
BSA bovine serum albumin
°C Grad Celsius
CBA cytometric bead array CD cluster of differentiation
cm Centimeter
cpm counts per minute
CTL zytotoxische(r) T-Lymphozyt(en)
COX2 Cyclooxygenase2
CR complete remission
DAPI 4-Diamino-2-phenylindol-dihydrochlorid
DC Dendritische Zelle(n)
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure dpm disintegrations per minute DTH delayed-type hypersensitivity EDTA Ethylen-diaminotetraacetat
FACS fluorescence-activated cell sorter (Durchflußzytometer) FcR Fc-Rezeptor von Immunglobulinen
FCS fetales Kälberserum FITC Fluoresceinisothiocyanat
FSC forward scatter
g Gravitation (9,81 m/s2)
GM-CSF granulocyte-monocyte colony stimulating factor
HLA Humanes Leukozytenantigen (Histokompartibilitätsantigen)
HSA human serum albumin
HuS Humanserum
ICAM-1 intracellular adhesion molecule-1
IDC interdigitierende retikuläre dendritische Zelle(n) iDC immature Dendritische Zelle(n)
IFN Interferon (α, β, γ)
Ig Immunglobulin(e)
IL Interleukin(e)
KanS Kaninchenserum
l Liter
LAK-Zelle lymphokinaktivierte Killerzelle(n)
Lf Flockungseinheiten; nach Verabreichung einer Impfdosis 0,4 ml Tetanustoxoid im Meerschweinchen wird ein Tetanus-
Antitoxintiter von 2 IE/ml Serum induziert LFA Leukozytenfunktionsantigen
LPS Lipopolysaccharide
µ- mikro
M Molar
MФ Makrophage(n)
MACS magnetic cell sorting mAk monoklonale(r) Antikörper MAP mitogen-activated protein mDC mature Dendritische Zelle(n) MFI mittlere Fluoreszenzintensität
mg Milligramm
MHC major histocompatibility complex
min Minute (n)
ml Milliliter
MoDC monocyte-derived dendritic cells
MW Molekulargewicht
NK-Zelle natürliche Killerzelle(n)
OD optische Dichte
p piko
PAMP pathogen-associated molecular pattern PBMNL periphere Blut-Mononukleäre-Leucozyten PBS phosphate buffered saline
PD progression disease
PE Phycoerythrin
PE-Cy5 Phycoerythrin und Cyanine 5 PerCP Peridiniumchlorophyll PGE2 Prostaglandin E2
PHA Phytohämagglutinin
PI Propidium Iodide
Poly I:C polyinosin-polycytosin
PR partial remission
PRR pattern-recognition receptors RFI relative Fluoreszenzintensität
rh rekombinant human
rpm rounds per minute
RT Raumtemperatur
SD stable disease
SSC side scatter
TAA tumorassoziierte Antigene
TAP transporters associated with antigen processing
TC tissue culture ok
TCA Trichloressigsäure
TCR T-Zell-Rezeptor
TH1, 2 T-Helfer-Zellen, Subpopulation1 und 2
TIL tumorinfiltrierende Lymphozyten TNF Tumor-Nekrose-Faktor (α, β) Treg-Zelle regulatorische T-Zelle(n)
Triple-Mix 100 U/ml IL-4, 100 U/ml GM-CFS, 50 U/ml INF-γ TRIS Trihydoxymethylaminomethan
TT Tetanustoxoid
U units (Einheiten)
(v/v) Volumenanteil pro Volumen VEGF vascular endothelial growth factor (w/v) Gewichtsanteil pro Volumen
1 Einleitung
Das Immunsystem ist ein hoch differenziertes Organsystem, welches in der Lage ist, den Organismus sowohl spezifisch als auch unspezifisch gegen fremde Antigene zu schützen. Es wird in zwei funktionelle Untereinheiten, das angeborene und das adaptive Immunsystem, unterteilt. Die angeborene Immunität ist ein unspezifischer Schutz gegen Krankheitserreger. Während die angeborene Immunität (z. B. Makrophagen, natürliche Killerzellen, Komplement) beim ersten Kontakt mit einem fremden Antigen (Ag) reagieren können, muss das adaptive Immunsystem (z. B. Lymphozyten) erst aktiviert werden. Eine adaptive Immunantwort beginnt mit der Aufnahme und Prozessierung eines Antigens durch antigenpräsentierende Zellen (APC). Diese präsentieren das Antigen in Form von Peptiden auf dem major histocompatibility complex (MHC-Komplex). Naive T-Zellen binden in den sekundären lymphatischen Organen (z. B. Lymphknoten, Milz) mit ihrem T-Zell-Rezeptor (TCR) an diesen MHC-Antigen- Komplex. Zur vollständigen Aktivierung der T-Zellen ist außerdem eine Interaktion zwischen dem Differenzierungscluster (CD) CD28 auf den T-Zellen und dem CD80 und CD86 auf den professionellen APC erforderlich. Nur bei erfolgter Costimulation kommt es zu einer Proliferation und Differenzierung der T-Zellen zu Effektorzellen (T-Helferzellen oder zytotoxische T-Zellen). Fehlt ein Signal, können die T-Zellen anerg werden. Die Effektorzellen verlassen die lymphatischen Organe und wandern ins Gewebe aus. Zytotoxische T-Zellen (CTL) vernichten infizierte und entartete Zellen mittels Perforin. T-Helferzellen (TH-Zellen) sind an der Proliferation und Differenzierung der CD8+-Zellen zu CTL und der B-Zellen zu antikörpersezernierenden Plasmazellen nach Antigen-Kontakt beteiligt. Die sezernierten Antikörper (Ak) bewirken u. a. eine antigenspezifische Phagozytose von Makrophagen (MΦ) und neutrophilen Granulozyten sowie eine antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) durch natürliche Killerzellen (NK-Zellen). Aktivierte TH-Zellen sezernieren Zytokine, welche wiederum NK-Zellen und Makrophagen aktivieren können. So wird das angeborene Immunsystem durch die Aktivierung des adaptiven Immunsystems ebenfalls stimuliert.
1.1 Dendritische Zellen
1.1.1 In vivo und in vitro
Dendritische Zellen (DC) sind die potentesten antigenpräsentierenden Zellen. Sie wurden von STEINMAN UND COHN erstmals 1973 in murinen Lymphknoten sowie der Milz als lang gestreckte Zellen mit Ausläufern beschrieben. DC sind die Haupt- regulatoren des adaptiven Immunsystems und in der Lage, naive T-Zellen zu stimulieren (BANCHEREAU UND STEINMAN, 1998). Sie stammen von pluripotenten Vorläuferzellen aus dem Knochenmark ab und gelangen über das Blut in fast alle Organe (z. B.
Epidermis der Haut, Lunge, Verdauungstrakt, Leber, Herz), wo sie als unreife DC (immature DC (iDC)) vorkommen. Dort nehmen sie Antigene durch Pinozytose, Phagozytose und Makropinozytose auf (FILGUEIRA ET AL., 1996; RITTIG ET AL., 1998) und prozessieren diese. Sie verfügen aber über nur geringe T-zellstimulierende Fähig- keiten. iDC besitzen eine hohe Endozytosekapazität und exprimieren geringere Mengen MHC- und costimulatorische-Moleküle. Nach einem Antigenkontakt oder der Akti- vierung durch inflammatorische Stimuli wandern die iDC aus dem Gewebe aus und migrieren über die afferenten Lymphbahnen in Form von so genannten Schleierzellen (veiled cells) zu den regionalen Lymphknoten. Dort entwickeln sie sich zu interdigi- tierenden Retikulumzellen (IDC), treten in den T-Zellarealen mit T-Zellen in Kontakt und lösen eine Immunantwort aus (STEINMAN, 1991; CELLA ET AL., 1997). Zu diesem Zweck differenzieren die iDC zu reifen DC (mature DC (mDC)). Hier verlieren sie ihre Fähigkeit, Antigene aufzunehmen, regulieren MHC-Moleküle und costimulatorische Moleküle hoch und erwerben so die Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren. Eine mDC ist in der Lage, mehrere tausend T-Zellen zu stimulieren, wobei sich stabile Cluster zwischen DC und den T-Zellen bilden (BANCHEREAU UND STEINMAN,1998).
In den letzten Jahren wurden viele Methoden entwickelt, um aus CD34+-Vorläuferzellen (aus dem Knochenmark oder aus Nabelschnurblut) beim Menschen dendritische Zellen zu gewinnen (REID ET AL., 1992; CAUX ET AL., 1992). Bei gesunden Menschen sind 0,5-1,5 % der peripheren mononukleären Blutzellen zirkulierende dendritische Zellen (SANTINI UND BELARDELLI, 2003). Die Anzahl der zu isolierenden DC aus dem Blut
wurden in-vitro-Verfahren zur Herstellung von DC aus Monozyten entwickelt. Die Arbeitsgruppe um Prof. Peters beschrieb bereits zu diesem Zeitpunkt, dass durch die Kultivierung von peripheren Blutmonozyten unter serumfreien Bedingungen ohne Zytokine innerhalb von 8 Tagen veiled cells entstehen. Diese Zellen wiesen eine erhöhte stimulatorische Kapazität für T-Zellen sowie eine erhöhte Expression von HLA-DR auf (PETERS ET AL.,1987). IL-4 induzierte eine Suppression von CD14 auf Monozyten und durch GM-CSF konnte die Expression von CD1a auf Monozyten induziert werden (RUPPERT ET AL., 1991; KASINRERK ET AL., 1993). Damit konnte gezeigt werden, dass Monozyten aus dem peripheren Blut unter Einfluss von IL4 und GM-CSF zu iDC differenzieren (PETERS ET AL., 1993, 1996; SALLUSTO UND LANZAVECCHIA, 1994).
Zusatz von IFN-γ konnte eine in-vitro-Differenzierung zu unreifen dendritischen Zellen mit einer erhöhten Expression von HLA-DR und einer höheren akzessorischen Aktivität induzieren (PETERS ET AL.,1993;XU ET AL.,1995).
Unreife MoDC, die zusätzlich mit TNF-α kultiviert wurden, exprimierten CD1a und CD83 höher und entsprachen somit phänotypisch und morphologisch reifen dendritischen Zellen. Diese Zellen zeigten eine reduzierte Makropinozytose bei gleichzeitig erhöhter Expression der costimulatorischen Signale sowie eine stärkere T-zellstimulatorische Kapazität im Vergleich zu iDC (SALLUSTO ET AL., 1995; ZHOU UND TEDDER, 1996). In den folgenden Jahren wurde eine Vielzahl von Faktoren ermittelt, welche eine Reifung bei DC induzieren können. Durch die Aufnahme und Prozessierung bestimmter Antigene (z. B. nekrotische Tumorzellen), durch Bakterien oder Lipopolysaccharide (LPS), durch inflammatorische Zytokine (z. B. IL-1β, TNF-α, IL-6 und PGE2), durch den Liganden bestimmter Oberflächenmarker (z. B.
CD40-Ligand) und durch virale Produkte (z. B. doppelsträngige RNA, Poly I:C) kann eine Reifung und Aktivierung der DC induziert werden (SOMERSAN ET AL., 2001;
VERHASSELT ET AL., 1997; JONULEIT ET AL.,1997;CAUX ET AL.,1994; VERDIJK ET AL., 1999). Die funktionelle und phänotypische Reifung der DC ist dynamisch und bei den verschiedenen Stimuli unterschiedlich. Neben den phänotypischen Veränderungen während der Reifung der DC und der T-zellstimulatorischen Kapazität ist das Zytokin- Mikromilieu, welches von den DC produziert wird, von entscheidender Bedeutung für die Aktivierung von T-Zellen und der daraus resultierenden spezifischen Immunantwort.
1.1.2 Aktivierung von dendritischen Zellen durch Toll-like Rezeptoren (TLR) und Polarisierung einer TH1/TH2-Immunantwort
Zusätzlich zur Antigenerkennung erfolgt die Aktivierung des Immunsystems bzw. der dendritischen Zellen nach MATZINGER (1994)durch Gefahrensignale (danger signals).
Diese Gefahrensignale (z. B. TNF-α, IL-1β oder CD40-Ligand) werden zum einen von Zellen unter Stressbedingungen oder bei Infektionen und Nekrosen freigesetzt. Zum anderen können diese Signale von so genannten pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) oder von viralen Faktoren ausgehen. Diese Signale werden nur von Bakterien oder Viren gebildet und nicht von körpereigenen Zellen. Sie sind somit ein ideales Ziel für die Initiation einer Immunreaktion (MEDZHITOV,2001). PAMPs binden an pattern-recognition receptors (PRRs) (JANEWAY, 1989). Die Toll-like Rezeptoren (TLR) gehören in die Gruppe der PRRs. Zurzeit sind 11 TLR beschrieben. Bisher sind nicht zu allen TLR die Liganden bekannt. Eine Signaltransduktion nach Liganden- bindung findet bei einigen TLR nur dann statt, wenn sie untereinander Heterodimere bilden. Die Liganden für den TLR2 sind z. Β. Peptidoglycan von gram-positiven Bakte- rien und bakterielle Lipoproteine (SCHWANDNER ET AL.,1999;ALIPRANTIS ET AL.,1999).
Der TLR2-Rezeptor bildet entweder mit dem TLR1 oder dem TLR6 ein Heterodimer und erhöht somit seine Spezifität für bestimmte Liganden. Das TLR2/TLR6- Heterodimer bindet das mykoplasmale Lipoprotein MALP-2 (TAKEUCHI ET AL., 2001).
Das komplette Repertoire an TLR-Heterodimeren ist ebenfalls noch nicht bekannt. Der TLR3 bindet doppelsträngige RNA (dsRNA), ein molekulares Muster von Viren. Ein synthetisches Analogon der dsRNA ist polyinosin-polycytosin (Poly I:C) (ALEXOPOULOU ET AL., 2001; CHU ET AL., 1999). Der humane TLR4 war der erste charakterisierte Toll-like Rezeptor. Er befindet sich vorwiegend auf Zellen des Immun- systems einschließlich Makrophagen und DC und hat die Funktion des Signaltrans- duktions-Rezeptors für LPS gram-negativer Bakterien (MEDZHITOV ET AL., 1997;
HOSHINO ET AL.,1999). TLR5 ist in die Erkennung von Flagellin involviert und TLR7 und TLR8 detektieren einzelsträngige RNA (ssRNA) von ssRNA-Viren (HAYASHI ET AL.,2001;HEIL ET AL.,2004). Unmethylierte CpG-Motive von Bakterien-DNA werden
TLR4, dagegen tragen plasmazytoide dendritische Zellen TLR7 und TLR9 (KADOWAKI ET AL.,2001;HORNUNG ET AL.,2002). Myeloide und plasmazytoide DC sind Subpopu- lationen dendritischer Zellen aus dem peripheren Blut. Plasmazytoide DC werden auch als lymphoide DC bezeichnet. Sie produzieren bei viralen Infektionen hohe Mengen an Typ I Interferone (IFN-α/β), hemmen damit die virale Replikation und induzieren eine adaptive Immunantwort (MCKENNA ET AL., 2005). Myeloide DC sind abhängig vom Pathogentyp in der Lage sowohl eine TH1- als auch eine TH2-Immunantwort zu induzieren. Unterschiedliche Aufgaben hinsichtlich der Bekämpfung von Pathogenen myeloider und plasmazytoider dendritischer Zellen induzieren unterschiedliche TLR- Expressionen auf den beiden DC-Subpopulationen.
Durch die Aktivierung der Signaltransduktion über TLR kommt es zu einer Induktion verschiedener Gene, welche die Funktion haben, eine Gefahrenabwehr zu induzieren.
Dies erfolgt durch die Synthese proinflammatorischer Zytokine wie z. B. Interferon-α (IFN-α) oder Interferon-β (IFN-β), Tumornekrosefaktoren (TNF) und Interleukin-1 (IL-1) oder durch die Heraufregulation von MHC- oder costimulatorischen Molekülen.
TLR aktivieren über NF-κB und MAP (mitogen-activated protein) die verschiedenen Gene. Ein TLR-Signal resultiert in der Aktivierung und Reifung der DC sowie in der Polarisierung einer TH1-Immunantwort bei der Übermittlung des Gefahrensignals an naive T-Zellen. TLR verursachen bei DC auch die Expression verschiedener Zytokine, wie z. B. die von IL-12, welches bei der TH-Zelldifferenzierung TH1-Effektorzellen induziert (SCHNARE ET AL., 2001). IL-12 ist ein TH1-polarisierendes Zytokin (TRINCHIERI, 1995). Es wird von DC nach Stimulation mit LPS, Poly I:C oder CD40-Ligand gebildet (MC MENAMIN ET AL.,1995;CELLA ET AL.,1996;CELLA ET AL., 1999). Keine IL-12-Produktion durch DC erfolgt nach Stimulation mit TNF-α, IL-1, Pilz- oder Nematoden-Produkten (D’OSTIANTI ET AL., 2000; WHELAN ET AL., 2000).
Inflammatorische Zytokine induzieren im Unterschied zu den danger-Signalen auch eine Reifung der DC und führen zu einer klonalen Expansion von CD4+-T-Zellen, sie unterstützen aber weder eine TH1-noch eine TH2-Immunantwort (SPÖRRI UND REIS E
SOUSA, 2005). Eine IL-12-Produktion durch DC kann mittels z. B. Prostaglandin E2 inhibiert werden. Dendritische Zellen, welche in Anwesenheit von PGE2 generiert wurden, unterstützen eine TH2-Immunantwort (KALINSKI ET AL., 1997). Nach der
Aktivierung und Reifung von DC mit TLR-Stimuli erfolgt die IL-12-Produktion in einem relativ kurzen Zeitraum von 8–16 Stunden (LANGENKAMP ET AL.,2000). Die im Anschluss folgende Aktivierung von TH1-Zellen resultiert in der Sekretion der TH1-Zytokine IFN-γ, IL-2 und TNF-α durch die aktivierten T-Zellen. Von TH2-Zellen werden die Zytokine IL-4, IL-5, IL-13 und IL-10 gebildet. Das durch TH2-Zellen produzierte IL-10 kann wiederum die IL-12-Produktion durch DC inhibieren und damit eine TH1-Immunantwort inhibieren oder regulieren. Die Polarisierung wird verstärkt durch eine wechselseitige Inhibition von IFN-γ gegenüber TH2-Zytokine sowie IL-4 und IL-10 TH1-Zytokine inhibieren (MOSMANN,1991;FIORENTINO ET AL.,1991).
1.1.3 Antigenprozessierung und -präsentation
Je nach Art des Pathogens werden unterschiedliche Immunantworten initiiert. Viren und im Cytosol lebende Bakterien werden über MHC-Kl I auf APC präsentiert und durch die zelluläre Immunität mittels CTL bzw. TH1-Zellen bekämpft. Dagegen werden extrazelluläre Pathogene durch dendritische Zellen phagozytiert und über MHC-Kl II-Moleküle präsentiert. Diese Pathogene werden durch die humorale Immunität mit Hilfe der TH2-Zellen und die daraus resultierende gesteigerte Antikörperproduktion eliminiert.
Im Cytosol oder im endoplasmatischen Retikulum (ER) der APC werden Proteine von intrazellulären Erregern durch Proteasen in Peptide fragmentiert. Ein ATP-abhängiger Peptidtransporter TAP (transporters associated with antigen processing) transportiert diese Peptide in das Lumen des ER. Dort werden diese an MHC-Kl I-Moleküle gebunden. Das nun vollständig gefaltete MHC-Kl I-Molekül und das Peptid verlassen das ER und werden an die Zelloberfläche der mit Viren oder Bakterien infizierten Zelle transportiert (JANEWAY, TRAVERS, WALPORT UND SHLOMCHIK, 2002). Dort binden CD8+-Zellen mit ihrem TCR an die MHC-Kl I-Peptidkomplexe. Durch das costimula- torische Signal mit der Bindung von CD28 an B7-Moleküle (CD86/80) werden die CD8+-T-Zellen aktiviert. CTL sind in der Lage, Zellen zu töten, welche das fremde Peptid präsentieren.
Dendritische Zellen haben die Fähigkeit, exogene Antigene, welche über eine Rezeptor-
durch Phagozytose aufgenommen wurden, über MHC-Kl I zu präsentieren (cross- presentation) (RODRIGUEZ ET AL.,1999;BONIFAZ ET AL.,2004;STEINMAN ET AL.,1999).
DC können infizierte Zellen oder Tumorzellen aufnehmen und diese als Antigenquelle verwenden (CARBONE UND HEATH,2003;SIGAL ET AL.,1999). Diese exogenen Antigene können über einen TAP-unabhängigen Transportweg im Cytosol über den Endozytose- pathway auf MHC-Kl I-Moleküle geladen werden.Sie könnenaber auch im Cytosol von Proteasomen zerkleinert und über einen TAP-abhängigen Transportweg an MHC-KL I im ER gebunden werden (TROMBETTA UND MELLMAN, 2005). Eine cross-presentation von Antigenen auf MHC-Kl I Molekülen kann ebenfalls durch die Ligand-Rezeptorbin- ung von CD40, durch die Aufnahme von apoptotischen Tumorzellen, durch die Bindung von Immunkomplexen und durch Hitzeschockproteine induziert werden (DELAMARRE ET AL.,2003;SAUTER ET AL.,2000;REGNAULT ET AL.,1999;SRIVASTAVA ET AL.,1998).
Somit kann eine gegen den Tumor gerichtete CTL-Antwort nach der Aufnahme von be- stimmten Tumorzellbestandteilen durch DC über den MHC-Kl I-Weg induziert werden.
Durch Phagozytose werden extrazelluläre Pathogene in Vesikel aufgenommen. In Endosomen werden Antigene durch endosomale Proteasen in einzelne Peptide zerlegt.
MHC-KL II-Moleküle werden durch die invariante Kette (li), welche die Peptid- bindungsstelle blockiert, daran gehindert, bereits im ER Peptide zu binden. In angesäuerten Endosomen wird durch Proteasen (Cathepsin S) die invariante Kette von der Peptidbindungsstelle entfernt; HLA-DM unterstützt die Bindung des Peptids, welches zuvor in Endosomen abgebaut wurde, an das MHC-Kl II-Molekül (JANEWAY, TRAVERS, WALPORT UND SHLOMCHIK,2002). Das MHC-Kl II-Molekül wird danach an die Zelloberfläche transportiert und dort von CD4+-Zellen erkannt. Diese TH1/TH2- Zellen aktivieren andere Effektorzellen des Immunsystems, wie z. B. CTL, Makrophagen und B-Zellen, welche dann unterschiedliche Effektormechanismen zur Bekämpfung des extrazellulären Pathogens induzieren können.
1.1.4 Immunologische Effektorzellen und ihre Helferzellen
Zellen des Immunsystems haben die Fähigkeit, zwischen selbst und fremd zu unterscheiden. Dieses Konzept des Unterscheidens erzeugt ein T-Zellrepertoire gegen fremde Antigene.
T-Helferzellen mit ihrem CD4-Rezeptor spielen eine Rolle bei der B-Zellaktivierung und bei der Aktivierung von CTL und NK-Zellen. TH1-Zellen vermitteln eine zelluläre Immunantwort, indem sie die Proliferation und Differenzierung von CTL durch die Sekretion der inflammatorischen Zytokine INF-γ, IL-2 und TNF-α unterstützen.
Zytotoxische T-Zellen mit ihrem Rezeptor CD8 erkennen Antigene auf den Zielzellen, die über MHC-Kl I exprimiert werden. Sie sind in der Lage, körpereigene Zellen, welche eine Mutation erfahren haben oder durch ein Virus infiziert wurden, mittels Perforin, Granzym oder auch durch die Freisetzung von IFN-γ zu eliminieren. TH2- Zellen induzieren eine humorale Immunantwort, indem sie B-Zellen durch die Zytokine IL-4, IL-6, IL-9 und IL-13 aktivieren und CTL durch das Zytokin IL-10 inhibieren.
B-Zellen produzieren nach Antigen-Kontakt Antikörper und bewirken eine antigen- spezifische und antikörperabhängige ADCC durch NK-Zellen.
Gedächtniszellen haben die Eigenschaft, dass sie sich bei einem wiederholten Antigen- kontakt sehr schnell teilen und somit Erreger in Zellen schneller eliminiert werden können. B-Gedächtniszellen sezernieren in kurzer Zeit verschiedene Isotypen von Anti- körpern. CD4+- und CD8+-Gedächtniszellen werden auch als zentrale und Effektor- Gedächtniszellen bezeichnet. Diese beiden Populationen können wesentlich schneller und leichter aktiviert werden als naive T-Zellen und sind nicht zwingend auf costimulatorische Signale angewiesen (SCHMIDT UND MESCHER, 2002). Tumorzellen, welche keine costimulatorischen Signale, aber tumorspezifische Antigene tragen, können somit Gedächtniszellen aktivieren (BECKHOVE ET AL.,2004).
NK-Zellen besitzen ebenfalls zytotoxische Eigenschaften und sezernieren Zytokine. Sie können virusinfizierte Zellen oder Tumorzellen bei fehlender MHC-Kl I-Expression ohne weitere Aktivierung mittels Granzym und perforinhaltiger Granula lysieren und Apoptose induzieren. Bei einer ADCC eliminieren NK-Zellen die zuvor durch Antikörper opsonierten Zellen.
In der adoptiven Immuntherapie bei Karzinomen kommen Effektorzellen bzw. zyto- toxische Zellen zum Einsatz. Ein Hauptproblem bei der Verwendung von Effektorzellen ist die Bereitstellung ausreichend großer Mengen reaktiver Zellen. Eine dendritische Zelle ist in der Lage, 100–3.000 T-Zellen spezifisch zu aktivieren (BANCHEREAU UND
STEINMAN, 1998). Somit erscheint der Einsatz dendritischer Zellen innerhalb einer adoptiven Immuntherapie bei Karzinompatienten sinnvoll.
1.2 Das Mammakarzinom
Brustkrebs ist weltweit der am häufigsten vorkommende Tumor bei Frauen. Allein in Deutschland erkranken jährlich mehr als 60 000 an Brustkrebs (SCHLESINGER-RAAB ET AL.,2005). Die Inzidenz des Mammakarzinoms steigt seit Ende der siebziger Jahre an, wohingegen die Mortalitätsrate sinkt (BURSTEIN UND WINER, 2003). Dieser Trend spiegelt wider, dass seit mehreren Jahren ein ausgedehntes screening durch Mammo- graphie und ärztliche Untersuchungen stattfindet. Die sinkende Sterberate ist demnach vor allen dadurch zu erklären, dass durch die engmaschigen Kontrollen sehr viel mehr Frühstadien des Mammakarzinoms erkannt werden.
Die häufigsten Risikofaktoren für die Entstehung des Mammakarzinoms sind das Alter, der endogene Hormonstatus bzw. Hormontherapien, benigne Brusterkrankungen, erb- liche Faktoren, wie etwa eine BRCA1- oder BRCA2-Genexpression, sowie bestimmte Ernährungs- und Umweltfaktoren (ARMSTRONG ET AL., 2000). Mammakarzinome wer- den in zwei Hauptgruppen eingeteilt: in-situ-Tumore befinden sich in den Milchgängen oder Drüsen der Brust und haben nicht das umliegende Gewebe infiltriert (SCHNITT ET AL.,1988). Im Gegensatz dazu breiten sich invasive oder infiltrierende Tumore von den Milchgängen (duktal) oder den Drüsen (lobulär) in das umliegende Gewebe aus. Die häufigste Form des Brustkrebses (75 %) ist das invasiv duktale Mammakarzinom, die zweithäufigste das invasiv lobuläre Karzinom (BURSTEIN UND WINER, 2003). Mamma- karzinome werden in verschiedene Stadien eingeteilt (stage I-IV). Diese richten sich nach der Tumorgröße (T), nach dem Ausmaß des Befalls der regionalen Lymphknoten durch den Tumor (N) und nach dem Vorkommen von Metastasen in anderen Organen (M) und werden mit der TNM-Klassifikation angegeben. Neben der Klassifikation und dem Tumorstadium sind eine Reihe von prognostischen und prädiktiven Faktoren für die nachfolgenden Therapien und die Lebenserwartung entscheidend.
Die Expression der Östrogen- und Progesteronrezeptoren auf den Tumorzellen gibt Aufschluss darüber, ob eine Hormontherapie bei dem betreffenden Tumor sinnvoll ist.
Für das Mammakarzinom konnte nachgewiesen werden, dass c-erbB2 (HER2)-positive
Fälle ein besonderes Risikokollektiv darstellen, welches in der Krebsnachsorge besonders überwacht werden muss (MARX ET AL.,1990). Dieser prognostische Marker entscheidet darüber, ob eine monoklonale Antikörpertherapie (Trastuzumab) gegen das HER2-Protein gegeben werden kann.
Zu den Standardtherapien beim Mammakarzinom gehören die chirurgische Tumor- entfernung, Radio-, Hormon-, Chemo- und Immuntherapie. Die Therapie und Lebens- erwartung variiert je nach Stadium der Erkrankung und der biologischen Heterogenität des Tumors. Zwar konnte in den letzten Jahren durch die Mammographie-screenings und durch die adjuvanten Therapien des Mammakarzinoms ein großer Fortschritt erzielt werden, jedoch zeigten die 2005 veröffentlichten Daten des Tumorregisters vom Tumor- zentrum München, dass für das metastasierte Mammakarzinom bezüglich der Lebens- verlängerung in den letzten 20 Jahren keine relevanten Fortschritte erzielt werden konnten (SCHLESINGER-RAAB ET AL.,2005;ENGEL ET AL.,2003; SCHUBERT-FRITSCHLE ET AL.,2004; HÖLZEL ET AL.,2004; ENGEL ET AL.,2003). Angesichts dieser Umstände rückt die Notwendigkeit nach mehr diagnostischen Verfahren und die Entwicklung neuer Therapieformen in den Vordergrund. Nachdem in den letzten Jahren bereits erste immuntherapeutische Ansätze bei der Behandlung von Tumoren durchgeführt wurden und der Schritt zur Standardtherapie für die Antikörpertherapie zum Teil vollzogen ist, sollten diese Therapieformen weiterentwickelt bzw. optimiert werden.
1.2.1 Tumorimmunologie und Tumorantigenität
Bereits 1863 beobachtete Rudolf Virchow Leukozyteninfiltrationen in Tumoren; zum ersten Mal wurde ein Zusammenhang zwischen inflammatorischen Infiltraten und malignem Tumorwachstum festgestellt. Fast einhundert Jahre später postulierten Burnet und Thomas ihre Hypothese über die Existenz der immunologischen Überwachung von Tumoren (THOMAS, 1959; WEINSTOCK, 1984). Diese These kann mit den bis heute erlangten Erfahrungen belegt werden.
Einer der Haupthinweise für das Existieren einer immunologischen Überwachung von Tumoren ist das Auftreten von Spontanremissionen, auch wenn diese nur sehr selten zu beobachten sind. Bis 1999 wurde in der internationalen Literatur bei 32 Mamma-
Ein weiterer Hinweis auf die Beteiligung des Immunsystems besteht darin, dass bei immundefizienten Patienten, wie z. B. Transplantationspatienten, ein häufigeres Vor- kommen an Krebserkrankungen festgestellt werden konnte (PENN, 1996; EUVRARD ET AL.,2003). Im Alter steigt die Inzidenz, ein Karzinom zu entwickeln mit einer sinken- den Funktion des Thymus und einem damit verbundenen reduzierten Vorkommen von naiven T-Zellen (HAKIM ET AL.,2004). Das Vorhandensein von Lymphozyten im Tumor kann ein positiver prognostischer Marker für das Überleben des Patienten sein und weist somit auf eine Beteiligung des Immunsystems hin (CLEMENTE ET AL., 1996). Solche Beobachtungen weisen darauf hin, dass Tumore immunogen wirkende Peptide tragen, gegen die eine tumorspezifische Immunantwort entstehen kann. Insgesamt unterscheidet man sechs verschiedene Gruppen von spezifischen Tumor-assoziierten-Antigenen (TAA), auch Tumorabstoßungsantigene genannt.
Tumore tragen viele Mutationen bzw. Genumlagerungen. Diese Onkogene oder Tumor- suppressorgene zählen zu der ersten Gruppe der TAA. Durch die Mutationen entstehen veränderte Proteine, wie z. B. p53 beim Mammakarzinom, welches dann über MHC- Kl I präsentiert wird und eine Tumor-spezifische T-Zell-Antwort induzieren kann (GNJATIC ET AL.,1998;SVANE ET AL.,2004). Proteine, deren Gene normalerweise nur in männlichen Keimzellen (cancer-testis Antigene) exprimiert werden, gehören zu der zweiten Gruppe. MAGE ist eines dieser Antigene, es wird von Mammakarzinomen exprimiert und MAGE-Proteine können in vivo eine zytotoxische T-Zell-Antwort erzeu- gen (KUFER ET AL.,2002). In der dritten Gruppe von TAA sind Differenzierungsantigene zusammengefasst. Dies sind Antigene, welche erst zu einem späteren Zeitpunkt und in differenzierten normalen Geweben auftreten. NY-BR-1 ist ein Differenzierungsantigen der Mamma. Es ist in normalem Mamma- und Testisgewebe und in über 70 % der Mammakarzinome, nicht aber in anderen Tumoren exprimiert (JAGER ET AL., 2005).
CEA ist ein embryonal-fetales Antigen und erscheint zu einem ontogenetisch falschen Zeitpunkt auf der Zelle (TESSERA ET AL.,1988).Es ist auf 50 %der Mammakarzinome exprimiert und kann eine CTL- und Antikörper-vermittelte Immunantwort induzieren (SCHLOM ET AL.,1996). HER-2/neu (c-Erb-2) ist ein spezifisches Antigen des Mamma- karzinoms, welches im Vergleich zu normalen Zellen in den Tumorzellen stark überexprimiert ist. HER-2/neu-Peptide induzieren häufiger eine Antikörper-vermittelte
Immunität als eine T-Zell-vermittelte Immunität, welche zusätzlich nur kurze Zeit anhält (KNUTSON ET AL.,2002). HER-2/neu-Peptide besitzen eine höhere Affinität zu Klasse- II-Allelen (SALAZAR ET AL., 2003). Ein Vertreter der fünften Gruppe ist das MUC-1, welches ebenfalls auf Mammakarzinomzellen exprimiert ist. MUC-1-Epitope können CTL stimulieren (GOYDOS ET AL., 1996). Sie gehören zu den Antigenen, welche nach der Translation eine anormale Modifikation erfahren haben. Virale Onkogene bilden die letzte Gruppe der TAA und sind Virusproteine, welche eng mit der Onkogenese assoziiert sind. Diese Virusproteine werden vom Immunsystem als fremd erkannt und können eine T-Zell-Antwort induzieren. Für das humane Mammakarzinom wurden bisher keine viralen Onkogene beschrieben.
TAA, welche auf vielen Mammakarzinomen vorhanden und in der Lage sind, die Immuntoleranz zu durchbrechen, sind somit geeignete Antigene für die Herstellung von Tumorvakzinen. Durch diese Antigene können sowohl in vitro als auch in vivo Immun- reaktionen gegen den Tumor ausgelöst werden. Ziel einer Immuntherapie sollte es sein, diese Induktion einer Immunantwort gegen einen Tumor zu nutzen bzw. zu verstärken.
1.2.2 Zelluläre Immuntherapien und Vakzinierungsstrategien
Trotz einer Fülle an Therapien zeigten die konventionellen Behandlungsformen bislang vor allen Dingen beim metastasierten Mammakarzinom keinen wesentlichen Einfluss auf die Lebensverlängerung. Aus diesem Grund und durch die zuvor schon erwähnte Beteiligung des Immunsystems bei der Überwachung von Tumoren zielen neuere Strategien darauf ab, das patienteneigene Immunsystem für therapeutische Zwecke zu aktivieren. In den vergangenen Jahren wurde bereits mit unterschiedlichem Erfolg ver- sucht, diverse immunologische Therapien zu etablieren.
Zu diesen immuntherapeutischen Maßnahmen zählt die aktiv unspezifische Immun- therapie, bei dieser wird das lymphozytäre System direkt zu einer unspezifischen Abwehrreaktion stimuliert. Mammakarzinompatientinnen mit einer fortgeschrittenen Erkrankung wurden dazu mit Mikroorganismen wie Bacille Calmette-Guerin (BCG) im Vergleich zur Chemotherapie behandelt. Es ergab sich kein signifikanter Unterschied im progressionsfreien Intervall, aber im Vergleich waren 21,8 % der Patientinnen unter
