Dendritische Zellen in der Tracheobronchialschleimhaut: tierexperimentelle Untersuchungen an der Ratte und Ergebnisse von menschlichen Proben

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der Medizinischen Hochschule Hannover

Dendritische Zellen in der Tracheobronchialschleimhaut:

Tierexperimentelle Untersuchungen an der Ratte und Ergebnisse von menschlichen Proben

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Katharina Höhne

aus Lemgo

Hannover 2006

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der Medizinischen Hochschule Hannover

Dendritische Zellen in der Tracheobronchialschleimhaut:

Tierexperimentelle Untersuchungen an der Ratte und Ergebnisse von menschlichen Proben

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Katharina Höhne

aus Lemgo

Hannover 2006

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Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover.

Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: PD Dr. med. Thomas Tschernig Referent/Referentin: Prof. Dr. med. Joachim Freihorst Korreferent(en)/Korreferentin(nen): PD Dr. med. Andreas Schmiedl Tag der mündlichen Prüfung: 20.09.2006

Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Ernst Ungewickell Prof. Dr. Peter Redecker Prof. Dr. Kurt Wonigeit

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Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis 1

1 Einleitung 3

1.1 Dendritische Zellen 3

1.2 Funktion der dendritischen Zellen in der Lunge 5 1.3 Die Aufgabe der dendritischen Zellen im menschlichen Respirationstrakt 6 1.3.1 Die Rolle der dendritischen Zellen bei Asthma bronchiale 7

1.4 Ziele der Arbeit 9

2 Material und Methoden 14

2.1 Allergische Provokation im tierexperimentellen Ansatz im Rattenmodell 14

2.2 Induzierte Immunreaktion im Rattenmodell 19

2.2.1 Ein bakterielles Lipopeptid als Auslöser einer Immunreaktion 19 2.2.2 Ein rekombinanter Wachstumsfaktor als Auslöser einer Immunreaktion 21 2.3 Untersuchungen an humanem Probenmaterial 22

2.3.1 Kultivierte Bronchialbiopsien 22

2.3.2 Organkulturen von Bronchialschleimhaut 24

2.3.3 Gewinnung und Färbung von humanen Bronchien 26

2.4 Verwendete Antikörper 29

3 Ergebnisse 30

3.1 Ergebnisse einer allergischen Provokation im Rattenmodell 30 3.2 Ergebnisse einer induzierten Immunreaktion im Rattenmodell 32 3.2.1 Ein bakterielles Lipopeptid als Auslöser einer Immunreaktion 32 3.2.2 Ein rekombinanter Wachstumsfaktor als Auslöser einer Immunreaktion 33

3.3 Befunde an humanem Probenmaterial 34

3.3.1 Biopsien der Bronchialschleimhaut 34

3.3.3 Gewinnung und Färbung von humanen Bronchien 38 3.4 Immunhistochemischer Nachweis von dendritischen Zellen 40

4 Diskussion 42

4.1 Diskussion der Ergebnisse einer allergischen Provokation im Rattenmodell 42 4.2 Diskussion der Ergebnisse einer induzierten Immunreaktion im Rattenmodell44 4.2.1 Ein bakterielles Lipopeptid als Auslöser einer Immunreaktion 44 4.2.2 Ein rekombinanter Wachstumsfaktor als Auslöser einer Immunreaktion 45 4.3 Diskussion der Befunde an humanem Probenmaterial 46

4.3.1 Biopsien der Bronchialschleimhaut 46

4.3.3 Gewinnung und Färbung von humanen Bronchien 48

4.4 Schlussfolgerung und Ausblick 49

5 Zusammenfassung 50

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6 Liste der Abkürzungen 53

7 Literaturverzeichnis 55

8 Lebenslauf 67

9 Erklärung 68

10 Danksagung 69

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1 Einleitung

1.1 Dendritische Zellen

Dendritische Zellen sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen (APC), die die Fähigkeit haben, primäre Immunantworten auszulösen. Sie wurden erstmalig 1868 von P. Langerhans beschrieben und waren zunächst nur als Zellen der Epidermis bekannt. Erst ein Jahrhundert später (1973) wurden ähnliche Zellen auch in anderen Geweben beschrieben (1).

Dendritische Zellen (dendritic cells: DCs) haben eine sehr charakteristische Morphologie: Ihre sternförmige Gestalt entsteht durch sich seitlich vom Zellköper ins Gewebe erstreckende Armfortsätze, die auch Lamellipodia oder "veils" genannt werden. Diese Fortsätze können aktiv bewegt werden. Man hat dendritische Zellen mit Ausnahme des Gehirns (2) im Interstitium fast aller Gewebe gefunden. DCs aktivieren im Rahmen der primären Immunantwort sowohl ruhende als auch naive T- Zellen (3). Sie sind sehr potente APCs: eine kleine Anzahl von Zellen reicht aus, um große Mengen T-Helfer-Zellen und zytotoxische Zellen zu aktivieren (3).

Unreife DCs (immature DCs: DCimm) nehmen im Gewebe Antigene (Ag) auf. Dieses kann über verschiedene Mechanismen geschehen: 1. Makropinozytose, 2. Rezeptor vermittelte Endozytose über den Fc und Fc Rezeptor (4, 5), 3. Rezeptor vermittelte Endozytose über den Mannose-Rezeptor (6) oder den C-Typ Lectin Rezeptor DEC205 (7), 4. Aufnahme von apoptotischen Körpern über den Vitronectin-Rezeptor

(v)3 (8, 9). Nach Aufnahme der Ag wandern die Zellen über afferente Lymphwege zu den regionalen Lymphknoten, um in den dort befindlichen T-Zell-Arealen den ruhenden, naiven T-Zellen das Ag zu präsentieren. Während dieser Wanderung (Migration) zu den Lymphknoten, reifen die unreifen DCs zu einem reifen Zelltyp (mature DCs: DCmat) heran. Dabei verändert sich ihr Phänotyp und ihre Funktion. Die

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Reifung der DCs wird durch zahlreiche Zytokinen beeinflusst, einschließlich IL-1 (Interleukin 1), TNF- (tumor necrosis factor ) und IL-4, aber vor allem GM-CSF (granulocyt-macrophage colony stimulating factor), der, wie es scheint, als wichtigster Regulator in diesem Prozess wirkt (10).

Während der Reifung werden verschiedene Moleküle hochreguliert. Die DCimm

zeigen nur eine geringe Expression des CD83, während bei den DCmat eine hohe Expression von CD83 nachgewiesen werden kann, wodurch dieses Oberflächen- molekül zu einem wichtigen Identifikations-Marker der DCmat wird (2). Aber auch andere Moleküle werden im Rahmen dieses Reifungs-Prozesses hochreguliert, einschließlich MHC-Klasse II (11, 12, 13, 14, 15), ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58), CD11a/c, CD40, CD 80 (16, 17, 18, 19) und CD 86 (20, 21).

Eine wichtige Funktion erfüllt der CC Chemokin Rezeptor CCR7, der von den DCimm

nach Antigen-Kontakt hochreguliert wird. Ein Ligand für CCR7 ist das CC Chemokin SLC. Dieses Chemokin wird hauptsächlich vom Endothel der afferenten Lymphwege und in den T-Zell-Arealen der Lk exprimiert. So konnte auch erklärt werden, warum die DCs direkt nach dem Antigen-Kontakt zu den regionalen Lks wandern (22). In den T-Zell-Arealen der Lymphknoten präsentieren die DCs den T-Zellen die Antigene in Verbindung mit MHC-Molekülen. Naive T-Zellen proliferieren und differenzieren sich nachdem sie die MHC-Antigene durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) erkannt haben. Dafür werden weitere, kostimulatorische Signale benötigt (23). Die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86, die auf der Oberfläche der DCs exprimiert werden, interagieren mit CD28 und CTLA- 4 auf den T-Zellen und liefern so das sekundäre Signal (24).

Auf diese Weise aktivieren die DCs sowohl die Lymphokin-sezernierenden T-Helfer- Zellen, als auch Effektor-T-Killerzellen, welche dann zum verletzten Gewebe wandern und mit Viren befallene Zellen oder Tumorzellen vernichten (2).

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DCs spielen außerdem eine wichtige Rolle bei dem Erlernen von immunologischer Toleranz: Im Thymus präsentieren sie der neuen Generation der Thymozyten endogene, körpereigene Peptide. Reagieren die Thymozyten auf diese Peptide, so veranlassen die DCs deren Abtötung (2).

Auf die Charakterisierung der plasmoiden und myeloiden DC, die besonders bei der Maus funktionell charakterisiert sind, muss hier verzichtet werden und deshalb sei auf die aktuelle Literatur (25) verwiesen.

1.2 Funktion der dendritischen Zellen in der Lunge

Die Lunge ist konstant einer Vielzahl von Antigenen und Schadstoffen ausgesetzt.

Daher wäre es problematisch, wenn die DCs, die effizientesten APCs der Lunge (26), jedes Antigen aufgreifen und daraufhin eine immunologische Reaktion auslösen würden, denn dann befände sich die Lunge chronisch im entzündeten Zustand.

In der Lunge liegen die DCs zunächst in unreifem Zustand vor und ihre Reifung wird durch Makrophagen unterdrückt (27). Ein immunologischer Stimulus muss diese Suppression erst überwinden und die weitere Reifung der DCs veranlassen (28) bis eine Immunantwort erfolgt. Das Epithel der Luftwege bei erwachsenen Versuchstieren und auch beim Menschen enthält ein Netzwerk von DCs, mit ungefähr 400-800 DC/mm² auf der Oberfläche des Epithels, vergleichbar mit dem Netzwerk der Langerhanszellen in der Epidermis (28, 29). Die DCs bilden in der Lunge ein Netzwerk direkt um die Luftwege herum: Sie befinden sich im lockeren Gewebe, welches die Gefäße umgibt und in der Pleura. Die meisten der DCs wurden in der Bronchialmukosa, oberhalb oder unterhalb der Basalmembran oder tief im Inneren der Lamina propria gefunden (30). Neuere Studien lassen vermuten, dass

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sich die meisten Abwehrreaktionen der Luftwege in der Lamina propria abspielen. So wurden in Präparaten der menschlichen Trachea bei Färbungen mit Leukozytenmarkern ein deutlicher Anstieg der Marker im Bereich der Lamina propria gefunden (31). Eine andere Studie zeigte, dass dies auch für DCs im Bereich der humanen Bronchien zutrifft. Nachdem Patienten, die an allergischem Asthma litten, einem allergischen Stimulus ausgesetzt waren, erfolgte einige Stunden später eine endoskopische Bronchialbiopsie. Hierbei zeigte sich ein deutlicher Anstieg der Konzentration der DCs im Bereich der Lamina Propria (32).

Bei der Inhalation von Bakterien, Viren oder gelöstem Protein-Ag wandern DCpre

(premature dendritic cells, Vorläufer der dendritischen Zellen) sehr rasch in die Luftwegsepithelien. Dort reifen sie nach der Antigenaufnahme zu DCmat heran und wandern dann zu den mediastinalen Lk, um die Antigene den T-Zellen zu präsentieren und somit eine Immunantwort auszulösen.

1.3 Die Aufgabe der dendritischen Zellen im menschlichen Respirationstrakt

Über die genauen Aufgaben und Fähigkeiten der DCs beim Menschen hat man bisher nur lückenhafte Erkenntnisse. Die Grundaufgabe, die Präsentation von Ag und ein anschließendes Auslösen einer primären Immunantwort, wird wohl die gleiche wie bei Tieren sein, es ist aber unklar, wie weitreichend die DCs noch zusätzlich am menschlichen Immunsystem beteiligt sind. Es wurde festgestellt, dass sich beim menschlichen Neugeborenen noch keine DCs in der Lunge befinden. Dieses wurde am Beispiel von an SID (sudden infant death) gestorbenen Kindern gezeigt. Starben die Kinder (alle vor der Beendigung des ersten Lebensjahres) allerdings an einer

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Infektion der Atemwege, konnte man das Vorkommen von DCs nachweisen. Man nimmt an, dass sowohl die Anwesenheit der DCs (33) als auch die anderer APC durch einen infektiösen Stimulus getriggert wird. Chorioamnionitis scheint ein möglicher Stimulus zu sein: Lag diese Infektion bei Neugeborenen vor, konnte in der Lunge Bronchus-assoziiertes lymphatischen Gewebe (bronchus-associated lymphoid tissue, BALT) nachgewiesen werden, in welchem sich auch vermehrt dendritische Zellen befanden (34).

Im Tiermodell, insbesondere am Beispiel der Ratte, konnte gezeigt werden, dass sich unmittelbar nach der Geburt nur wenige DCs in den Wänden der Luftwege befinden, und dass diese auch nur einen niedrigen MHC-Klasse-II-Level exprimieren (35, 36). Die sofortige, explosionsartige Antwort des DC-Netzwerkes gegenüber lokalen entzündlichen Stimuli ist in dieser Zeit stark beeinträchtigt. Es wird vermutet, dass die DCs während der ersten Lebensphase durch einen aktiven Mechanismus unterdrückt werden. Würden sich diese Ergebnisse auch auf den Menschen übertragen lassen, ergäbe sich daraus eine Erklärung für die erhöhte Empfindlichkeit von Kindern gegenüber viralen Infektionen. Auch die geringere Effizienz (im Vergleich zu Erwachsenen) bei der Entwicklung eines Erinnerungsvermögens seitens der T-Zellen gegenüber viralen Infektionen in dieser frühen Lebensphase ließe sich so erklären (37).

1.3.1 Die Rolle der dendritischen Zellen bei Asthma bronchiale

Atopisches Asthma bronchiale ist durch ein hyperreaktives Bronchialsystem, eine Hypersekretion zähen Schleims und eine chronische eosinophile Entzündung der Luftwege charakterisiert. Es tritt vor allem bei Individuen auf, die auf Umweltallergene mit einer verstärken Sekretion von T-Helferzellen vom Typ 2 (Th2) reagieren (38).

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Th2 sind zur Aktivierung der B-Zellen notwendig sowie zur Differenzierung der B- Zellen zu Plasmazellen, welche IgA, IgM, IgG oder IgE produzieren. In den vergangenen Jahren konnte, in Verbindung mit einem erhöhten hygienischen Standard in der industrialisierten Welt, ein starker Anstieg der atopischen und asthmatischen Erkrankungen verzeichnet werden.

Das von Plasmazellen produzierte Immunglobulin IgE spielt bei der Entstehung von Asthma bronchiale eine wichtige Rolle. Der Serumspiegel des IgE hat eine enge Korrelation zum klinischen Erscheinungsbild der Erkrankung und der Überreaktion der Luftwege. IgE bindet mit einer hohen Affinität an einen Zelloberflächen-Rezeptor (FcRI), der sich nicht nur auf Mastzellen befindet, sondern auch auf der Oberfläche von kutanen DCs (39, 40) und auf DCs des Epithels der Luftwege, insbesondere bei Asthmatikern (41, 42). Die Anzahl der DCs, die den FcRI-α-Rezeptor exprimieren, ist in den Atemwegen von Asthmatikern signifikant erhöht (41, 42). Man hat festgestellt, dass sich in der Lunge von an Asthma erkrankten Personen mehr DCs befinden, als in der Lunge gesunder Kontrollpersonen. GM-CSF, der wichtigste Faktor für die Reifung der DCs, wird in der Luftwegsmukosa von an Asthma erkrankten Patienten in großen Mengen produziert (43). In verschiedenen Studien stellte sich außerdem heraus, dass die Anzahl der DCs, die Aktivations-Marker produzieren, bei Patienten mit Asthma ansteigt (44). Ebenso hat man eine erhöhte Anzahl von aktivierten T-Zellen in der Mukosa der Luftwege festgestellt (45), was gleichfalls als Hinweis auf eine hohe Anzahl aktivierter APCs, insbesondere DCs, gedeutet werden kann (37).

Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass die Exposition gegenüber hohen Dosen von Lipopolysacchariden (LPS) in der frühen Kindheit mit einer verringerten Inzidenz von Asthmaerkrankungen im späteren Leben korrelieren (46). Der Mechanismus, der für diesen Vorgang verantwortlich ist, ist zur Zeit noch unbekannt,

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aber es konnte nachgewiesen werden, dass die systemische Exposition gegenüber LPS während der Sensibilisierungsphase mit inhalativen Ag eine deutliche Minderung der Entzündungsreaktion der Atemwege im Tiermodell bewirkte (47, 48).

Kuipers et al. konnten nachweisen, dass LPS die DC-vermittelte Aktivierung von Th2 sowohl in vitro als auch in vivo durch einen IL-12 abhängigen Mechanismus reduzieren und somit eine verringerte Entzündungsreaktion in den Atemwegen bewirken (38).

1.4 Ziele der Arbeit

1. Einfluss einer allergischen Provokation

In dieser Arbeit soll der Einfluss einer allergischen Provokation auf die Anzahl der DCs in der Schleimhaut der Trachea von Ratten untersucht werden. Die Identifizierung der DCs soll über ihre charakteristische Morphologie und über monoklonale Antikörper erfolgen. Wie schon beschrieben, exprimieren DCs MHC Klasse II Moleküle (Ia) und können so durch den monoklonalen Antikörper Ox6 dargestellt werden. Auch Lymphozyten und Makrophagen sind Ia⁺, wobei letztere nur schwach Ia⁺ sind und auch nur, wenn sie sich in aktiviertem Zustand befinden. Die Lymphozyten sind in der mikroskopischen Auswertung morphologisch von den DCs zu differenzieren. Mit dem monoklonalen Antikörper ED1 können vor allem Makrophagen dargestellt werden, aber auch DCs, die sich im unreifen Stadium befinden.

In einer Studie stellte sich ein Anstieg der Ia⁺ DCs/mm² in der Trachea von Ratten im Zusammenhang mit einer akuten Entzündung dar (29). Die Tracheen, welche in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, stammen von Tieren, bei denen eine

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allergische inflammatorische Reaktion des Respirationstraktes von Schuster et al.

bereits nachgewiesen worden war (49). Es wird daher die Hypothese untersucht, ob eine allergische Provokation zu einem Anstieg der dendritischen Zellen in der Schleimhaut von Ratten führt.

Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigten zwar einen tendenziellen Anstieg der Anzahl der DCs, konnten allerdings keine signifikante Veränderung der Zellzahl der DCs in der Schleimhaut der Trachea von Ratten nachweisen. Daher wurde in einem weiteren Versuch der Einfluss einer induzierten Immunreaktion auf die Anzahl der DCs in der Schleimhaut der Trachea von Ratten untersucht. Diese Immunreaktion wurde einerseits durch ein bakterielles Lipopeptid ausgelöst und in einer weiterem Versuch durch einen rekombinanten Wachstumsfaktor.

2. Einfluss einer induzierten Immunreaktion

2.1 Ein bakterielles Lipopeptid als Auslöser einer Immunreaktion

2S-MALP-2 (2-kDa macrophage-activating lipopeptide) wurde ursprünglich aus Mycoplasma fermentans isoliert und kann mittlerweile auch chemisch synthetisiert

werden (49). Mykoplasmen unterscheiden sich von anderen Bakterien vor allem dadurch, dass sie keine Zellwand besitzen. Sie lösen häufig Pneumonien aus, die in der akuten Phase der Entzündung durch einen Einstrom von Neutrophilen (51) und mononukleären Zellen (52, 53) charakterisiert sind. Im chronischen Stadium erfolgt eine Angiogenese (52) und eine Fibrosierung der Luftwege (54). Die Immunantwort eines Organismus auf eine Mykoplasmen-Infektion wird durch Lipoproteine und Lipopeptide ausgelöst, die von Mykoplasmen exprimiert werden (z.B. 55). Das in der vorliegende Arbeit verwendete 2S-MALP-2 ist nur eins von über 30 verschiedenen Lipopeptiden, welche von Mykoplasmen produziert werden können (56). 2S-MALP-2

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aktiviert, wie der Name vermuten lässt Alveolarmakrophagen, wodurch eine Immunantwort des infizierten Organismus eingeleitet wird (57). In der Arbeit von Lührmann et al. wurde allerdings nicht untersucht, ob die intratracheale Verabreichung von 2S-MALP-2 eine Erhöhung der DCs bewirkt. In der vorliegenden Arbeit wird die Hypothese untersucht, ob die intratracheale Verabreichung von 2S- MALP-2 eine Erhöhung der Anzahl der dendritischen Zellen in der Schleimhaut der Trachea von Ratten bewirkt.

2.2 Ein rekombinanter Wachstumsfaktor als Auslöser einer Immunreaktion

In verschiedenen Arbeiten wurde beschrieben, dass der rekombinante Wachstumsfaktor Flt3L (Fms-like tyrosine kinase receptor-3 ligand) die Produktion und Mobilisation von DCs im Knochenmark und im Blut beeinflusst (58, 59).

Weiterhin konnte nachgewiesen werde, dass Flt3L einen stimulatorischen Effekt auf den Reifungsvorgang der DCs hat (58, 60, 61). In der kürzlich veröffentlichen Arbeit von Pabst et al. konnte nach einer lokalen Applikation von Flt3L ein signifikanter Anstieg der DC-Anzahl im Lungeninterstitium und in der bronchoalveolären Lavage (BAL) nachgewiesen werden (62). Die so aktivierten DCs hatten ihrerseits einen stimulatorischen Effekt auf die Produktion von Ak. In dieser Arbeit wird nun die Hypothese untersucht, ob Flt3L nach intratrachealer Verabreichung auch in der Schleimhaut der Trachea von Ratten eine Erhöhung der DC-Anzahl bewirkt.

3. Untersuchungen an humanen Proben

Nach der Untersuchung von Proben aus tierexperimentellen Ansätzen wird in dieser Arbeit auch das Verhalten von dendritischen Zellen in humanem Probenmaterial untersucht werden.

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3.1 Biopsien der Bronschialschleimhaut

Wie in verschiedenen Untersuchungen gezeigt werden konnte, reagiert das Atmungssystem auf eine Inhalation mit Ozon mit entzündlichen Veränderungen (63).

Ob sich dabei auch die Anzahl der DCs verändert, ist bisher nicht bekannt. In humanen Bronchialschleimhautbiopsien, die im Rahmen von Bronchoskopien entnommen wurden, soll nun das Verhalten von DCs nach Ozoninhalationen untersucht werden. Dabei wird die Hypothese untersucht, ob sich die Anzahl der dendritischen Zellen nach der Inhalation von Ozon erhöht.

3.2 Kultivierte Bronchialbiopsien

Drei-Dimensionale Zellkulturen repräsentieren eine sinnvolle Alternative zu den Monolayer-Kulturen, da sie die natürliche Struktur des Zellkomplexes wiedergeben und gleichzeitig experimentelle Manipulationen erlauben. Diese Methode wurde bei in vitro Untersuchungen an Bronchialkarzinomen angewandt. Zu diesem Zweck ließ man Tumorzellen in die Kulturen einwandern (63). Zur Herstellung der drei- dimensionalen Präkulturen wurden Fragmente von normalem bronchialen Epithel verwandt, das bei routinemäßig durchgeführten Fiberoptik-Bronchoskopien entnommen wurde. Wie schon in früheren Studien gezeigt wurde, sind bronchiale Fragmente innerhalb kurzer Zeit in Kultur völlig mit Epithel bedeckt. Die organtypische Architektur des Epithels sowie der Zilienschlag bleiben zu einem beachtlichen Anteil erhalten (65, 66). In der vorliegenden Arbeit wird zunächst geprüft, ob in den Organkulturen dendritische Zellen vorhanden sind. Falls sich dendritische Zellen darstellen lassen, wird die Hypothese untersucht, ob sich die Anzahl der dendritischen Zellen in der Kultur (ohne eine mögliche Zu- oder Abwanderung von Zellen) verändert.

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3.3 Gewinnung und Färbung von humanen Bronchien

In vorangegangenen Arbeiten konnten DCs bereits in der Trachea des Menschen nachgewiesen werden. Dabei wurde auch festgestellt, dass DCs unter normalen Bedingungen erst nach Beendigung des ersten Lebensjahres in der Trachea vorhanden sind (33). In dieser Arbeit wird die Hypothese geklärt, ob DCs in den kleinen Luftwegen des Menschen dargestellt werden können. Dazu werden ausgewählte Präparate von Obduktionen in der Rechtsmedizin verwendet. Die ausgewählten Patienten sollen alle das erste Lebensjahr beendet haben. Die Darstellung der DCs in der Schleimhaut der kleinen Bronchien soll mit der "whole- mount"-Methode erfolgen.

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2 Material und Methoden

2.1 Allergische Provokation im tierexperimentellen Ansatz im Rattenmodell

Tiere

In den Versuchen wurde Material von männlichen Brown-Norway-Ratten aus Kooperationen mit anderen Mitarbeitern des Institutes verwendet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden keine eigenen Tierversuche durchgeführt. Alle Tiere wurden bis zum Beginn der Versuche unter Spezifisch-Pathogen-Freien-Bedingungen im Tierhaus der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten, sie hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Die geltenden Tierschutzbestimmungen wurden eingehalten.

Sensibilisierung und Challenge der Ratten

Die Sensibilisierung erfolgte, wie bereits von Schuster et al. beschrieben, in Äthernarkose mit einem Gemisch von 1 mg Ovalbumin (OVA; A5503, Sigma, St.

Louis, Missouri, USA) Aluminiumhydroxyd, gelöst in 1 ml 0,9 % NaCl, das subkutan in eine der beiden Flanken injiziert wurde (49). Zum selben Zeitpunkt erfolgte eine intraperitoneale Injektion von 5x10⁹ hitzeabgetöteter Bordetella-Pertussis-Keime, gelöst in 0,4 ml 0,9 % NaCl. Der Zeitpunkt dieser Behandlung wurde als Tag -12 festgelegt (siehe auch Abbildung 1). 7 Tage später, an Tag -5, wurde die Behandlung wiederholt, mit der einzigen Abänderung, dass die OVA-Aluminiumhydroxyd- Mischung in die kontralaterale Seite injiziert wurde.

Die Ratten wurden 5 Tage nach der letzten Injektion, am Tag 0, einem inhalativen Challenge mit OVA unterzogen. Dafür wurden die Ratten in einer Plexiglasröhre von

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ca. 6 cm Durchmesser platziert, so dass die Schnauze der Tiere herausschaute. Die Vernebelung des OVA erfolgte durch einen Pariboy-Vernebler (Pari-Werk GmbH, Starnberg), dessen Ausführungsstück mittels eines mobilen Latexverbindungs- schlauches über dem Ende der Plexiglasröhre fixiert wurde. Der Vernebler arbeitete mit einer Leistung von 0,25 ml/min. Der inhalative Challenge der Ratten wurde für einen Zeitraum von 15 min. durchgeführt (67).

Abbildung 1: Versuchsablauf Sensibilisierung, Challenge und Tötung der Tiere (67).

Tötung der Tiere und Präparation der Trachea

Die Ratten wurden durch Äthernarkose betäubt. Durch eine Einwirkzeit des Äthers von ca. 1-2 min. kamen die Tiere im weiteren Verlauf der Behandlung nicht mehr zu Bewusstsein. Getötet wurden die Ratten durch Entbluten. Dazu wurde die abdominelle Aorta freipräpariert und eingeschnitten. Anschließend wurde die Lunge durch einen Schnitt in den Rippenbogen zum kollabieren gebracht.

Zur Herausnahme der Trachea wurde das Halsfell quer durchtrennt und stumpf von der prätrachealen Faszie abgelöst. Die Schilddrüse wurde entfernt und die prätracheale Muskulatur zur Präparation der Trachea quer durchgeschnitten. Die

2. Sensibilisierung

1. Sensibilisierung Challenge

-12 - 5 0 1 3 7 Tage

Tötung Tötung Tötung Tötung

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Trachea wurde möglichst Zungenbein-nah und kurz oberhalb der Bifurkation durchtrennt und herausgenommen. Nach der Entnahme wurden die Tracheen in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert. Im Kryrostaten wurden bei -20°C 7m dicke Schnitte (Serienschnitte, mit jeweils 7µm Abstand zwischen zwei aufeinander folgenden Schnitten) hergestellt, die anschließend bei -20°C gelagert wurden (67). Die Tötung der Tiere erfolgte an den Tagen 0, 1, 3 und 7 nach der Challenge (siehe auch Abbildung 1).

Immunhistochemische Darstellung der Gewebeschnitte Es wurden drei verschiedene Färbungen durchgeführt:

1. Einfachfärbung mit ED1 2. Einfachfärbung mit Ox6

3. Doppelfärbung mit ED1 und OX6 biotinyliert nach dem Prinzip der Avidin- Biotin-Methode

Die Spülungen nach jedem Arbeitsgang wurden mit TBS-Tween (Tris buffered Saline, Serva, Heidelberg) durchgeführt, vor dem Fixieren wurden die Präparate auf dem Objektträger mit einem Wachsstift (PAP-Pen, SCI Science Service, München) umkreist.

1. Einfachfärbung der Präparate mit Ox6

Die Schnitte wurden zunächst bei -20°C für 10 min. in Aceton fixiert. Danach erfolgte eine weitere Fixierung in 1 % Formaldehyd für 30 min. bei Raumtemperatur. Nun fand mit 0,2 % Glutaraldehyd für 10 min. bei Raumtemperatur wiederum eine Fixierung statt. Jetzt wurde der primäre Antikörpers Ox6, in der Verdünnung 1:200, angesetzt in PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung, Biochrom KG, Berlin) mit 1 %

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BSA (Bovides Serum Albumin; Serva (Boehringer), Heidelberg) und 1 % NaN3 für 30 min. dazugegeben. Nun erfolgte die Zugabe des sekundären Ak (rabbit anti mouse, Z 259 von Dako, Verdünnung 1:50, angesetzt in PBS mit 5 % Rattenserum) und eine Inkubation für 30 min. Dieser sekundäre Antikörper bindet an den Fc-Teil des primären Antikörpers und bildet so eine Brücke zwischen dem primären und dem nachfolgenden tertiären Antikörper. Als tertiärer Antikörper wurde "alkalische Phosphatase-anti-alkalische-Phosphatase" (APAAP, Dako D651, 1:50, angesetzt in PBS) auf die Präparate gegeben und für 30 min. inkubiert. Um die Intensität der Färbungen zu steigern, wurden die Zugaben des sekundären und tertiären Antikörpers für jeweils 15 min. wiederholt. Nun wurde Fast Blue (Sigma F 3378, München), angesetzt in 4 ml APAAP-Substrat, für 25 min. auf die Präparate gegeben. Dann erfolgte eine Gegenfärbung mit Hämalaun (Mayers Hämalaun;

Merck, Darmstadt), angesetzt mit PBS im Verhältnis 1:5. Die Inkubationszeit betrug hierbei 30 min. Das Eindecken der Präparate erfolgte mit einem wässrigen Eindeckmedium, Glycergel (Einschlussmittel C563, Dako, Hamburg).

2. Einfachfärbung mit ED1

Die Schritte der Einfachfärbung mit ED1 entsprechen den oben aufgeführten Arbeitsschritten der Einfachfärbung mit Ox6. Statt Ox6 wurde hier der primäre Antikörpers ED1 (aus der Maus), in der Verdünnung 1:1000, angesetzt in PBS mit 1

% BSA und 1 % NaN3 verwendet, und das Präparat damit für 30 min. inkubiert.

3. Doppelfärbung mit ED1 und OX6 biotinyliert nach dem Prinzip der Avidin-Biotin- Methode

Die Schnitte wurden bei -20°C für 10 min. in Aceton fixiert. Danach erfolgte eine weitere Fixierung in 1 % Formaldehyd für 30 min. bei Raumtemperatur, anschließend

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wurden die Präparate in 0,2 % Glutaraldehyd für 10 min. wiederum bei Raumtemperatur fixiert. Nun wurde der primäre Antikörper ED1 (aus der Maus), in der Verdünnung 1:1000 (angesetzt in PBS mit 1 % BSA und 1 % NaN3) dazu gegeben und für 30 min inkubiert. Danach erfolgte die Inkubation mit dem sekundären Antikörper, dem Brückenantikörper (rabbit anti mouse, Z259 von Dako, in der Verdünnung 1:50, angesetzt in PBS mit 5 % Rattenserum), für 30 min. Jetzt wurde der tertiäre Antikörper (D651 von Dako, 1:50, angesetzt in PBS) hinzugefügt und für 30 min inkubiert. Zur Verstärkung der Farbintensität wurden die Zugaben des sekundären und tertiären Antikörpers für jeweils 15 min. wiederholt. Nun wurde ein primärer Antikörper (Ox6 biotinyliert, d.h. ein mit Biotin konjugierter Antikörper, in der Verdünnung 1:100, angesetzt in PBS mit 1 % BSA und 1 % NaN3) dazugegeben und für 30 min inkubiert. Danach wurde der sekundäre Antikörper (Strept Avidin Peroxidase in der Verdünnung 1:500, angesetzt in PBS mit 5 % Rattenserum) auf die Objektträger gegeben und für 30 min inkubiert. Das Biotinmolekül ist in der Lage mehrere Avidinmoleküle zu binden, wodurch eine ausreichende Peroxidasemenge vom Benzidin, mit dem die Präparate jetzt für 10 min. inkubiert wurden, erreicht werden konnte. Durch diese Reaktion entstand eine braune Farbe. Im Anschluss daran wurde das erste Epitop farbig dargestellt, indem eine Zugabe von Fast Blue, angesetzt in 4 ml APAAP-Substrat, für 25 min. erfolgte. Nach einem letzten Spülvorgang erfolgte eine Gegenfärbung mit Hämalaun, angesetzt mit PBS im Verhältnis 1:5, für 30 min. Danach wurden die Präparate mit einem wässrigen Eindeckmedium, hier mit Glycergel, eingedeckt.

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Auswertung und Statistik

Nach der Erstellung der Präparate wurden diese unter dem Mikroskop bei 100 facher Vergrößerung ausgewertet. Es wurden die oberhalb oder unterhalb der Basal- membran liegenden oder sich in der Lamina propria befindlichen angefärbten Zellen gezählt, deren Morphologie der der dendritischen Zellen entsprach. Die Basalmembran der Trachea diente dabei als Orientierung, so dass der gezählte Bereich ungefähr 5,0 ± 0.8 mm Basalmembran entsprach. Abhängig von der Qualität des Materials wurden pro Antikörperfärbung drei bis sechs Tiere in die Auswertung miteinbezogen. Pro Tier wurden mindestens fünf Trachealschnitte ausgewertet und aus den Ergebnissen jeweils die Mittelwerte berechnet.

Mit Hilfe des Statistikprogramms SPSS (SPSS Inc., Chicago. IL, USA) wurden Mittelwerte und Standardabweichungen berechnet, sowie eine Signifikanz- betrachtung der erhobenen Daten mit dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Alle Daten wurden als Mittelwerte ± Standardfehler angegeben.

2.2 Induzierte Immunreaktion im Rattenmodell

2.2.1 Ein bakterielles Lipopeptid als Auslöser einer Immunreaktion

Tiere

Das hier verwendete Material stammt von männlichen Lewis Ratten und männlichen Brown-Norway-Ratten mit einem Gewicht von 259 ± 56g aus Kooperationen mit anderen Mitarbeitern des Institutes. Im Rahmen dieser Arbeit wurden keine eigenen Tierversuche durchgeführt. Alle Tiere wurden bis zum Beginn der Versuche unter Spezifisch-Pathogen-Freien-Bedingungen im Tierhaus der Medizinischen Hoch-

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schule Hannover gehalten, sie hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Die geltenden Tierschutzbestimmungen wurden eingehalten.

Versuchsablauf

Die Tiere erhielten unter Kurznarkose intratracheal 500µl einer Lösung bestehend aus 2S-MALP-2, einer 33 % 2-Propanol-Wasser-Lösung und NaCl 0,9%. Der genaue Ablauf der Verabreichung der Lösung sowie der genaue Versuchsablauf wurden ausführlich von Lührmann et al. beschrieben (57). Die Tiere wurden drei Tage nach Verabreichung von 2S-MALP-2 wie beschrieben (57) getötet und die Tracheen wurden wie unter 2.1 beschrieben entnommen und aufbereitet.

Immunhistochemische Darstellung der Gewebeschnitte

Die Immunhistochemische Darstellung der Tracheen erfolgte wie in 2.1 beschrieben durch:

1. Einfachfärbung mit ED1 2. Einfachfärbung mit Ox6

3. Doppelfärbung mit ED1 und OX6 biotinyliert nach dem Prinzip der Avidin-Biotin- Methode

4. Einfachfärbung mit Ox62

Die Arbeitsschritte wurden wie in 2.1 geschildert durchgeführt. Der Antikörper Ox62 wurde wie folgend verwendet: angesetzt in PBS mit 1 % BSA (Bovides Serum Albumin) und 1 % NaN3, in der Verdünnung 1:100.

(24)

Die Auswertung erfolgte wie in 2.1 angegeben.

2.2.2 Ein rekombinanter Wachstumsfaktor als Auslöser einer Immunreaktion

Tiere

In den Versuchen wurde Material von Lewis Ratten aus Kooperationen mit anderen Mitarbeitern des Institutes verwendet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden keine eigenen Tierversuche durchgeführt. Alle Tiere wurden bis zum Beginn der Versuche unter Spezifisch-Pathogen-Freien-Bedingungen im Tierhaus der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten, sie hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser.

Die geltenden Tierschutzbestimmungen wurden eingehalten. Weitere Einzelheiten wurden von Pabst et al. ausführlich beschrieben (62).

Versuchsablauf

Den Tieren wurde unter Kurznarkose entweder Flt3L oder NaCl (in der Kontrollgruppe) intratracheal verabreicht. Der genaue Ablauf der Verabreichung und der genaue Versuchsablauf wurden von Pabst et al. ausführlich beschrieben (62).

Die Tiere wurden drei Tage später wie beschrieben (68) getötet und die Tracheen wurden wie unter 2.1 geschildert entnommen und aufbereitet.

Die Immunhistochemische Darstellung der Tracheen erfolgte wie unter 2.1 bzw. 2.2.1 beschrieben.

(25)

Die Auswertung erfolgte wie in 2.1 angegeben.

2.3 Untersuchungen an humanem Probenmaterial

2.3.1 Kultivierte Bronchialbiopsien

Patienten

Der folgende Versuch wurde in Kooperation mit A. Blomberg (Schweden) durchgeführt. Während einer Bronchoskopie wurden den Patienten Bronchial- schleimhaut-Biopsien entnommen. Bei den Patienten handelte es sich um gesunde Nichtraucher im Alter von 22 - 28 Jahren. Die Probanden hatten normale Lungenfunktionsparameter und einen negativen Prick-Test auf Aeroallergene. In den letzten sechs Wochen vor Versuchsbeginn waren die Probanden frei von Infektionen des Respirationstraktes.

Versuchsablauf

In einer speziell entwickelten Kammer inhalierten die Probanden normale Luft bzw.

Ozon. Der genaue Aufbau dieser Kammer und der genaue Versuchsablauf wurde von Salvi et al. ausführlich beschrieben (63).

Sechs Stunden nach der Inhalation erfolgte eine Bronchoskopie, bei der Schleim- hautbiopsien durchgeführt wurden.

(26)

Die immunhistochemische Darstellung der Biopsien erfolgte wie in 2.1 beschrieben durch eine Einfachfärbung. Die Arbeitsschritte wurden wie in 2.1 geschildert durchgeführt. Folgende primäre Antikörper wurden hier verwandt: HLA-DR, angesetzt in PBS mit 1 % BSA (Bovides Serum Albumin) und 1 % NaN3, in der Verdünnung 1:100. CD 83, ebenfalls angesetzt in PBS mit 1 % BSA und 1 % NaN3, in der Verdünnung 1:25. CD 11c, angesetzt in PBS mit 1 % BSA und 1 % NaN3, in der Verdünnung 1:50.

Nach der Erstellung der Präparate wurden diese unter dem Mikroskop bei 100 facher Vergrößerung ausgewertet. Die Bronchialschleimhaut wurde über eine Länge von 0,5 mm ausgewertet. Dabei wurden die angefärbten Zellen gezählt, deren Morphologie der der dendritischen Zellen entsprach. Abhängig von der Qualität des Materials wurden pro Patient zwei bis sechs Präparate ausgewertet.

Mit Hilfe des Statistikprogramms SPSS (SPSS Inc., Chicago. IL, USA) wurden Mittelwerte und Standardabweichungen berechnet, sowie eine Signifikanz- betrachtung der erhobenen Daten mit dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Alle Daten wurden als Mittelwerte ± Standardfehler angegeben.

(27)

2.3.2 Organkulturen von Bronchialschleimhaut

Herstellung der drei-dimensionalen Organkulturen

Zur Herstellung der drei-dimensionalen Primärkulturen wurden Fragmente von normalem bronchialen Epithel verwandt, das bei routinemäßig durchgeführten Fiberoptik-Bronchoskopien entnommen wurde. Dies geschah in Kooperation mit R.H.

Huber (München).

Die bronchialen Gewebefragmente von 0,5 - 1 mm Durchmesser wurden in Agar- Kulturen platziert. Die genauen Angaben zum Nährmedium etc. sind von Al-Batran et al. ausführlich beschrieben worden (64). Die Organkulturen wurden an den Tagen 2, 5, 10 und 28 zunächst gefroren und anschließend gefärbt.

Auch hier erfolgte die immunhistochemische Darstellung der Gewebeschnitte nach dem Prinzip der Einfachfärbung, welches in Abschnitt 2.1 erläutert wird. Es wurden folgende primäre Antikörper verwendet: CD 11c, angesetzt in PBS mit 1 % BSA und 1 % NaN3, in der Verdünnung 1:50. CD 86, angesetzt in PBS mit 1 % BSA und 1 % NaN3, in der Verdünnung 1:25.

Es wurde außerdem eine Doppelfärbung durchgeführt: Um sich teilende Zellen zu identifizieren wurde der Proliferationsmarker Bromdesoxyuridin (BrdU; 5-bromo-2- desoxyuridine, Sigma Nr. B-5002, München) verwendet. Es handelt sich dabei um ein Thymidinanalogon, das während der Synthesephase des Zellzyklus in die DNS eingebaut wird und somit die proliferierenden Zellen markiert.

Auf die Oberflächenfärbung mit HLA-DR, angesetzt in PBS mit 1 % BSA und 1 % NaN3, in der Verdünnung 1:100, folgte die Darstellung der BrdU-positiven Zellen.

(28)

Dazu wurden die Präparate zunächst 30 Minuten lang in Äthanol fixiert und getrocknet. Nun folgte die Denaturierung der DNS, um das inkorporierte BrdU für den spezifischen Antikörper zugänglich zu machen. Anschließend wurden die Präparate mit NaOH (0,025N) für 30 Sekunden und Trinatrium (5 %) für 15 min. bei 70°C denaturiert. Zur Fixierung erfolgte eine Inkubation von 30 min. mit Formaldehyd (1 %) und von 10 min. mit Glutaraldehyd (0,25). Jetzt wurde der primäre Antikörper, anti- (α)-BrdU (Becton Dickenson 7580, Heidelberg) in der Verdünnung 1:500 dazugegeben. Über Nacht wurden die Präparate in einer feuchten Kammer bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden der Brückenantikörper (rabbit anti mouse, Z259 von Dako, in der Verdünnung 1:50, angesetzt in PBS mit 5 % Rattenserum) und der tertiäre Antikörper APAAP hinzugegeben. Danach wurde Fast Blue auf die Präparate gegeben und für 25 min. inkubiert. Zum Schluss wurden die Präparate mit Glycergel als Einschlussmedium eingedeckelt. Die hier beschriebenen Inkubationen erfolgten jeweils in einer feuchten Kammer bei ca. 20°C (Raumtemperatur) und auf einem Rüttler mit einer Schwingfrequenz von 60/min.

Nach der Erstellung der Präparate wurden diese unter dem Mikroskop bei 100 facher Vergrößerung ausgewertet. Dabei wurden auf einer Fläche von 10 mm² die angefärbten Zellen gezählt, deren Morphologie der der dendritischen Zellen entsprach. Abhängig von der Qualität des Materials wurden pro Tag und Färbung zwei bis sechs Präparate ausgewertet.

Mit Hilfe des Statistikprogramms SPSS (SPSS Inc., Chicago. IL, USA) wurden Mittelwerte und Standardabweichungen berechnet, sowie eine Signifikanz-

(29)

betrachtung der erhobenen Daten mit dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Alle Daten wurden als Mittelwerte ± Standardfehler angegeben.

2.3.3 Gewinnung und Färbung von humanen Bronchien

Materialgewinnung

Um DCs in verschiedenen Bronchusabschnitten zu untersuchen wurden in Zusammenarbeit mit der Abteilung für Rechtsmedizin der Medizinischen Hochschule Hannover auf Grund der Obduktionsberichte in anonymisierter Form 12 Patienten ausgewählt. Darunter befanden sich 8 weibliche und 4 männlich Personen im Alter von 24 – 86 Jahren. Die Auswahlkriterien waren dabei wie folgend definiert:

Die Personen sollten zum Zeitpunkt des Todes das erste Lebensjahr vollendet haben, außerdem sollte zum Todeszeitpunkt weder eine chronische Lungen- erkrankung noch eine Lungenverletzung vorgelegen haben. Zwischen dem zum Tod führenden Ereignis und dem eigentlichen Todeseintritt sollten nicht mehr als 2 Stunden vergangen sein. Das zeitliche Intervall zwischen Eintritt des Todes und der Obduktion sollte weniger 72 Stunden betragen haben.

Aus den in der Rechtsmedizin entnommenen Gewebestücken der Lungen, die zwischenzeitlich in Formaldehyd gelagert wurden, wurden die Bronchien frei- präpariert und anschließend auf Sylgard (184 Silicone Elastomer, Dow Corning, Wiesbaden) mit feinen Nadeln befestigt.

Die immunhistochemische Darstellung erfolgte nach dem Prinzip der "whole-mount"- Färbung über eine Zeitraum von fünf Tagen.

(30)

Am ersten Tag wurden die Gewebeschnitte in 0,3 % Triton X-100, mit 0,01 % Thiomersal und PBS, dreimal für jeweils eine Stunde permeabilisiert. Anschließend wurde 5 % Ziegenserum, angesetzte in Triton (X 100, Sigma, St. Louis, Missouri, USA), NaN3 (Merck, Darmstadt) und PBS, auf die Präparate gegeben und für 2 Stunden inkubiert. Nun folgte der erste Antikörper, HLA-DR, angesetzt in PBS mit 1 % BSA (Bovides Serum Albumin) und 1 % NaN3, in der Verdünnung 1:100, der für 36 Stunden inkubiert wurde.

An Tag 3 wurden die Gewebeschnitte zunächst 6 mal für jeweils 1 Stunde mit PBS und 0,001 % NaN3 gespült. Jetzt wurde der zweite Antikörper, F(ab´)2 Rb mouse HRP (Serotec, Düsseldorf), in der Verdünnung 1:50, angesetzt in PBS und 5 % Mäuseserum, auf die Präparate gegeben und für 24 Stunden inkubiert.

An Tag 4 erfolgten vier Spülungen mit PBS und 0,01 % NaN3 für jeweils eine Stunde.

Danach zwei weitere Spülungen mit TBS-Tween für jeweils 30 min. Dann wurden die Gewebeschnitte zunächst für 10 min. in Benzidin (D5637, Sigma, St. Louis, Missouri, USA) gegeben und dann für weitere 10 min. in Aqua dest. Nun erfolgte eine Entwässerung durch eine aufsteigende Alkoholreihe mit den Ethanolkonzentrationen von 50%, 70% und 100%. Jetzt wurde der Sylgard entfernt und die Präparate wurden zwischen zwei Objektträgern über Nacht in 100 % Ethanol gelegt.

An Tag 5 erfolgte eine Spülung mit Xylol (BAKER, Deventer, Niederlande) über 10 min., danach wurden die Gewebeschnitte in Eukitt (G.Kindler GmbH & Co, Freiburg) eingebettet.

(31)

Nach der Erstellung der Präparate wurden diese unter dem Mikroskop bei 100 facher Vergrößerung ausgewertet. Dabei sollten die angefärbten Zellen gezählt werden, deren Morphologie der der dendritischen Zellen entsprach.

(32)

2.4 Verwendete Antikörper

Folgende primäre Antikörper wurden verwandt:

Tabelle 1: Spezifität, Verdünnung und Literaturangaben der verwendeten Antikörper Spezies Hauptspezifität Zellklon Antikörper-

verdünnung

Literatur- angaben Ratte MHC-Klasse II Ox6

(Serotec, Düsseldorf)

1:200 (69)

Ratte Dendritische Zellen,

Makrophagen

ED 1

1:1000 (70)

Ratte Dendritische Zellen

Ox62

1:100 (71)

Mensch DC mature CD 83

1:25 (72)

Mensch DC mature CD 11c

(Dako A/S, Dänemark)

1:50 (73)

Mensch DC mature CD 86

(Dako A/S, Dänemark) HLA-DR

1:25 (74)

Mensch DC mature HLA-DR

1:100 (32)

allgemein Zellen in der DNS-

Synthesephase

anti-BrdU

(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)

1:500 (75)

(33)

3 Ergebnisse

3.1 Ergebnisse einer allergischen Provokation im Rattenmodell

Bei der Färbung mit dem monoklonalen Antikörper Ox6, der MHC Klasse II⁺ Zellen darstellt (siehe Abbildung 11, Bild A und Bild B), wurden zum Zeitpunkt Tag 0 ca. 200 Zellen angefärbt. An den folgenden Tagen konnte keine signifikante Veränderung der Zellzahl festgestellt werden. Es konnte ein tendenzieller Anstieg an Tag 1 beobachtet werden, mit einem Maximalwert von 455 Zellen pro 5,0 ± 0.8 mm Basalmembran (siehe auch Abbildung 2).

Abbildung 2: Zahl der MHC-Klasse-II⁺ Zellen (Ox6⁺) zu den verschiedenen Zeitpunkten nach dem Challenge in der Trachealschleimhaut von männlichen Brown- Norway-Ratten

(Mittelwert ± Standardfehler pro 5,0 ± 0.8 mm Basalmembran) Signifikante Unterschiede waren nicht zu beobachten.

0 1 3 7

0 100 200 300

400

Dendritische Zellen

Tage

Zellzahl

(34)

Mit dem monoklonalen Antikörper ED1 lassen sich Makrophagen und dendritische Zellen darstellen (siehe Abbildung 11, Bild C und Bild D). Zum Zeitpunkt Tag 0 wurden rund 200 ED1⁺ Zellen gezählt, deren Anzahl sich an den darauffolgenden Tagen nicht signifikant veränderte. Es wurde ein tendenzieller Anstieg an Tag 1 und 3 festgestellt. An Tag 7 lagen die Zellzahlen unter den Ausgangswerten von Tag 0 (siehe auch Abbildung 3).

Abbildung 3: Zahl der dendritischen Zellen und Makrophagen (ED1⁺) zu den verschiedenen Zeitpunkten nach dem Challenge in der Trachealschleimhaut von männlichen Brown-Norway-Ratten

(Mittelwert ± Standardfehler pro 5,0 ± 0.8 mm Basalmembran) Signifikante Unterschiede waren nicht zu beobachten.

Mit einer Doppelfärbung von Ox6 und ED1 wurden nun die ED1⁺-DCs erkennbar gemacht (siehe Abbildung 11, Bild E). An Tag 0 lag deren Zahl bei unter 20 Zellen pro 5,0 ± 0.8 mm Basalmembran. An den folgenden Tagen konnte keine signifikante Veränderung der Zellzahl festgestellt werden. An Tag 1 erfolgte ein tendenzieller

0 1 3 7

0 100 200 300

400

Dendritische Zellen, Makrophagen

Tage

Zellzahl

(35)

Anstieg der DCs auf das vierfache der Ausgangswerte. Dieser Anstieg setzte sich bis zum Tag 3 fort, an welchem Maximalwerte von 122 Zellen pro 5,0 ± 0.8 mm Basalmembran zu verzeichnen waren. An Tag 7 waren die Werte signifikant erhöht (siehe auch Abbildung 4).

Abbildung 4: Zahl der dendritischen Zellen (Ox6⁺ und ED1⁺) zu den verschiedenen Zeitpunkten nach dem Challenge in der Trachealschleimhaut von männlichen Brown- Norway-Ratten

(Mittelwert ± Standardfehler pro 5,0 ± 0.8 mm Basalmembran)

* = signifikanter Unterschied zu Tag 0 (p<0,05)

3.2 Ergebnisse einer induzierten Immunreaktion im Rattenmodell

Drei Tage nach 2S-MALP-2 - Exposition erhöhte sich die Anzahl der Ox6⁺-Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe nur geringfügig (siehe Abbildung 11, Bild F), ebenso in

0 1 3 7

0 25 50 75 100

*

Dendritische Zellen

Tage

Zellzahl

(36)

der Doppelfärbung. Die Anzahl der ED1⁺-Zellen, sowie die Anzahl der Ox62⁺-Zellen nahm dagegen gegenüber den Kontrollen leicht ab (siehe auch Abbildung 5).

Abbildung 5: Vergleich der Zellzahlen in der Trachea von Ratten nach intratrachealer Verabreichung von 2S-MALP-2 gegenüber einer Kontrollgruppe, der intratracheal NaCl 0,9% verabreicht wurde.

(Mittelwert ± Standardfehler pro 5,5 ± 0,2 mm Basalmembran) Signifikante Unterschiede waren nicht zu beobachten.

3.2.2 Ein rekombinanter Wachstumsfaktor als Auslöser einer Immunreaktion Die Anzahl der Ox6⁺-Zellen veränderte sich durch die Behandlung mit Flt3L nur geringfügig (siehe Abbildung 11, Bild G). Die Anzahl der ED1⁺-Zellen nahm gegenüber der Kontrollgruppe ab. In der Doppelfärbung mit Ox6&ED1 erfolgte eine signifikante Abnahme der DCs. Ebenso erfolgte eine signifikante Abnahme der Anzahl der Ox62⁺-Zellen (siehe auch Abbildung 6).

0 50 100

150

2- S -MALP2

Kontrolle 2-S-MALP2

Zellzahl

Ox6 ED1 Ox6&ED1 Ox62

(37)

Abbildung 6: Vergleich der Zellzahlen in der Trachea von Ratten nach intratrachealer Verabreichung von Flt3L gegenüber einer Kontrollgruppe, der intratracheal NaCl 0,9 % verabreicht wurde.

(Mittelwert ± Standardfehler pro 5,5 ± 0,2 mm Basalmembran)

* = signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (p<0,05)

3.3 Befunde an humanem Probenmaterial

3.3.1 Biopsien der Bronchialschleimhaut

Patient A ist 28 Jahre alt und hat normale Luft inhaliert, Patient B ist 22 Jahre alt und hat ebenfalls normale Luft inhaliert, Patient C ist 28 Jahre alt und hat Ozon inhaliert.

Bei Patient A wurden bis zu 20 HLA-DR⁺ Zellen pro 0,5 mm Bronchialschleimhaut festgestellt. Patient B zeigte eine maximale Zellanzahl von 46 Zellen pro 0,5 mm Bronchialschleimhaut, die Anzahl der Zellen war im Vergleich zu Patient A signifikant höher. Bei Patient C befanden sich bis zu 35 Zellen pro 0,5 mm

0 50 100 150

*

Kontrolle Flt3 L

Flt3 L

Ox6 ED1 Ox6&ED1 Ox62

Zellzahl

(38)

Bronchialschleimhaut (Abbildung 11, Bild H), die Zellzahl war, verglichen mit Patient A, signifikant höher (siehe auch Abbildung 7).

Abbildung 7: Zahl der HLA-DR⁺ Zellen auf 0,5 mm Bronchialschleimhaut der Patienten A, B und C

(Darstellung mit Mittelwert ± Standardwert)

* = Signifikanter Unterschied zu Patient A (p<0,05)

Die Gewebeproben von Patient A weisen bis zu 17 CD 83⁺ Zellen pro 0,5 mm Bronchialschleimhaut auf. Bei Patient B konnten maximal 23 Zellen pro 0,5 mm Bronchialschleimhaut nachgewiesen werden. Patient C zeigte bis zu 25 Zellen pro 0,5 mm Bronchialschleimhaut, was eine signifikante Abweichung im Vergleich zu Patient A darstellt (siehe auch Abbildung 8).

0 10 20 30 40 50

*

HLA-DR

⁺

-Zellen

Zellzahl

Pat. A Pat. B Pat. C (Reinluft) (Reinluft) (Ozon)

(39)

Abbildung 8: Zahl der CD 83⁺ Zellen auf 0,5 mm Bronchialschleimhaut der Patienten A, B und C

(Darstellung mit Mittelwert ± Standardwert)

* = Signifikanter Unterschied zu Patient A (p<0,05)

3.3.2 Kultivierte Bronchialbiopsien

Bei den Ergebnissen der Zellzählungen in den Organkulturen muss beachtet werde, dass es sich hier um eine semiquantitative Auswertung handelt.

Bei der Färbung mit CD 11c wurden an Tag 2 Maximalwerte von 46 CD 11c⁺ Zellen pro 10 mm² Organkultur nachgewiesen. Im Verlauf des Versuches fand an Tag 5 eine signifikante Abnahme der Zellzahl statt. Diese signifikante Abnahme setzte sich an Tag 10 fort, an dem durchschnittlich 7,4 Zellen pro 10 mm² gezählt wurden (siehe auch Abbildung 9).

0 10 20 30

*

CD83

⁺

-Zellen

Zellzahl

Pat. A Pat. B Pat. C (Reinluft) (Reinluft) (Ozon)

(40)

Abbildung 9: Zahl der CD 11c⁺ Zellen zu verschieden Zeitpunkten in den Organ- kulturen auf einer Fläche von 10 mm² (Darstellung mit Mittelwert)

* = Signifikanter Unterschied zu Tag 2 (p<0,05)

Im Rahmen einer Färbung mit CD 86 sah man an Tag 2 Höchstwerte von 18 CD 86⁺ Zellen pro 10 mm². An den folgenden Tagen konnte keine signifikante Veränderung der Zellzahl festgestellt werden. Die Ergebnisse von Tag 5 zeigen einen tendenziellen Abfall der Werte, wobei Höchstwerte von 7 Zellen pro 10 mm² gezählt wurden. Daraufhin erfolgte an Tag 10 eine weitere tendenzielle Abnahme der Zellzahl, deren Durchschnitt unter den von Tag 2 fiel (siehe auch Abbildung 10).

2 5 10

0 10 20 30 40

50

CD11c

⁺

Zellzahl

Tage

(41)

Abbildung 10: Zahl der CD 86⁺ Zellen zu verschieden Zeitpunkten in der Organkultur auf einer Fläche von 10 mm² (Darstellung mit Mittelwert)

Bei einer zu geringen Probenanzahl an Tag 2 konnte hier keine Berechnung der Signifikanz erfolgen.

Es wurde zusätzlich eine Doppelfärbung mit HLA-DR und anti-BrdU durchgeführt (siehe Abbildung 11, Bild I und Bild J). Während an Tag 2 noch keine anti-BrdU⁺ Zellen nachgewiesen werden konnten, wurden an den Tagen 5 und 10 in jeweils einem Präparat eine positive Zelle dargestellt. An Tag 28 konnte in drei Präparaten jeweils eine positive Zelle nachgewiesen werden.

3.3.3 Gewinnung und Färbung von humanen Bronchien

Es wurden versuchsweise sowohl humane Bronchien als auch Rattentrachen nach der "whole-mount"-Methode behandelt (siehe Abbildung 11, Bild K). Die Präparation der Gewebeproben konnte problemlos durchgeführt werden. Die anschließende

2 5 10

0 10

20

CD86

⁺

Zellzahl

Tage

(42)

immunhistochemische Darstellung gestaltete sich schwierig. Lediglich in einer Färbung einer Maustrachea gelang der Nachweis von dendritischen Zellen.

Allerdings konnte dieses Ergebnis in erneuten Färbungen weder bei der Maus, noch bei der Ratte oder an humanen Proben reproduziert werden.

Deshalb wurde beschlossen, die Bronchien wie folgend dargestellt zu färben.

Die Biopsien wurden zunächst durch Xylol und einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert. Die weiteren Arbeitsschritte sind die einer Einfachfärbung und wurden bereits in Abschnitt 2.1 dargestellt. Als primärer Antikörper wurde HLA-DR bzw. CD 83, angesetzt in PBS mit 1 % BSA und 1 % NaN3, in der Verdünnung 1:100 verwendet.

Allerdings konnten auch im Rahmen dieser Färbung keine DCs in den humanen Bronchien nachgewiesen werde.

(43)

3.4 Immunhistochemischer Nachweis von dendritischen Zellen

(Abbildung 11, auf der Folgeseite)

Vergrößerung im Original: Bild D 50x, alle übrigen Bilder 100x

A: Dendritische Zellen (Pfeile) in der Bronchialmukosa von Ratten, ohne Einfluss einer allergischen Provokation, Färbung mit dem monoklonalen Antikörper Ox6

B: Dendritische Zellen (Pfeile) in der Bronchialmukosa von Ratten, nach Einfluss einer allergischen Provokation, Färbung mit dem monoklonalen Antikörper Ox6

C: Dendritische Zellen (Pfeil) in der Bronchialmukosa von Ratten, nach Einfluss einer allergischen Provokation, Färbung mit dem monoklonalen Antikörper ED1

D: Kontrollfärbung der Bronchialmukosa von Ratten, nach Einfluss einer allergischen Provokation

E: Dendritische Zellen (waagerechter Pfeil) und Makrophagen (senkrechter Pfeil) in der Bronchialmukosa von Ratten, nach Einfluss einer allergischen Provokation, Doppelfärbung mit den monoklonalen Antikörpern Ox6 Und ED1 F: Dendritische Zellen (Pfeile) in der Trachea von Ratten nach intratrachealer

Verabreichung von 2S-MALP-2, Färbung mit dem monoklonalen Antikörper Ox6

G: Dendritische Zellen (blau angefärbt) in der Trachea von Ratten nach intratrachealer Verabreichung von Flt3L, Färbung mit dem monoklonalen Antikörper Ox6

H: Dendritische Zelle (Pfeil) in der Bronchialschleimhaut von Patient C, nach der Inhalation mit Ozon, Oberflächenfärbung mit HLA-DR

I: Dendritische Zelle (Pfeil) in der Organkultur aus Fragmenten von normalem humanen bronchialen Epithel, Oberflächenfärbung mit HLA-DR

J: Dendritische Zelle (Pfeil) in der Organkultur aus Fragmenten von normalem humanen bronchialen Epithel, Doppelfärbung mit HLA-DR und anti-BrdU K: Dendritische Zellen (Pfeile) in einer Maustrachea gefärbt nach dem "whole-

mount"-Prinzip

(44)

(45)

4 Diskussion

4.1 Diskussion der Ergebnisse einer allergischen Provokation im Rattenmodell

Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse müssen vorsichtig bewertet werden, da die Versuche bei nur geringer Tieranzahl orientierenden Charakter haben. Auch konnte nicht ausgeschlossen werden, dass durch die Haltungsbedingungen bereits eine Grundstimulation mit hoher DC-Anzahl vorhanden war.

Nach den Ergebnissen in der oben genannten Literatur wurde im Rahmen einer Reaktion auf eine allergische Provokation mit einem starken Anstieg der Anzahl der DCs gerechnet. Zuvor war bereits durch Schuster et al. bei den untersuchten Tieren eine allergische inflammatorische Reaktion des Respirationstraktes nachgewiesen worden (49).

Eine Arbeit von Schon-Hegrad et al. stellt den Zusammenhang zwischen einer akuten Entzündung und dem Anstieg der Dichte der intraepithelialen DCs in der Trachea der Ratte her (29). Dazu wurden die Ratten einem bakteriellen Endotoxin (Lipopolysaccharid/LPS)-Aerosol ausgesetzt. Anschließend wurden tangentiale Schnitte der Trachea gefertigt und die Anzahl der Ia⁺ DCs (dargestellt durch den monoklonalen Antikörper Ox6) pro mm² Schleimhaut berechnet. Dabei wurde eine Erhöhung der Zelldichte von ~30 % festgestellt im Vergleich zu Tieren, die einem Aerosol aus physiologischer Kochsalzlösung ausgesetzt waren. Die größte Dichte der DCs/mm² wurde 24 Stunden nach der Aerosolexposition mit einem Anstieg der Dichte von bis zu 50 % festgestellt. Da in dieser Studie tangentiale Schnitte durch die Schleimhaut der Trachea verwandt wurden, kann ein direkter Vergleich mit der

(46)

vorliegenden Arbeit nicht stattfinden, da hier Querschnitte der Trachea betrachtet wurden.

In der vorliegenden Arbeit wurde der größte tendenzielle Anstieg der Ia⁺ DCs ebenfalls 24 Stunden nach der Antigenexposition beobachtet. Allerdings war der Anstieg nicht so stark wie erwartet. Dies könnte unter anderem daran liegen, dass das Allergie-auslösende Antigen nicht lange genug auf die Schleimhaut der Trachea einwirken konnte, die Tiere das Aerosol nicht richtig inhalierten oder die Anzahl der DCs bereits zu Anfang des Versuchs in der Trachea relativ hoch war.

In einer anderen Studie bei der eine immunhistochemische Färbung des Lungengewebes von Ratten stattfand, wurde neben Ox6 unter anderem auch der monoklonale Antikörper ED1 verwendet (76). In der genannten Studie fanden sich in den Geweben um die Bronchien und Gefäße herum, sowie in den Alveolarsepten keine ED1⁺- DCs. Allerdings wurden im Epithel der Luftwege bis zu 65 % ED1⁺- DCs beobachtet. In der vorliegenden Arbeit wurde durch eine Doppelfärbung mit Ox6 und ED1 der Anteil der ED1⁺- DCs dargestellt. Dabei konnte ein relativ starker tendenzieller Anstieg dieser DC-Population verzeichnet werden, der die größte Zellanzahl (Erhöhung um das vierfache des Ausgangswertes von Tag 0) 72 Stunden nach Antigenexposition aufwies. An Hand dieser Ergebnissen kann vermutet werden, dass, da mit ED1 vor allem unreife DCs angefärbt werden, eine Rekrutierung von unreifen DCs in die Lunge im Fall eines Antigenkontaktes stattfindet. Diese reifen dann durch die Aufnahme des Antigens heran und induzieren anschließend eine Immunantwort.

(47)

4.2 Diskussion der Ergebnisse einer induzierten Immunreaktion im Rattenmodell

Durch die Verabreichung von 2S-MALP-2 wird in der Lunge von Ratten eine starke Entzündung ausgelöst, wie Lührmann et al. zeigen konnten (57). In dieser Studie konnte darstellt werden, dass nach Verabreichung von 2S-MALP-2 in der broncho- alveolären Lavage (BAL) ein signifikanter Anstieg von T-Zellen, NK-Zellen (natural- killer - Zellen) und DC stattfand. Es wird vermutet, dass 2S-MALP-2 die Alveolarmakrophagen aktiviert. In einer anderen Arbeit konnte gezeigt werde, dass Makrophagen, ebenso wie neutrophile Granulozyten und epitheliale Zellen, bei Kontakt mit Antigenen Chemokine freisetzten und so einen Einstrom von spezifischen Immunzellen bewirken (58). Hier konnte auch gezeigt werden, dass ß- Defensin ein Chemokin ist, welches vor allem unreife DCs und memory-T-Zellen anlockt.

In einer weiteren Studie (68) wurde die Anzahl der Lymphozyten, Makrophagen und DC im Interstitium und in der BAL nach intratrachealer Gabe von 2S-MALP-2 untersucht. Dabei wurden zwei Arten der DC entdeckt, deren Anzahl sich in unterschiedlicher Weise veränderte. Beide Arten waren MHC-Klasse II positiv. Eine Art der DC nur gering Ox62⁺ (Ox62^low), die andere Art war stark Ox62⁺ (Ox62^high).

Die Anzahl der Ox62^lowerhöhte sich nach der 2S-MALP-2 Gabe 50fach in der BAL und 5fach im Lungeninterstitium. Die Anzahl der Ox62^high blieb sowohl in der BAL als auch im Lungeninterstitium konstant. In den abführenden Lymphknoten konnte wiederum eine Erhöhung beider DC-Populationen beobachtet werden, allerdings erhöhte sich die Anzahl der Ox62^high stärker als die der Ox62^low.

(48)

Die beiden DC-Populationen unterscheiden sich wahrscheinlich in ihrem Reifungsgrad: Schon ausgereifte DC reagieren stark positiv auf Ox6 und Ox62 und nur schwach auf ED1. Noch unreife DC reagieren dagegen stark auf ED1 und nur schwach auf Ox6 und Ox62.

Da in der oben erwähnten Studie (68) die maximalen Zellzahlen von Makrophagen, DC und Lymphozyten sowohl im bronchoalveolären Raum als auch im Lungeninterstitium an Tag 3 verzeichnet wurden, wurden auch in dieser Arbeit die Tracheen drei Tage nach 2S-MALP-2 Verabreichung untersucht.

Wir waren in dieser Arbeit von der Hypothese ausgegangen, dass die Immunsituation, welche in der Lunge vorherrscht, sich in der Schleimhaut der Trachea widerspiegeln würde. Dies konnte nicht bestätigt werden. Man würde eigentlich, orientiert man sich an den Ergebnissen der zitierten Studie (68), in der Trachea einen Anstieg der Ox62^low-DC-Population erwarten, die, da es sich um unreife DC handelt, zusätzlich stark ED1⁺ sein müsste. Während in der vorliegend Arbeit nach 2S-MALP-2 Gabe die Anzahl der Ox6⁺-Zellen gegenüber der Kontrolle tendenziell leicht anstieg, verringerte sich die Anzahl der ED1⁺-Zellen und der Ox62⁺- Zellen. Es kann also keine Aussage darüber getroffen werden, um welchen Reifungsgrad es sich bei den DC handelt. Es kann aber vermutet werde, dass die Trachea, entgegen der ursprünglichen Annahme, nicht die Immunsituation in der Lunge widerspiegelt, wodurch sich ein Widerspruch zu den meisten Daten in der bisher veröffentlichen Literatur ergibt.

4.2.2 Ein rekombinanter Wachstumsfaktor als Auslöser einer Immunreaktion In verschiedenen Arbeiten konnte nachgewiesen werde, dass der rekombinante Wachstumsfaktor Flt3L (Fms-like tyrosine kinase receptor-3 ligand) die Produktion