Membrankontakte von T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen in den sekundär lymphatischen Organen der Ratte
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Andrea Sahle
aus Münster/ Westf.
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. J. Westermann Univ.-Prof. Dr. R. Pabst
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H.- J. Hedrich 2. Gutachter: PD Dr. H.- J. Schuberth
Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2001
Diese Arbeit wurde mit der finanziellen Unterstützung des Graduierten Kollegs
„Charakterisierung von regulatorischen Peptiden und ihrer Zielproteine“ angefertigt.
M e i n e r M u t t e r u n d
m e i n e m S o n n e n s c h e i n Y a n a - M a r i e
Man sieht nur mit dem Herzen gut, das Wesentliche ist für die Augen unsichtbar.
Antoine de Saint-Exupery
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen... 7
I. Einleitung... 9
II. Literaturübersicht ... 11
1. Das Immunsystem... 11
2. Die lymphatischen Organe... 14
3. Aktivierungsstadien von T-Lymphozyten im Laufe einer Immunantwort ... 18
4. Die Migration von Lymphozyten... 21
5. Antigenpräsentation oder: die Kontrolle der Immunantwort... 24
III. Material und Methoden ... 31
1. Geräte und Laborbedarf... 31
2. Puffer, Medien und Materialien ... 32
3. Antikörper ... 35
4. Versuchstiere... 37
5. Gewinnung, Aufbereitung und Injektion von Subpopulationen der Lymphozyten ... 38
6. Darstellung der Membrankontakte auf immunhistologisch gefärbten Gewebeschnitten ... 40
7. Immunhistologisch gefärbte Gewebeschnitte in der konfokalen Mikroskopie... 45
8. Darstellung von Membrankontakten zwischen T-Lymphozyten und IDC im Mausmodell ... 46
9. Auswertung ... 48
10. Verwendete Computerprogramme und Statistik ... 50
IV. Ergebnisse ... 52
A. Untersuchung der Membrankontakte von T-Lymphozyten mit interdigitierenden dendritischen Zellen in den sekundär lymphatischen Organen der Ratte ... 52
1. Injizierte T-Lymphozyten und interdigitierende dendritische Zellen können auf immunhistologisch gefärbten Gewebeschnitten identifiziert werden. ... 52
2. In den sekundär lymphatischen Organen befinden sich 80% der injizierten T-
Lymphozyten in Membrankontakt mit interdigitierenden dendritischen Zellen. ... 55
3. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion der T-Lymphozyten lassen sich gleiche Anteile von Membrankontakten beobachten. ... 57
4. Endogene T-Lymphozyten zeigen über 60% Membrankontakte zu DC... 60
5. Membrankontakte zu IgD-positiven B-Lymphozyten befinden sich vorwiegend im äußeren Bereich der periarteriolären lymphatischen Begleitscheide der Milz ... 60
6. Membrankontakte von injizierten T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen lassen sich auch mit konfokaler Mikroskopie aufzeigen. ... 63
7. In der Maus werden interdigitierende dendritische Zellen über den spezifischen Marker DEC-205 nachgewiesen... 67
B. Effektor T-Lymphozyten in Zellzyklus und Proliferation ... 70
1. Ki-67+ T-Lymphozyten im Blut ... 70
2. BrdU+ T-Lymphozyten in der Milz... 72
3. Die Anteile der Ki-67+ und BrdU+ T-Lymphozyten sind erhöht zu finden, wenn Membrankontakte mit IDC in der Milz vorliegen... 72
V. Diskussion ... 80
1. Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und IDC stellen ein konstantes Phänomen dar. ... 80
2. Funktion von LFA-1 bei Membrankontakten im Mausmodell ... 88
3. Membrankontakte beeinflussen den Anteil der Ki-67+ und BrdU+ T-Lymphozyten. 88
VI. Zusammenfassung... 92
VII. Summary ... 95
VIII. Literaturverzeichnis ... 97
IX. Anhang ... 117
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Abb. Abbildung
AP Alkalische Phosphatase
APAAP Alkalische Phosphatase-Anti-Alkalische Phosphatase APC antigen presentating cell, Antigen-präsentierende Zelle
BrdU 5’-Brom 2’-Desoxyuridin
BSA bovines Serumalbumin
ca. circa
CD Cluster of Differentiation, Differenzierungskluster
CO2 Kohlendioxid
CSFE 5-,6-carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester
CTLA-4 cytotoxic T lymphocyte antigen-4, zytotoxisches T-Zellantigen-4
DC dendritic cell, dendritische Zelle
Dig Digoxigenin
d.h. das heißt
DMSO Dimethylsulfoxid
DNS Desoxyribonukleinsäure
etc. et cetera
FACS fluorescence activated cell sorter, fluoreszenzaktivierter Zellsortierer FCS fetal calf serum, fetales Kälberserum
GM-CSF Granulocyte/ Macrophage-colony-stimulating factor, Granulozyten/ Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor
h hora, Stunde
HEV high endothelial venule, hochendotheliale Venule
ICAM-1 intercellular adhesion molecule-1, interzelluläres Zelladhäsionsmolekül-1 IDC interdigitating dendritic cell, interdigitierende dendritische Zelle
Ig Immunglobulin
IL- 2 Interleukin-2
i.v. intravenös
Ko Kontrolle
LFA-1 Lymphocyte function-associated antigen-1, lymphozytenfunktionsassoziiertes Antigen-1
mAb monoclonal antibody, monoklonaler Antikörper MAdCAM-1 mucosal addressin-cell adhesion molecule-1,
mukosales Addressin-Zelladhäsionsmolekül-1
MCP macrophage chemotactic protein, Makrophagen chemotaktisches Protein M-CSF macrophage colony-stimulating factor,
Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor
Mib5 Molecular Institute of Borstel, Antikörper gegen nukleäres Antigen des Zellzyklus (in der Ratte während der G1-M2-Phase exprimiert)
Min Minute
MIP1-α macrophage inflammatory protein 1-alpha
MHC Major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex mLN mesenterial lymph node, mesenterialer Lymphknoten
MLR mixed lymphocyte reaction, gemischte Lymphozytenreaktion
MS Mäuseserum
NaCl Natriumchlorid
NK-Zelle Natürliche Killerzelle
PALS periarteriolar lymphatic sheath,
periarterioläre lymphatische Begleitscheide PAP Peroxidase-Anti-Peroxidase
PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung
PE Phycoerythrin
PFA Paraformaldehyd
pH negativer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
PP Peyersche Platten
RANTES regulated on activation, normally T cell expressed and secreted,
durch Aktivierung reguliertes, normalerweise von T-Zellen exprimiertes und sezerniertes Chemokin
RT Raumtemperatur
s. siehe
S. Seite
sec Sekunde
SPF spezifisch pathogenfrei
TH1/2 T-Helfer1/ 2
TDL thoracic duct lymphocytes, Lymphozyten aus dem Ductus thoracicus TNF-α tumor necrosis factor-alpha
TTBS Trisgepufferte Salzlösung mit Tween TCR T cell receptor, T-Zellrezeptor
VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1, vaskuläres Zelladhäsionsmolekül-1 VLA-4 very late antigen-4, sehr spätes Antigen-4
z.B. zum Beispiel
I. Einleitung
Das Immunsystem beschäftigt sich tagtäglich mit der Abwehr möglicher Pathogene. Im Laufe der Evolution haben sich dabei eine angeborene und eine erworbene Immunabwehr entwickelt, die ineinandergreifend effektiv den Organismus zu schützen imstande sind. T- Lymphozyten und B-Lymphozyten als Träger der erworbenen Immunabwehr erkennen über spezialisierte Rezeptoren Antigene. Um eine T-Zellabhängige Immunantwort auszulösen, benötigen T-Lymphozyten ihr spezifisches, in Peptide „zerlegtes“ (prozessiertes) Antigen, das mit dem Hauptgewebeverträglichkeitskomplex (MHC) zusammen präsentiert werden muss.
Da sich Immunantworten auch gegen das eigene Gewebe richten können (Autoimmunität), müssen sie reguliert werden (VAN PARIJS u. ABBAS, 1998). In verschiedenen Modellen konnte gezeigt werden, wie wichtig die Interaktion zwischen T-Lymphozyten, aber auch B- Lymphozyten mit dendritischen Zellen (DC) für die Auslösung von Immunantworten, die Induktion und das Aufrechterhalten von peripherer Toleranz (BANCHEREAU u.
STEINMAN, 1998) und das Überleben der Lymphozyten in den peripheren Geweben ist (BROCKER, 1997; INGULLI et al., 1997). In den sekundär lymphatischen Organen wird durch die spezialisierte Einteilung in Kompartimente das Zusammentreffen von Antigenen aus dem Blut oder den Geweben und der T-Lymphozyten und DC ermöglicht.
Interdigitierende dendritische Zellen (IDC) stellen DC eines reifen Phänotyps (Fähigkeit zur Auslösung primärer T-Zellabhängiger Immunantworten) dar, die sich in den T-Zellarealen der sekundär lymphatischen Organe befinden und mit ihrer charakteristischen Morphologie mit zahlreichen dendritischen Ausläufern ein dichtes Netzwerk ausbilden. Durch eine hohe Expression von MHC Klasse II und kostimulatorischen Molekülen lassen sich diese Zellen in den Geweben nachweisen (STEINMAN et al., 1997).
Obwohl der Interaktion zwischen T-Lymphozyten und DC verschiedene wichtige Funktionen bei der Einleitung und Regulierung von Immunantworten zugeschrieben wird, ist nicht bekannt, in welchem Ausmaß sich die Zellen in einem in vivo Modell in Kontakt zueinander befinden. Um diese Interaktion besser verstehen zu lernen, wurden in der vorliegenden Arbeit durch die Auswertung von Immunhistologien nach Injektion von T-Lymphozyten in einem kongenen Rattenmodell folgende Aspekte untersucht:
- Welcher Anteil von injizierten kongenen T-Lymphozyten befindet sich in Membrankontakt zu IDC in den T-Zellarealen der Milz, der mesenterialen Lymphknoten und der Peyerschen Platten?
- Haben die verschiedenen Aktivierungsstadien (naive, Effektor und „Gedächtnis“- T-Lymphozyten) der T-Lymphozyten einen Einfluss auf die Anzahl der Kontakte?
- Lassen sich die Membrankontakte mittels weitergehender Techniken (konfokaler Mikroskopie) nachweisen?
- Welchen Anteil von Membrankontakten zwischen T-Lymphozyten und dendritische Zellen lassen sich in der Maus mit einem spezifischen Marker für dendritische Zellen feststellen?
- Welchen Einfluss hat eine LFA-1-Defizienz der T-Lymphozyten auf die Membrankontakte?
- Welchen Einfluss haben immunhistologisch nachgewiesene Membrankontakte auf den Zellzyklus oder den Einbau von BrdU während der S-Phase des Zellzyklus für die T-Lymphozyten?
II. Literaturübersicht
1. Das Immunsystem
Jeder Organismus muss tagtäglich gegenüber einer Vielzahl von Mikroorganismen und anderen Substanzen geschützt werden. Im Laufe der Evolution haben sich verschiedene Mechanismen entwickelt, die der effektiven Abwehr dienen. Die Aufgabe des Immunsystems ist es, die Integrität des Körpers gegen das Eindringen dieser Fremdstoffe von außen zu gewährleisten. Diese Abwehrreaktionen des Organismus gegen Pathogene werden einerseits durch die unspezifische (angeborene) und durch die spezifische (erworbene) Abwehr vermittelt (JANEWAY et al., 1999). Diese komplexen Vorgänge werden hier allerdings nur vereinfacht dargestellt.
Die erste Verteidigungslinie gegen Infektionen ist die unspezifische Immunität, die direkt Effektorfunktionen zur Bekämpfung der Pathogene einleitet. Physikalisch-chemische Barrieren wie der natürliche Säuremantel der Haut und den Epithelien der Schleimhäute reduzieren ein Eindringen von fremden Substanzen bereits auf ein Minimum. Daneben haben Granulozyten und Makrophagen die Aufgabe, schnell alle eingedrungenen Erreger zu beseitigen. Makrophagen gehören zu einer Familie von langlebigen Zellen, die in fast allen Geweben verteilt sind und ein frühes Warnsystem gegenüber dem Eindringen exogener Agentien darstellen. Lösliche, zirkulierende Moleküle wie die Komplementfaktoren sind in der Lage, sich an Mikroorganismen anzuheften und zu einer verbesserten Erkennung und Phagozytose (Aufnahme von Fremdstoffen und Bakterien) zu führen (Opsonisierung) (GORDON, 1999). Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) nehmen eine Zwischenstufe zwischen der unspezifischen und spezifischen Immunität ein, da sie einerseits Virus-infizierte Zellen aufspüren und eliminieren können, obwohl ihnen andrerseits Antigen-spezifische Rezeptoren fehlen. Die Verteidigungsstrategien der unspezifischen Immunität laufen stets gleichartig ab und sind unabhängig von einem vorherigen Kontakt mit den Erregern. Wenn diese Abwehr durchbrochen wird, ist die spezifische Immunität gefordert, die sich mit der Höherentwicklung der Wirbeltiere etabliert hat und vorwiegend von T- und B-Lymphozyten vermittelt wird. Die Spezifität der Antigen-spezifischen Antwort ergibt sich aus dem
Repertoire von Antigenrezeptoren, die von den T- und B-Lymphozyten exprimiert werden.
Jeder individuelle T- oder B-Lymphozyt trägt Antigenrezeptoren auf seiner Zelloberfläche, die in einzigartiger Weise fähig sind, spezifische Strukturdeterminanten (Epitope) oder Antigen zu erkennen. Die Verschiedenheit (Diversität) der Antigenrezeptoren wird durch eine kombinatorische Neuordnung einer Varietät von Immunglobulin- oder T-Zellrezeptor- Gensegmenten und somatischer Mutation gewährleistet. Dieses breit angelegte Immunrepertoire erlaubt der Lymphozytenpopulation, auf jedes virtuelle, potentiell pathogene Agens reagieren zu können.
Die selektive Vermehrung eines Lymphozytenklons, die durch ein Antigen hervorgerufen wird, ermöglicht es dem Immunsystem, die Immunantwort an häufig vorkommende Pathogene anzupassen und ein immunologisches Gedächtnis zu entwickeln. Durch eine erhöhte Frequenz von Antigen-spezifischen Lymphozyten und eine erhöhte Sensibilität gegenüber dem Antigen können die sogenannten „memory“ Lymphozyten bei erneutem Eindringen des Antigens schneller reagieren. Zusätzlich werden durch die spezifische Immunabwehr auch die Schutzmechanismen der unspezifischen Abwehr verstärkt, indem z.B.
durch Botenstoffe (Zytokine, Chemokine) Phagozyten an den Ort der Entzündung gelockt werden können, die bei der Eliminierung der Fremdstoffe unterstützend wirken (HALE u.
HAYNES, 1999).
B-Lymphozyten sind die Vorläufer von Antikörper-sezernierenden Plasmazellen, die eine humorale Immunität vermitteln. Antikörper haften an eingedrungenen Antigenen, aktivieren das Komplementsystem und führen zur verbesserten Aufnahme durch Makrophagen.
Besonders Bakterien und deren Toxine, die sich im extrazellulären Raum befinden, werden durch diesen Mechanismus eliminiert. T-Lymphozyten vermitteln hingegen die Antigen-spezifische zelluläre Immunität und regulieren gleichzeitig auch die Funktion der B-Lymphozyten und Makrophagen durch zelluläre Interaktionen und die Produktion von Zytokinen. Die Wichtigkeit der T- und B-Lymphozyten zur allgemeinen Funktion des Immunsystems wird durch die Vielzahl der infektiösen Erkrankungen reflektiert, die bei einer verminderten Anzahl oder dem Fehlen dieser Zellen eintreten (z.B. kongenitale Immundefizienz, Infektion mit dem humanen Immundefizienz Virus, HIV) (HALE u.
HAYNES, 1999; JANEWAY et al., 1999).
Der T-Zellrezeptor erkennt keine strukturellen Determinanten oder Epitope in ihrer nativen Form. Stattdessen erkennen T-Lymphozyten proteolytisch zerteilte Peptidfragmente des Antigens, die an den polymorphen Anteil der Moleküle des Hauptgewebeverträglichkeitskomplexes (major histocompatibility complex, MHC) auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle gebunden sind. Der Prozess, durch den Antigene in Peptide abgebaut und an die MHC-Moleküle gebunden werden, wird als Antigenprozessierung bezeichnet. Dabei existieren spezialisierte Abbauwege für Antigene, die aus dem extra- oder intrazellulären Raum stammen. Extrazelluläre Antigene wie Bakterien und Viren werden durch Antigen-präsentierende Zellen aufgenommen, nach ihrem Abbau an Moleküle des MHC Klasse II gebunden, auf der Oberfläche exprimiert und von CD4+ T-Lymphozyten erkannt. CD4+ T-Lymphozyten werden auch als T-Helferzellen bezeichnet, da sie durch direkte Zellinteraktionen und die Ausschüttung von Zytokinen Makrophagen und B-Lymphozyten aktivieren können. Antigene innerhalb der Zellen, wie sie nach Infektion durch Viren, obligaten intrazellulären Pathogenen oder Tumorantigenen entstehen, werden nach proteolytischem Abbau in Zusammenhang mit Molekülen des MHC Klasse I präsentiert und von CD8+ T-Lymphozyten erkannt. CD8+ T-Lymphozyten werden auch zytotoxische T-Lymphozyten genannt, da sie eine immunvermittelte Zerstörung von Virus-infizierten Zellen oder Tumorzellen einleiten.
Der prädominante Ort der Sensibilisierung von Lymphozyten gegenüber neuem Antigen sind die sekundär lymphatischen Organe, in denen die T-Lymphozyten und Antigen- präsentierenden Zellen, wie z.B. dendritische Zellen, in einem besonderen Mikromilieu kolokalisiert sind (GUNN et al., 1999). In den lymphatischen Organen werden den Lymphozyten Antigene aus dem Blut und den peripheren Geweben präsentiert und damit die Wahrscheinlichkeit des Zusammentreffens eines spezifischen Lymphozyten mit seinem Antigen erhöht. Dendritische Zellen (DC) nehmen dabei in den peripheren Geweben Antigen auf, zerteilen es in kleine Peptide, wandern in die lymphatischen Organe und präsentieren es dort zusammen mit dem MHC-Komplex auf ihrer Oberfläche. Durch zahlreiche Oberflächenmoleküle (kostimulatorische oder akzessorische Moleküle) können sie T- Lymphozyten optimal stimulieren und Immunantworten einleiten. Die Schlüsselrolle für die Kontrolle der Immunantwort durch die DC liegt hierbei im Wechsel des Phänotyps: von der
effektiven Antigenaufnahme (unreifer Phänotyp) zur effektiven Antigen-Präsentation (reifer Phänotyp) (BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998).
Um die Regulation und die Einleitung von Immunantworten besser nachvollziehen zu können, werden im folgenden Abschnitt der Aufbau und die Funktion der lymphatischen Organe erläutert.
2. Die lymphatischen Organe
Lymphozyten stammen von lymphoiden Vorläuferzellen ab, die sich frühzeitig aus hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark entwickeln. Das Knochenmark dient der Vermehrung der Lymphozyten, im Thymus wird die Entscheidung über die weitere Entwicklung der T-Lymphozyten getroffen. Im Gegensatz zum Knochenmark und dem Thymus, die als primäre oder zentrale lymphatische Organe gelten, werden die Milz, die Lymphknoten und Darm-, Mukosa- oder Bronchus-assoziierte lymphatische Gewebe (GALT, respektive MALT und BALT), zu denen auch die Peyerschen Platten zählen, als sekundär oder peripher lymphatische Organe bezeichnet. Bei lymphatischen Organen handelt es sich um organisierte Gewebe, in denen die Lymphozyten Interaktionen mit nicht-lymphatischen Zellen eingehen, die zur Einleitung einer adaptiven Immunantwort führen können.
2.1 Die Milz
Die Milz ist ein beim Menschen etwa faustgroßes, bei der Ratte ein circa 3 cm langes, kompaktes Organ, das als Blutfilter fungiert. Das Parenchym der Milz besteht aus zwei Kompartimenten: die rote und die weiße Pulpa. In der roten Pulpa werden alternde Erythrozyten phagozytiert, die durch die enge Passage der Milzgefäße nicht wieder in die Blutbahn gelangen können, und zur Wiederverwertung in ihre Bestandteile zerlegt. Die weiße Pulpa repräsentiert den Teil des Organs mit der höchsten Dichte an Lymphozyten und umfasst drei Unterkompartimente: die periarterioläre lymphatische Begleitscheide, kurz PALS genannt (T-Zellareal), die Follikel (B-Zellareal) und die Marginalzone. Die PALS ist konzentrisch um
die Zentralarteriolen, die durch die gesamte Milz ziehen, gelagert. Sie beinhaltet vorwiegend T-Lymphozyten und dendritische Zellen, die hier aufgrund ihrer Morphologie mit zahlreichen Ausläufern interdigitierende dendritische Zellen genannt werden (STEINMAN et al., 1997).
B-Lymphozyten befinden sich nur zu einem geringen Anteil in der PALS und sind dann bevorzugt im äußeren Anteil (äußere PALS) anzutreffen. An diesem Übergang zwischen T- und B-Zellareal finden Antigen-spezifische Interaktionen zwischen T-Lymphozyten und wandernden B-Lymphozyten während primärer und sekundärer Immunantworten statt.
Antigen-spezifische B-Lymphozyten wandern aus der Marginalzone in die angrenzende äußere PALS. Durch eine gegenläufige Wanderung wird das Zusammentreffen von Antigen-spezifischen T- und B-Lymphozyten optimiert. B-Lymphozyten können so die notwendige T-Zellhilfe erhalten und sich in der Marginalzone zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen entwickeln (VAN ROOIJEN, 1990). Die angrenzenden Follikeln beinhalten vorwiegend B-Lymphozyten und nur wenige CD4+ T-Lymphozyten. Follikuläre dendritische Zellen, die vermutlich nicht von Vorläufern aus dem Knochenmark stammen, halten auf ihrer Oberfläche Antigen in nativer Form als Immunkomplex zurück und präsentieren es B-Lymphozyten in den Keimzentren (STEINMAN et al., 1997). Die Marginalzone umgibt PALS und Follikel und bildet ein breites, gut demarkiertes Band zwischen weißer und roter Pulpa. In dieser Zone befinden sich vorwiegend eine Population von memory B- Lymphozyten, die durch eine sofortige Antikörperantwort auf Polysaccharidkomponenten aus Bakterienkapseln einen Schutz vor Sepsis bieten (STEINIGER u. BARTH, 2000).
2.2 Lymphknoten
Lymphknoten sind in die Lymphbahnen eingeschaltete Filterstationen, die in ihrer Größe und ihrer Anzahl im Körper variieren können. In den meisten Geweben befinden sich lymphatische Gefäße, die als afferente Lymphbahnen die Lymphknoten speisen. Lymphknoten bestehen aus einer Bindegewebskapsel, von der aus Trabekel in das Innere einstrahlen und den Lymphknoten segmentieren. Von außen wird die Kapsel von den Vasae afferentiae, den zuleitenden Lymphgefäßen, unterbrochen, von denen aus die Lymphe unter der Kapsel weiter über die Intermediärsinus in den Marksinus und abschließend in die Vasae efferentiae weitergeleitet wird. Der Lymphknoten wirkt hierbei als Filter sowohl für inerte Partikel (z.B.
Farbpartikel nach Tätowierungen) als auch für Bakterien oder Zellreste, die von den Fress- und Immunzellen aufgenommen werden. Im Lymphknoten werden 3 Kompartimente unterschieden: der Kortex, der Parakortex und die Medulla. Im Kortex sind die Lymphozyten in primäre und sekundäre Follikel mit Keimzentren angeordnet, die in der Hauptsache von B- Lymphozyten und wenigen CD4+ T-Helferzellen besiedelt sind. Der Parakortex besteht vorwiegend aus T-Lymphozyten und dendritischen Zellen. Eine Besonderheit des Parakortex ist das Vorkommen von hochspezialisierten, postkapillären Venulen mit einem kubischen Epithel (hochendotheliale Venulen, HEV), die es den Lymphozyten in hoher Anzahl ermöglichen, aus dem Blut in die Lymphknoten einzuwandern. (PABST, 1994).
2.3 Peyersche Platten
Die Schleimhäute des Verdauungstraktes besitzen eine besonders große Oberfläche und ein dünnes Epithel zur effektiven Resorption von Nährstoffen. Beides ermöglicht es aber auch Pathogenen wie Bakterien oder Viren die Schleimhautbarriere zu überwinden, in das Gewebe einzudringen und es zu schädigen. Das Darm-assoziierte, lymphatische Gewebe vermindert das Eindringen und die Vermehrung der Mikroorganismen. Es setzt sich aus vielen vereinzelt (solitär) gelegenen Follikeln und aus Follikeln mit spezialisiertem Epithel, den Peyerschen Platten, auch „Plaques“ genannt, zusammen. Letztere sind im Bereich des gesamten Dünndarmes anzutreffen und zeichnen sich dadurch aus, dass sie keine afferenten Lymphgefäße besitzen. Zum Darmlumen hin sind sie mit einem spezialisierten Epithel bedeckt, das den Antigenkontakt und die -aufnahme ermöglicht. In der Histologie sind auch hierbei deutlich abgrenzbare Kompartimente zu erkennen: bei den Follikeln handelt es sich ausschließlich um Sekundärfollikel mit aktiven Keimzentren und einem Randwall aus kleineren Lymphozyten. In der zwischen den Follikeln gelegenen Interfollikulärregion befinden sich in der Hauptsache dicht gepackt liegende T-Lymphozyten, DC und HEVs. Zum Darmlumen hin kommt es zu einer kappenartigen Ansammlung von T- und B-Lymphozyten, die Dom-Epithel genannt wird. Aufgrund seiner Funktion zeichnet sich das Epithel dort mit einigen Besonderheiten aus: es hat weder Krypten noch Zotten, kaum oder keine Becherzellen und ist somit nicht von einer Schleimschicht geschützt, trägt keine IgA-Rezeptoren und zwischen den Epithelzellen finden sich Zellen, die zum Lumen hin eine membranförmige
Faltung haben und aufgrund ihrer Form M-Zellen („membranous cells“) genannt werden.
Durch Transzytose sind diese Zellen in der Lage, große Moleküle, Bakterien und Viren aufzunehmen und mit den räumlich nahe gelegenen Immunzellen in Kontakt zu bringen (PABST, 1994; GEBERT, 1997; BEIER u. GEBERT, 1998).
2.4. Morpholgie der sekundär lymphatischen Organe in LFA-1-defizienten Mäusen
LFA-1 (CD11a-/-/CD18) aus der β2- Integrinrezeptorfamilie wird vor allem auf Leukozyten exprimiert und nimmt eine Schlüsselrolle in der Funktion, wie z. B. bei der Adhäsion dieser Zellen an andere Zellen oder das Epithel, ein. LFA-1 setzt sich aus zwei Ketten zusammen, die auf unterschiedlichen Genen kodiert werden: Integrin alpha L (CD11a, Ly 15, Ly 29) wird auf dem Chromosom 7 kodiert, Integrin beta 2 auf Chromosom 10 (CD18). Die Produkte beider Gene formen das funktionelle LFA-1. Wird die Expression eines der beiden Produkte unterdrückt wie im vorliegenden Fall die Expression von CD11a, so liegt eine Defizienz des LFA-1-Moleküls vor. Im Vergleich zu Wildtypmäusen, die eine normale Expression des LFA- 1-Moleküls auf der Oberfläche der Zellen aufweisen, konnte bei LFA-1-defizienten Mäusen eine Vergrößerung der Milz bei männlichen Tieren um das 1,7 fache, bei weiblichen Tieren um das 1,2 fache festgestellt werden. Die peripheren Lymphknoten hingegen sind um etwa 30% kleiner als bei Wildtypmäusen, wohingegen weder die mesenterialen Lymphknoten, noch weitere Lymphknoten diese Veränderung aufwiesen. Bei der Analyse der T- und B- Lymphozyten konnte ein deutlicher Verlust von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten in den peripheren Lymphknoten nachgewiesen werden, in der Milz hingegen fanden sich signifikant mehr T-Lymphozyten. Diese LFA-1-Defizienz resultierte in einer Reduktion der Einwanderung von T-Lymphozyten in die peripheren Lymphknoten und in die Peyerschen Platten auf etwa 30% (BERLIN-RUFENACH et al., 1999).
In den sekundär lymphatischen Organen werden die Funktionen der spezifischen Immunabwehr eingeleitet. Nach Antigenkontakt durchlaufen die Lymphozyten verschiedene Phasen der Reifung und werden in naive, Effektor und memory T-Lymphozyten eingeteilt, die im folgenden näher erläutert werden.
3. Aktivierungsstadien von T-Lymphozyten im Laufe einer Immunantwort
3.1. Naive T-Lymphozyten
Nach ihrer Entstehung im Knochenmark wandern Prä-T-Lymphozyten in den Thymus ein.
Das T-Zellrepertoire muss weitgehend tolerant gegenüber körpereigenen Strukturen und Proteinen sein. Um diese „zentrale Toleranz“ zu gewährleisten, werden während der Entwicklung im Thymus körpereigene Proteine auf MHC-Molekülen von dendritischen Zellen präsentiert. Zum einen werden Thymozyten darauf getestet, ob sie den Hauptgewebeverträglichkeitskomplex (major histocompatibility complex, MHC) auf den körpereigenen Zellen erkennen (positive Selektion), zum anderen, ob sie eine verstärkte Affinität auf körpereigenes Protein zeigen (negative Selektion). Etwa 95% der T- Lymphozyten überstehen diesen Prozess nicht und sterben im Thymus (SPRENT et al., 1996).
Nach ihrer Differenzierung im Thymus tragen naive T-Lymphozyten auf ihrer Oberfläche bestimmte Moleküle, die dem Anheften an bestimmten Oberflächen (Adhäsion) oder der Bindung von Proteinen aus der Zirkulation oder auf anderen Zellen (Rezeptoren) dienen. Zu diesen Molekülen werden der T-Zellrezeptor, CD28 und CD4 oder CD8 gezählt, die sich auch bei einer Aktivierung des Lymphozyten nur wenig in ihrer Expression verändern. Andere Moleküle wie CD45RC und L-Selektin werden nach einem spezifischen Antigenkontakt weniger oder nicht mehr exprimiert (BODE, 1998). Diese Moleküle werden auch zur Unterscheidung des Aktivierungszustandes herangezogen. Diese T-Lymphozyten, die den Thymus verlassen haben, aber noch nicht mit ihrem spezifischen Antigen in Kontakt gekommen sind, werden auch als naive T-Lymphozyten bezeichnet, deren Lebensspanne in der Maus etwa 6 Monate beträgt (DI ROSA et al., 1999).
3.2. Aktivierung und Effektorphase
Durch den T-Zellrezeptor (TCR) erkennen und binden T-Lymphozyten Peptide in Zusammenhang mit MHC-Molekülen. Die Antigen-abhängige Stimulation des TCR resultiert in einer komplexen Kaskade von biochemischen Signalereignissen, die drei mögliche Folgen hat: Proliferation und klonale Expansion, Apoptose oder Anergie. Einige Ergebnisse lassen vermuten, dass in Abhängigkeit des gebundenen Liganden, der Zeit oder anderen Eigenschaften der physikalischen Bindung eine qualitativ und quantitativ unterschiedliche Antwort hervorgerufen wird (LORD et al., 1999). Die Avidität der TCR-Bindung wird durch die Moleküle CD4 oder CD8 verstärkt und es kommt zu einer Stabilisierung des Kontaktes und einer Veränderung des Schwellenwertes durch ein direktes Signal oder Induktion der IL- 2-Transkription. Die Bindung weiterer kostimulatorischer Moleküle wie beispielsweise B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) oder des interzellulären Zelladhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1, CD54) auf der Zelloberfläche wird benötigt, damit T-Lymphozyten proliferieren können (HALE u.
HAYNES, 1999). B7 wird dabei eine zentrale Rolle in der Regulation der Proliferation zugeschrieben. Einerseits führt es zum Überleben der Zellen (DEETHS u. MESCHER, 1999), andrerseits kommt es durch die Bindung an das zytotoxische T-Zellantigen-4 (cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4) zu einer Hemmung der Proliferation (CHAMBERS, 2001).
Aber auch durch die Neuanordnung von weit über die Oberfläche herausragenden Molekülen wie CD45 und CD43 (Sialophorin, 45nm), durch die eine Interaktion des kleinen TCR (15nm) mit dem MHC ermöglicht wird, kann die Aktivierung beeinflussen (SHAW u. DUSTIN, 1997). Integrine, u.a. LFA-1, werden dabei für den initialen Zell-Zell-Kontakt und kostimulatorische Moleküle (CD28) zur Ausbildung eines stabilen Kontaktes benötigt. Eine Bindung des TCR an den MHC-Peptid-Komplex ohne die gleichzeitige Bindung der kostimulatorischen Moleküle führt zu Anergie oder „unresponsiveness“ des T-Lymphozyten, d.h. die Zelle ist zwar weiterhin überlebensfähig, aber reagiert nicht weiter auf sein spezifisches Antigen.
Eine vollständige Aktivierung führt zur Differenzierung der Zelle. Die Funktion der Zelle wechselt vom Erkennen des Antigens zum Eliminieren der Mikroorganismen (ABBAS et al., 1994). Bereits innerhalb von Sekunden nach der Bindung des TCR kommt es zur Auslösung der Signalkaskade. Biochemische Veränderungen, die mit der Aktivierung des TCR
einhergehen, dauern über mehrere Stunden und bieten die Möglichkeiten der Beeinflussung durch zusätzliche regulative Wege. Nach der TCR-Aktivierung werden innerhalb von etwa 2h Zytokine sezerniert, zur DNS-Replikation kommt es nach 24h, eine Zellteilung erfolgt nach 48h, die Differenzierung in Effektorzellen benötigt einige Tage (HALE u. HAYNES, 1999).
Bei den Effektor T-Lymphozyten handelt es sich um große, blastoide Zellen, die eine hohe Synthese von DNS zeigen. Es kommt zu einem Wechsel des auf der Oberfläche getragenen Molekülmusters, die zum einen die Zytokinrezeptoren betreffen und zum anderen die Adhäsionsmoleküle, die für das Anheften der Zellen am Endothel entscheidend sind (SPRINGER, 1994). Durch die Interaktion mit dendritischen Zellen differenzieren sich CD4+ T-Lymphozyten in zwei Klassen T-Helferzellen: TH1-Lymphozyten, die bevorzugt Interferon-γ (IFN-γ) exprimieren, welches bei Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle spielt, und die sich durch Hyperaktivierung von Makrophagen bei der Abwehr von intrazellulären Pathogenen beteiligen. TH2-Lymphozyten sezernieren IL-4, Il-5, IL-6 und IL-10 (MOSMANN et al., 1991) und aktivieren B-Lymphozyten zur Produktion und Sekretion von spezifischen Antikörpern (DEFRANCO, 1988). In Abhängigkeit des Zytokins kommt es bei den B-Lymphozyten zur Synthese von verschiedenen Antikörperklassen (SWAIN et al., 1996). Der Mechanismus der Differenzierung der T-Helferzellen ist nicht vollständig geklärt.
Es wird jedoch vermutet, dass DC nicht nur die Signale zur klonalen Expansion der Helferzellen geben, sondern selektive Signale von unterschiedlichen funktionellen Subpopulationen von DC zur Differenzierung der T-Helferzellen führen (BOTTOMLY, 1999;
RISSOAN et al., 1999). CD8+ T-Lymphozyten differenzieren sich in zytotoxische Zellen, die durch infizierte Zellen angreifen und in die Apoptose treiben können (JANEWAY et al., 1999).
3.3 Memory T-Lymphozyten
Die von den differenzierten Zellen sezernierten Zytokine können sich auf den gesamten Körper schädlich auswirken. Aus diesem Grunde muss nach einer erfolgreichen Eliminierung des Antigens die Immunantwort streng reguliert werden und die potentiell gefährlichen Zellen beseitigt werden (VAN PARIJS u. ABBAS, 1998). Ein Hauptteil der Effektor T-
Lymphozyten, etwa 70%, wird dabei durch einen induzierten Zelltod, die Apoptose, unschädlich gemacht (SMITH et al., 1980; BINNS et al., 1992; BOISE et al., 1995). Dabei wird das auf der Oberfläche von Effektor T-Lymphozyten getragene Molekül Fas (CD95) von seinem Liganden (Fas-L, CD95L) auf den dendritischen Zellen oder den Makrophagen aktiviert und führt über eine Signalkaskade zum Abbau der DNS in den T-Lymphozyten (NAGATA, 1997). Nach Abklingen einer Immunantwort überleben einige Antigen- spezifische T-Lymphozyten und bilden das immunologische Gedächtnis („memory“).
Memory T-Lymphozyten werden in der Ratte durch den phänotypischen Verlust des Markers CD45RC und in der Maus über die Kombination der Marker CD45low, L-Selektinlow und CD44high identifiziert (TIETZ u. HAMANN, 1997). Sie kommen in höherer Frequenz als naive T-Lymphozyten vor und haben eine längere Lebensdauer als diese. Bei einem sekundären Kontakt zum spezifischen Antigen läuft die Immunabwehr schneller ab. Um sowohl eine möglichst breite Reihe an Antigenen erkennen zu können, aber auch gleichzeitig eine effektive Immunantwort auslösen zu können, bedarf es eines Gleichgewichtes zwischen dem naiven und dem memory T-Zellpool. Die Aufrechterhaltung des T-Zellpools ist ein aktiver Prozess, der eine kontinuierliche Bindung des TCR durch MHC auf z.B. dendritischen Zellen erfordert. Diese Interaktion scheint über die Expression von Bcl-2 das Überleben der T-Lymphozyten vermitteln zu können (TANCHOT u. ROCHA, 1998).
4. Die Migration von Lymphozyten
Eine charakteristische und zum Auffinden des spezifischen Antigens wichtige Eigenschaft von Lymphozyten ist ihre Fähigkeit, in nahezu alle Organe und Gewebe ein- und auswandern zu können („Migration“). Die Rezirkulation von Lymphozyten ist ausschlaggebend für die Interaktion zwischen T-Lymphozyten und den dendritischen Zellen zur kontinuierlichen Präsentation des gesamten Antigenrepertoires im Körper und damit zur Einleitung von Immunantworten (WESTERMANN u. PABST, 1990). Dabei herrscht ein reger Verkehr zwischen dem Blut, den Geweben und der Lymphe. Etwa 5 x 1011 Lymphozyten wandern beim Menschen jeden Tag aus dem Blut aus und wieder zurück. Das Blut enthält nur 2% der
gesamten Lymphozyten, die sich im Durchschnitt nur etwa 30 Min dort aufhalten. Die meisten Lymphozyten wandern in Organe wie die Lunge, Milz, Leber, Knochenmark und nur ein geringerer Anteil, unter physiologischen Bedingungen, auch in die Haut, die Synovia, die Muskulatur oder das Gehirn. Durch Entzündungsgeschehen oder chronische Erkrankungen kann sich diese Situation aber deutlich verändern (WESTERMANN et al., 1988;
WESTERMANN u. PABST, 1996).
Ein Antigen, das die angeborene Immunabwehr durchbrochen hat, wird von dendritischen Zellen aufgenommen und zu den lymphatischen Organen transportiert, wo optimale Bedingungen für die Antigenerkennung herrschen (MONDINO et al., 1996). Ein Großteil der naiven T-Lymphozyten gelangt über Adhäsionsmoleküle wie L-Selektin über die hochendothelialen Venulen (HEV) in die sekundär lymphatischen Organe und durchwandert das Gewebe. Findet in dieser Zeit keine Antigenerkennung statt, so wandern die naiven T- Lymphozyten über die efferente Lymphe (SMITH u. FORD, 1983) aus und gelangen wieder in die Zirkulation (GIRARD u. SPRINGER, 1995). Die Anheftung an das Epithel und die anschließende Einwanderung in das Gewebe umfasst dabei mehrere Schritte und wird durch die Interaktion der Adhäsionsmoleküle auf den T-Lymphozyten und den spezifischen Rezeptoren auf den Endothelzellen vermittelt. Dabei werden in der Literatur immer wieder sogenannte „Homingrezeptoren“ diskutiert, die für den Eintritt der Lymphozyten in bestimmte Gewebe verantwortlich sein sollen, wie z.B. L-Selektin für den Eintritt in periphere Lymphknoten (GALLATIN et al., 1983), α4β7-Integrin für den Eintritt in die Peyerschen Platten (HAMANN et al., 1994). In LFA-1-defizienten Mäusen konnte gezeigt werden, dass die Migration von T-Lymphozyten in die peripheren Lymphknoten zwar bis auf 30% des Wertes bei Wildtypmäusen abfällt, jedoch andere α4-Integrine wie α4β7 oder α4β1 das Fehlen eines funktionellen LFA-1-Moleküls teilweise kompensieren können (BERLIN-RUFENACH et al., 1999). Für die Milz konnte kein spezifisches Molekül identifiziert werden. Zusätzlich zu den lymphatischen Geweben wandern naive T-Lymphozyten auch in die Leber (LUETTIG et al., 1999) und die Lunge ein.
Findet bei der Durchwanderung z.B. des Lymphknotens eine Antigenerkennung statt, so stellt die Bindung des TCR ein Stopsignal für den T-Lymphozyten da und führt zur Beendigung der Migration (DUSTIN et al., 1997). Dieses Phänomen wird als ein Mechanismus angesehen, um
Antigen-spezifische Lymphozyten im drainierenden Lymphknoten anzureichern. Dabei ist die Bindung des membrangebundenen LFA-1 mit seinen Liganden ICAM-1, -2 oder –3 auf den T-Lymphozyten ein früher und essentieller Schritt in der Zellaktivierung. LFA-1 gehört zur Familie der β2-Integrine und vermittelt eine Antigen-unabhängige Bindung der T- Lymphozyten mit dendritischen Zellen, aber auch mit dem Endothel von Gefäßen (SPRINGER, 1990). Durch die Rezeptor-Ligandenpaare LFA-1/ ICAM, ICAM/ LFA-1, CD2/ LFA-3 und CD28/ CD80 wird eine transiente Adhäsion zwischen CD4+ T-Lymphozyten und DC vermittelt, wie durch monoklonale Antikörper nachgewiesen werden konnte (HAUSS et al., 1995).
Die Interaktion mit der DC erfordert mehrere Stunden zur Initiierung der Zytokinproduktion, zum Eintritt in den Zellzyklus und zur Differenzierung. Einige dieser Effektor T- Lymphozyten wandern vom Parakortex in die Follikel ein und initiieren dort eine B- Zellantwort, die zur Ausbildung von Keimzentren führt (FULLER et al., 1993). Andere T- Lymphozyten verlassen auch über die efferente Lymphe den Lymphknoten auf dem Weg in das Blut (AGER, 1994).
Mit der Aktivierung der T-Lymphozyten sind phänotypische Veränderungen der Zellen verbunden, die u.a. zu einer Funktionsänderung, aber auch zu einem veränderten Wanderungsverhalten führen. Auf aktivierten T-Lymphozyten werden Adhäsionsmoleküle wie LFA-1, VLA-1 und CD2 verstärkt exprimiert, von denen angenommen wird, dass sie eine erhöhte Interaktion mit dem Endothel bewirken. Dadurch könnte eine verbesserte Einwanderung in nicht-lymphatische Gewebe und eine erhöhte Kapazität in entzündete Gewebe einwandern zu können, erklärt werden (SPRENT, 1994). Entgegen der Annahme, dass über diesen Mechanismus Antigen-spezifische T-Lymphozyten so an den Ursprung der Entzündung wandern (DUNON et al., 1996), konnte gezeigt werden, dass Effektor T- Lymphozyten in alle Gewebe einwandern, aber nur in ihrem Herkunftsmilieu bevorzugt proliferieren und vermindert der Apoptose anheim fallen (BODE et al., 1999). Effektor T- Lymphozyten finden sich vorwiegend in nicht-lymphatischen Geweben wie Lunge, Leber und Darm wieder (HAMANN u. REBSTOCK, 1993; LUETTIG et al., 1999). Es konnten aber auch Effektor T-Lymphozyten im Lymphknoten und in den Peyerschen Platten nachgewiesen
werden (BODE et al., 1999), obwohl auf vielen Effektor T-Lymphozyten kein oder nur geringe Mengen L-Selektin exprimiert wird (DAILEY et al., 1985), das für den Eintritt über HEV in Lymphknoten verantwortlich gemacht wird.
T-Lymphozyten, die nach der Aktivierung und Differenzierung entstehen und eine Immunantwort überleben, werden als „memory“ Lymphozyten bezeichnet. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass sowohl naive wie auch memory T-Lymphozyten in der Lage sind, über HEV in lymphatische Gewebe einzuwandern. Beide Subpopulationen wandern ebenfalls in B- Zellareale und Keimzentren ein. Dabei wandern T-Lymphozyten vom memory-Phänotyp schneller durch die T-Zellareale und lassen sich deshalb in geringer Anzahl im Gewebe auffinden (WESTERMANN et al., 1997). Für andere Spezies wie der Maus wird beschrieben, dass sich memory T-Lymphozyten, wie auch Effektor T-Lymphozyten, vorwiegend in Leber und Lunge ansammeln, aber nicht von der Migration in lymphatische Gewebe ausgeschlossen sind (TIETZ u. HAMANN, 1997).
5. Antigenpräsentation oder: die Kontrolle der Immunantwort
T- und B-Lymphozyten sind zwar die Botschafter der Immunabwehr, aber ihre Funktion steht unter der Kontrolle der DC, die zu den effektivsten Antigen-präsentierenden Zellen zählen (BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998). B-Lymphozyten als Vorläufer der Antikörper sezernierenden Plasmazellen können über ihren B-Zellrezeptor natives Antigen direkt erkennen. Zur Auslösung einer T-Zellabhängigen Immunantwort benötigt der T-Lymphozyt sein spezifisches Antigen in einer prozessierten und präsentierten Form in einem MHC- Peptid-Komplex und kostimulatorischen Molekülen wie CD28 und LFA-1. Dabei müssen die CD8+ T-Lymphozyten Fremdpeptide auf der Oberfläche von infizierten Körperzellen finden, die sich überall im Körper befinden können. Die Menge spezifischen MHC-Peptid-Komplexe auf infizierten und Tumorzellen ist gering (100 oder weniger pro Zelle), es fehlen meistens kostimulatorische Moleküle und die Zellen müssen von seltenen T-Zellklonen (1: 100.000 oder weniger) erkannt werden, die T-Zellrezeptoren mit niedriger Affinität besitzen (BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998). DC haben alle phänotypischen und funktionellen
Eigenschaften, die zur effizienten Einleitung einer zellulären Immunantwort nötig sind: in den meisten Geweben vertreten, binden sie in der Peripherie Antigen, prozessieren es und präsentieren es in einem MHC-Peptid-Komplex in Zusammenhang mit kostimulatorischen Molekülen wie ICAM-1 und der B-7-Familie. Im Gegensatz zu Makrophagen liegt ihre Aufgabe jedoch nicht in der Beseitigung der eingedrungenen Pathogene, sondern in der Alarmierung des Immunsystems (STEINMAN u. BHARDWAJ, 1999).
Dendritische Zellen sind unverwechselbare Antigen-präsentierende Zellen (APC), die drei Hauptfunktionen haben: 1. DC sind überaus potente APC. In vitro und in vivo sind nur einige DC notwendig, um eine starke T-Zellantwort einzuleiten. DC induzieren eine sogenannte gemischte Leukozytenreaktion (mixed leucocyte reaction, MLR), wobei nur eine DC notwendig ist, um 100-3000 T-Lymphozyten zu stimulieren. DC aktivieren T-Lymphozyten nicht nur gegenüber körperfremden MHC-Molekülen, sondern auch gegenüber einer Reihe von Fremdproteinen und mikrobiellen Proteine wie Superantigenen, die ohne Prozessierung direkt an die MHC-Moleküle binden (BHARDWAJ et al., 1993), oder den
„Standardproteinen“, die eine Prozessierung erfordern einschließlich Entzündungsprodukten (INABA et al., 1993) und Tumorantigenen (MAYORDOMO et al., 1995; ZITVOGEL et al., 1996). 2. DC induzieren als einzige Zellen primäre T-Zellabhängige Immunantworten, die sich anschließend in T-Helfer oder zytotoxische Zellen differenzieren. 3. Nach der Aktivierung durch DC können T-Lymphozyten effizient mit Makrophagen und B- Lymphozyten interagieren.
Der Wechsel von der Prozessierung des aufgenommenen Antigens und der Präsentation mit anschließender Aktivierung von naiven T-Lymphozyten wird allgemein als „Reifung“
bezeichnet. DC, die sich in fast alle Geweben befinden, weisen einen „unreifen“ Phänotyp auf, d.h. sie haben nur eine schwache stimulatorische Aktivität für T-Lymphozyten, die des weiteren mit einer niedrigeren oder abwesenden Expression von Oberflächenmolekülen wie MHC Klasse II, CD40, ICAM-1 oder B7-1 assoziiert ist. So ist MHC Klasse II bis zu 10 mal niedriger exprimiert. Nach Isolierung aus Geweben und Organen reifen sie jedoch in der Kultur schnell aus, was durch eine koordinierte Reihe von Veränderungen wie der Hochregulierung der MHC-Moleküle und kostimulatorischer Moleküle deutlich wird (STEINMAN u. BHARDWAJ, 1999). Der Prototyp der unreifen DC ist die Langerhanszelle in der Haut, die auch unter Zugabe von M-CSF nicht zu Makrophagen ausdifferenziert. In
vielen verschiedenen Kultursystemen sind die Stimuli untersucht worden, die zu einer Ausreifung der DC führen. So werden DC durch Entzündungsstimuli und infektiöse Agentien, wie z.B. LPS aus Bakterienwänden, aktiviert und produzieren Chemokine (MIP-1α, MIP-2, MCP-1, TNFα), die Makrophagen, NK-Zellen, Neutrophile Granulozyten und weitere unreife DC an den Ort der Entzündung locken. Danach erst durchlaufen sie ein induziertes Reifungsprogramm, in dem sie irreversible Veränderungen von der Antigenaufnahme (unreifer Phänotyp) über eine intermediäre Phase von 24-48h bis zur Auslösung von Immunantworten (reifer Phänotyp) durchlaufen (RESCIGNO et al., 1999). Verglichen mit anderen Leukozyten sind DC ungewöhnlich reich an Genprodukten des MHC Klasse II, das sich in intrazellulären endozytotischen Vakuolen, MHC II reiche Kompartimente (MIIC) genannt, befindet. Nach einem Stimulus erfolgt eine erhöhte Synthese der MHC Klasse II und die Fusion der Vesikel. Das Antigen wird an das MHC-Molekül gebunden und auf die Oberfläche der Zelle ausgeschleust, wobei die Halbwertszeit der Komplexe über 100h beträgt und sie so über mehrere Tage T-Lymphozyten stimulieren können. Der Wechsel der Kompartimentalisierung aus den MIIC an die Oberfläche erfolgt in 24h bis 48h nach den Antigenaufnahme (PIERRE et al., 1997). Die Gegenwart der MIIC erklärt, warum der unreife Phänotyp das Stadium in der Entwicklung der DC ist, in dem DC aktiv Proteine aufnehmen und zur Präsentation für T-Lymphozyten prozessieren. Diese endgültige Ausreifung der DC nach Stimulierung durch Entzündungsprodukte, virale und bakterielle Komponenten oder durch CD40Ligand wird als der Kontrollpunkt zur Einleitung von Immunantworten oder Toleranz angesehen (STEINMAN et al., 2000). Dabei werden kostimulatorische und Adhäsionsmoleküle wie B7-2, MHC II und CD40 bereits nach 1-2h hochreguliert, B7-1 und MHC I hingegen erst nach 4-6h initiiert und das Maximum nach 18h erreicht. Die Expression der Chemokinrezeptoren (u.a. CCR1, CCR5) wechselt von der Erkennung von Entzündungschemokinen (SLC, ELC) zu konstitutiv im Gewebe exprimierten Chemokinen.
Diesem Wechsel wird auch die erhöhte Wanderungsaktivität in lymphatische Gewebe zugeschrieben, wo sie in den T-Zellarealen zurückgehalten werden und sich auf die Suche nach Antigen-spezifischen T-Lymphozyten machen (RESCIGNO et al., 1999).
Wie es auch der Fall bei anderen Zellen von myeloider Abstammung ist, ist die Morphologie zur Identifizierung der DC nützlich. So weisen DC lange, blattähnliche Ausläufer, die auch
Lamellipodia oder „veiled“ genannt werden, auf, die in verschiedene Richtungen vom Zellkörper ausstrahlen. Im lebenden Zustand werden diese Ausläufer ständig neu geformt und aktiv bewegt. Diese ungerichteten Bewegungen sind bei anderen Leukozyten nicht zu beobachten. Obwohl diese Zelleigenschaften nicht so diagnostisch sind wie die gefärbten Granula von eosinophilen oder basophilen Granulozyten, so ist doch die Morphologie der DC ausreichend charakteristisch, um die Identifikation und Aufreinigung zu erlauben. In humanem Blut, afferenter Lymphe und Haut von Mäusen, Affen und Menschen, aber auch in den lymphatischen Organen von Mäusen, Ratten und Menschen sind DC untersucht worden.
Die einzigartige Morphologie der DC wurde dazu herangezogen, Methoden zur Gewinnung von großen Mengen von DC zu etablieren. Durch FACS-Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass neben zahlreichen anderen Molekülen vor allem MHC-Produkte auf der Oberfläche von DC exprimiert werden. Besonders MHC Klasse II ist überreichlich exprimiert.
Quantitative Bindungsstudien mit monoklonalen Antikörpern ergaben mehr als 106 Bindungsstellen pro Zelle (CELLA et al., 1997). Durch die Expression von MHC Klasse I, sowie MHC Klasse II präsentieren DC sowohl Antigene aus dem Zytosol der Zelle, wie auch aus endozytotischen Vesikeln (JANEWAY et al.,1999). DC exprimieren die meisten der bekannten akzessorischen oder kostimulatorischen Moleküle für T-Lymphozyten wie CD40, ICAM-1 (CD54), CD58, B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86). Diese Moleküle erklären die Effizienz, mit der DC T-Lymphozyten binden und stimulieren. Die Interaktion ist bidirektional in dem Sinne, dass die Bindung der T-Lymphozyten zu Veränderungen des T- Lymphozyten wie auch der DC führen. Dies ist besonders kennzeichnend für die Bindung von CD40. Nach Interaktion mit CD40L auf aktivierten T-Lymphozyten bleibt die Lebensfähigkeit der DC erhalten und sie produzieren große Mengen an IL-12 (HOWLAND et al., 2000;
KOCH et al., 1996; TAKASHIMA u. KITAJIMA, 1998). Spezifische Marker für andere Leukozyten fehlen auf DC wie CD14 für Makrophagen, CD16 für NK-Zellen, CD19 und CD20 für B-Lymphozyten. Zellspezifische Marker waren bislang aufgrund geringer verfügbarer Anzahl an DC nur sehr schwierig zu identifizieren. Für den Menschen werden 3 Antigene zur Identifizierung verwendet: S100b, p55 und CD83, die jedoch nicht zellspezifisch sind, da sie ebenfalls auf Zellen im Neuralgewebe exprimiert werden (STEINMAN u. BHARDWAJ, 1999).
Die Charakterisierung der DC macht die Separation von anderen Leukozyten, im besonderen aber von den Makrophagen notwendig. Diese Separation ist aufwendig, da DC in nur sehr geringer Anzahl vorkommen, wie z.B. im humanen Blut, in dem sich das Verhältnis von Monozyten zu DC auf 20-50:1 belaufen. Durch die Entwicklung von Kulturprotokollen ist es neuerlich möglich (CRAWFORD et al., 1999; TALMOR et al., 1998), größere Mengen von DC zu gewinnen und in der aktiven Immuntherapie gegen Tumorzellen oder virale Antigene einzusetzen (HIRAO et al., 2000; LUDEWIG et al., 1999a; MANICKASINGHAM u. REIS, 2000; SCHULER u. STEINMAN, 1997). So konnten aus CD34+ humanen Blutzellen und aus Monozyten durch die Zugabe von GM-CSF und Zytokinen Zellen mit DC-Charakter gewonnen werden (TALMOR et al., 1998).
DC sind in vivo in den meisten Geweben (z.B. Langerhanszellen in der Epidermis, in der afferenten Lymphe, in Herz, Nieren, IDC in den T-Zellarealen der lymphatischen Organe) vorhanden und können aus den verschiedenen Kompartimenten über die afferente Lymphe oder das Blut in die T-Zellareale der lymphatischen Organe einwandern. DC stellen jedoch keine einheitliche Gruppe von Zellen dar. So konnte gezeigt werden, dass DC aus mehreren verschiedenen Vorläuferzellen, aber auch verschiedene funktionelle Phänotypen von DC aus der gleichen Vorläuferzellen in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen gewonnen werden können (GRABBE et al., 2000). Auch im Blut, in der Milz (STEINMAN et al., 1997), den Lymphknoten (DE ST GROTH, 1998; SALOMON et al., 1998) und den Peyerschen Platten (ANJUERE et al., 1999; VREMEC u. SHORTMAN, 1997) sind verschiedene Subtypen von DC anwesend.
Die speziellen Fähigkeiten der DC scheinen nur in Relation zur Expression der Oberflächenmoleküle und zu ihrer Regulierung vor und während der Immunantworten zu stehen (BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998). Im Vergleich zu anderen Antigen- präsentierenden Zellen wie B-Lymphozyten oder Makrophagen werden MHC- Produkte und MHC- Peptid-Komplexe auf den DC 10-100mal höher exprimiert. Des weiteren synthetisieren DC hohe IL-12-Spiegel, die die angeborene wie erworbene Immunabwehr stimulieren (CELLA et al., 1996; KOCH et al., 1996; SOUSA et al., 1997). Durch Freisetzung von Chemokinen können sie T- und B-Lymphozyten anlocken und das Überleben der rezirkulierenden T-Lymphozyten sichern. DC befinden sich in der afferenten Lymphe, sind aber nicht in der efferenten Lymphe nachzuweisen (INGULLI et al., 1997). So sind DC 48h
nach enger Interaktion mit T-Lymphozyten nicht mehr nachzuweisen. DC erhalten während einer Antigen-spezifischen Interaktion mit T-Lymphozyten auch Signale durch die T- Lymphozyten, u.a. durch Bindung des Fas-L, das die Apoptose der DC vermittelt (MATSUE et al.,). Der aktive Zelltod der DC stellt einen Mechanismus zur Herunterregulierung einer Immunantwort dar, um eine ständige Aktivierung von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten zu vermeiden (VAN PARIJS u. ABBAS, 1998).
Auch die Einleitung und das Aufrechterhalten der peripheren Toleranz benötigt ein Absuchen der DC durch die T-Lymphozyten. Die Kontakte sind notwendig, um potentiell reaktive Klone zu deletieren oder die Anergie zu versetzen. So sind DC in der Lage, apoptotische Zellen aus dem Intestinaltrakt, die beim physiologischen Zelluntergang anfallen, von Tumoren, nach Transplantationen oder nach Virusinfektion aufzunehmen, über die afferente Lymphe in die Lymphknoten zu transportieren und dort den rezirkulierenden T-Lymphozyten zu präsentieren (ALBERT et al., 1998a; ALBERT et al., 1998b; HUANG et al., 2000). Diese Wanderung tritt auch in Abwesenheit von Antigen oder Entzündungen auf, wie in SPF-Tieren gezeigt werden konnte. Im Gegensatz zur Nekrose führt die Aufnahme der apoptotischen Zellen jedoch nicht zur Ausreifung der DC. Diese sind deshalb nur in geringem Ausmaß fähig, eine Immunantwort gegenüber dem Selbstantigen auszulösen (SAUTER et al., 2000; STEINMAN et al., 2000b).
Obwohl DC von großem Interesse für die Wissenschaft sind, ist der physikalische Kontakt in vivo in den lymphatischen Organen nicht weiter untersucht worden. Gerade bei klinischem Einsatz von DC bei neu entwickelten Impfschemata (DNS-Vakzinierung) oder in der Tumorbehandlung ist es von Interesse, Immunantworten über die Charakterisierung der Kontakte, das Wissen über die Funktion und die beteiligten Moleküle besser verstehen zu lernen und beeinflussen zu können. So ist nicht weiter bekannt, ob die Mikroumgebung wie die verschiedenen Kompartimente in den lymphatischen Organen die Interaktion beeinflusst, wie es für die Einwanderung über HEV in die lymphatischen Organe berichtet wurde. Auch der Einfluss der Oberflächenmoleküle auf die Interaktion von T-Lymphozyten und DC ist bislang nicht weiter untersucht worden. Es wurde in der vorliegenden Arbeit versucht zu klären, welcher Anteil der durch die lymphatischen Organe wandernden T-Lymphozyten Kontakte zu dendritischen Zellen ausbildet. Durch ein kongenes Rattenmodell konnten
injizierte Zellen auf Immunhistologien nachgewiesen werden und damit das Verhalten in vivo in den Kompartimenten aufgeklärt werden.
III. Material und Methoden
1. Geräte und Laborbedarf
Geräte
Autoklav Memmert, Schwabach
Coulter Counter Coulter Counter Electronics, England Durchlichtmikroskop Fa. Carl Zeiss Jena GmbH, Jena
Okular: Kpl W 12,5
Objektive: Zeiss 10x/ 0,22
Neofluar 25x/ 0,60
Zeiss 40x/ 0,65
IKA Schüttler, KS 501 D Fa. Janke u. Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen
konfokales Mikroskop Leica TCS, Benzheim Objektive: Plan Apo, Immersionsöl 40x/ 1,0
Plan Apo, Immersionsöl 100x/ 1,4 Filtersätze: N2.1 für TRITC, Cy3, Alexa 568
I3 für FITC, Cy2, Alexa 488
Kryostat, Typ 1720 Leitz, Wetzlar
pH-Meter, CG 840 Schott, Wiesbaden
Photomikroskop Zeiss, Oberkochem
+Mikroskopkamera MC 80DX Zeiss, Oberkochem
Pipetten, einstellbar Eppendorf, Fa. Hinz, Hamburg (100-1.000µl, 20-200µl, 10-100µl, 1-20µl)
Tischventilator FT-30 Salco, Bensheim Zentrifuge Universal 30 RF Hettich, Tuttlingen
Zytozentrifuge Typ Cytospin Shandon INC., Pittsbourgh, USA
Geräte für Zellkulturarbeiten
CO2-Brutschrank Heraeus, Hanau
Pinzette, gebogen, anatomisch Aesculap, Tuttlingen
Sterile Werkbank Mahl, Neuss
Drahtnetz (Porengröße 0,4mm) Forschungswerkstatt der Medizinischen Hochschule Hannover
Laborbedarf
Kulturflaschen , 260ml Greiner, Frickenhausen Objektträger, 76 x 25mm, geputzt Menzel, Braunschweig
Pipettenspitzen, gelb und blau Sarstedt, Nümbrecht
PAP-Pen (Wachsstift) science service
Blue caps, 50ml Falcon, Dänemark
Becton Dickinson, Heidelberg
2. Puffer, Medien und Materialien
PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung) Serva, Heidelberg TBS (Tris gepufferte Salzlösung) Serva, Heidelberg TTBS (TBS mit 0,05% Tween) Merck, Darmstadt
EDTA-Puffer (1mmol/l EDTA auf 1l Aqua dest., 0,372mg EDTA-Puffer, mit 1mol/l NaOH auf pH7,2 einstellen)
Antiklotting-Medium ( 0,9% NaCl + 2,5mmol/l EDTA
+ 5%BSA, auf pH7,2 einstellen)
Schwinzerlyse (8,3g NH4Cl + 0,1g EDTA + 1,0g KHCO3
auf 1l Aqua dest.)
in vitro Stimulation
Kulturmedium (KM):
RPMI 1640 Biochrom KG, Berlin
mit
4mmol/l Glutamin Biochrom KG, Berlin
15 µmol/l Hepes ICN flow, Eschwege
100 U/ml Penicillin + 100µmol/lStreptomycin Biochrom KG, Berlin 0,1 nmol/l beta-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt
Medium 199/ Hanks’ Biochrom KG, Berlin
fetales Kälberserum (FCS) Biochrom KG, Berlin 5’-Brom-2’-Desoxyuridin (BrdU) Sigma, Deisenhofen Trypanblau, 0.16% in NaCl Serva, Heidelberg
2% hitzeinaktiviertes Rattenserum in PBS
laboreigene Herstellung: gepooltes Blut von LEW (RT7a) und LEW.7B(BH) Ratten wurde für 30 Min bei RT stehen gelassen, anschließend für 30 Min bei 800xg (RT) zentrifugiert, der Überstand in Blue caps aufgenommen und erneut für 30 Min bei 800xg (RT) zentrifugiert. Das so erhaltene Serum wurde in 5ml Portionen für 30 Min bei 56°C in Wasser inaktiviert und anschließend bei -20°C bis zur Verwendung gelagert
Markierung der Mauszellen
2µmol/l 5-,6-carboxyfluorescein diacetat
succinimidyl ester (CSFE 557) in PBS Molecular probes, USA
DIG-NHS Boehringer Mannheim, Mannheim
(DIG-antibody labeling Kit Nr.1367200)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Immunhistologie PAP-Substrat
280mmol/l 3,3’-Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid
in 0,2% H2O2in TTBS Sigma, Deisenhofen
APAAP-Substrat
540µmol/l Naphthol-AS-MX-phospat Sigma N4875, Deisenhofen 2,5mmol/l Fast Blue oder 1mMol Fast Red Sigma, Deisenhofen
2% N,N-Dimethylformamid Fluka 40240, Buchs
1mmol/l Levamisol Sigma L 9756, Deisenhofen 0,1 mol/l Tris, pH 8,2
Fixierung:
Paraformaldehyd (PFA)
4%ig: 8g Paraformaldehyd auf 200ml PBS pH 7,2
Methanol, z.A. (6009) Merck, Darmstadt
Aceton, z.A. (14.2500) Merck, Darmstadt
Hämatoxylin Fluka, Buchs
Glycergel (Einschlußmittel C 563) Dako, Hamburg
Moviol (4-88) Hoechst AG, Frankfurt
3. Antikörper
Primäre Antikörper
Tabelle 1 zeigt Antikörper (Spalte 2), die in der vorliegenden Arbeit für die Charakterisierung in der Immunhistologie eingesetzt worden sind. Soweit nicht anders beschrieben, wurden monoklonale Antikörper aus der Maus eingesetzt. Die Antikörper wurden mit verschiedenen Konjugationen eingesetzt (Spalte 3). Des weiteren wird die Verdünnung, der Isotyp des Antikörpers und die Veröffentlichung angegeben, in der der Einsatz des Antikörpers beschrieben wurde.
Spezifität Antikörper/
Klon
Konjugat Isotyp Spezies Verdünnunga Referenz
Anti-TCR R73b IgG1 Ratte 1:2, 1:5 (HUNIG et al., 1989) Anti-CD28 JJ319 b IgG1 Ratte 1:2, 1:5 (TACKE et al., 1997) HIS 14 IgG1 Ratte 1:50 (KROESE et al., 1987) B-Lymphozyten
α-IgD Ratte 1:100
CD45RC c His 41 biotinyliert IgG1 Ratte 1:100 (KAMPINGA et al., 1990)
MHC Klasse II Ox 6 IgG1 Ratte 1:500 (FUKUMOTO et al., 1982)
ICAM-1 1A29 IgG1 Ratte 1:300
1:500 (konfokal)
(TAMATANI u.
MIYASAKA, 1990)
Ki-67 Antigen MIB5 biotinyliert IgG1 Ratte 1:5000 (SCHLUTER et al., 1993)
Interdigitierende dendritische Zellen
NLDC-145d IgG 2a Maus 1:50 (KRAAL et al., 1986) (BREEL et al., 1987)
Anti-Digoxigenin- AP
Alkalische Phosphatase
IgG Maus 1:150
Anti-Fluoreszin B13-DE-1 biotinyliert IgG1 Maus 1:5000 (RIGBY et al., 1977)
a Die Verdünnung erfolgte, soweit nicht anders aufgeführt, für die primären Antikörper in der Ratte in 0,9% NaCl + 5% Rattenserum, 1:2. In der Maus erfolgte die Verdünnung in PBS + 5% Mäuseserum, zu gleichen Teilen.
Die Verdünnung der biotinylierten Antikörper erfolgte in PBS und 20% Mäuseserum.
b Zur Stimulierung der T-Lymphozyten wurden die Zellkulturüberstände dieser Hybridome eingesetzt.
c Nachweis des RT7b Molekül nach Injektion von Zellen in kongene LEW (RT7a)
d Wird in der Literatur auch als Multilektin-Rezeptor DEC-205 bezeichnet.
Antikörper und sekundäre Nachweisreagenzien
Tabelle 2 zeigt die Antikörper und die sekundären Reagenzien, die in der vorliegenden Arbeit für den Nachweis gebundener Antikörper eingesetzt wurden. Soweit nicht anders beschrieben, wurden monoklonale Antikörper aus der Maus eingesetzt. Zusätzlich wird die Verdünnung, der Isotyp des Antikörpers und die Firma angegeben, die diesen Antikörper vertreibt.
Spezifität Antikörper Konjugat Isotyp Verdünnunga Firma/ Vertrieb Kaninchen-Ig Alexa 568
polyklonal (Ziege)
CyTM 5 IgG 1:100 Dianova, Hamburg
Hamster-Ig Alexa 488
polyklonal (Ziege)
CyTM 3 IgG 1:100 Dianova, Hamburg
Maus-Ig Z259, polyklonal (Kaninchen)
Ig-Fraktion 1:50 Dako, Hamburg
Maus-Ig D651 APAAP 1:50 (in TTBS) Dako, Hamburg Ratten-Ig Z494, polyklonal
(Kaninchen)
1:100 b Dako, Hamburg
Ratten-Ig D488 APAAP 1:100 b Dako, Hamburg
BrdU Peroxidase IgG1 1:100 Boehringer
Mannheim, Mannheim Alkalische Phosphatase-
Anti-Alkalische Phosphatase (APAAP)
1:50 Dako, Hamburg
Peroxidase-Anti- Peroxidase (PAP)
1:50 Dako, Hamburg
Streptavidin-Peroxidase (SAAP)
1:500 Dianova, Hamburg
a die Verdünnung erfolgte, wenn nicht anders angegeben, in PBS und 5% Rattenserum
b in TTBS + 5% Mäuseserum
4. Versuchstiere
Als Versuchstiere wurden kongene Lewis-Rattenstämme eingesetzt. Durch den Polymorphismus im Gen RT7 (Allele RT7a und RT7b) exprimieren LEWIS (RT7a) und LEW.7B(BH) Rattenstämme zwei unterschiedliche Varianten der Protein-Tyrosin- Phosphatase, Rezeptor Typ C (Ptprc, CD45) (WONIGEIT, 1979). Das Gen RT7 wurde auch als ART-1, RT-Ly-1, T200 oder Leucocyte common antigen (L-ca) bezeichnet. Dabei kann das RT7B-Molekül durch den monoklonalen Antikörper His41 nachgewiesen werden (KAMPINGA et al., 1990). Bei einer Transplantation oder einer Injektion von Zellen eines Stammes in den anderen findet keine Abstoßungsreaktion statt und Zellen lassen sich in einem in vivo Modell verfolgen. Die Ratten wurden unter spezifiziert pathogenfreien Bedingungen (SPF) im Tierlabor der medizinischen Fakultät der Universität Manchester (naive, memory T-Lymphozyten-Versuche) und im Tierhaus der Medizinischen Hochschule Hannover (Effektor T-Lymphozyten-Versuche) gezüchtet und gehalten. Die Ratten wurden in Gruppen bis zu drei Tieren in Makrolonkäfigen Typ III auf staubfreiem Weichholzgranulat gehalten. Die in den Kontrollversuchen zum Nachweis der DC eingesetzten C57BL/6 Mäuse wurden in Makrolonkäfigen Typ II gehalten. Die Raumtemperatur lag bei 22±2°C, die relative Luftfeuchtigkeit bei 55±5%, die Belichtung fand von 07.00 bis 19.00 Uhr MEZ statt. Die Tiere wurden mit einem pelletierten, autoklavierten Haltungsfutter für Ratten/Mäuse der Firma Altromin GmbH (Lage) [Inhaltsstoffe: Rohprotein 19,00%, Rohfett 4%, Rohfaser 6,00%, Rohasche 7,00%, Rohwasser 10% und N-freie Extraktstoffe 54%; Zusatzstoffe (je kg):
Vit. A 15.000 IE, Vit. D3 600 IE, Vit. E 75 mg, Kupfer 5 mg] gefüttert. Zur Wasserversorgung wurde steriles Leitungswasser aus Tränkeflaschen ad libitum bereitgestellt.
Die Tiere wurden regelmäßig jedes Quartal auf das Vorkommen von Erregern entsprechend der Liste GV-SOLAS (1986) untersucht.
Lymphozyten-Funktionsantigen-1-defiziente (LFA-1, αL/ β2, CD11a-/-/ CD18) Mäuse wie sie von BERLIN-RUFENACH et al. (1999) beschrieben wurden, wurden freundlicherweise von Frau Dr. N. Hogg, England, zur Verfügung gestellt. LFA-1-defiziente Mäuse wurden im Tierlabor des „Lymphocyte Molecular Biology Labratory“, London, gezüchtet und unter spezifisch pathogenfreien Konditionen in Übereinstimmung mit Regulationen des „United
